Introduction
I modelli di roditori sono stati usati per studiare numerose manifestazioni di malattia umana, tra cui le pielonefriti e le infezioni delle vie urinarie (UTI). Le UTI sono un problema di salute globale e possono influenzare i bambini, gli uomini e le donne di tutte le età. 1 , 2 , 3 La manifestazione iniziale di UTI comprende la cistite, e se l'infezione sale lungo l'uretere, può verificarsi un'infezione renale (pyelonephritis). Allo stesso tempo, la prevalenza del diabete sta avvicinando 400 milioni di persone in tutto il mondo. 4 , 5 È importante notare che l'incidenza di UTI può essere fino a 4 volte superiore nei pazienti obesi o in diabete mellito di tipo 2, con conseguente aumento del rischio di infezione urinaria ricorrente (rUTI), sepsi, fibrosi renale da pielonefritica e disfunzione della vescica. 6 , 7 , 8 RoditoreI modelli sono importanti nello studio degli UTI, in quanto le terapie antibiotiche attuali producono una risposta preventiva e sostenibile solo in un sottoinsieme di pazienti UTI. Per migliorare la cura clinica dell'UTI, i passaggi chiave sono quello di comprendere il meccanismo del rUTI e dei suoi processi patofisiologici da infezioni acute all'infiammazione alla fibrosi, così come l'impatto del diabete mellito di tipo 2.
L'obiettivo di migliorare i modelli animali è quello di sviluppare tecniche che consentano una valutazione più accurata della progressione della malattia e degli interventi terapeutici. Sono stati impiegati diversi approcci diversi per indurre la pielonefrite nei ratti e / o nei topi per studiare la fisiopatologia dei danni renali, l'effetto del trattamento antibiotico e altri aspetti del corso naturale delle UTI. Un approccio comune per stabilire l'UTI retrogrado è la cateterizzazione transuretrale. 10 , 11 , 12 , 13 </ Sup> Questo metodo introduce batteri attraverso l'uretra nella vescica urinaria degli animali anestetizzati. Mentre questa tecnica simula attentamente la pielonefrite umana, l'incidenza effettiva e la grandezza dell'infezione da pielonefrite possono essere molto variabili a causa di più fattori, tra cui una mancanza di reflusso uretrico spontaneo o di annullamento urinario durante o subito dopo inoculazione. 11 Di conseguenza, la variabilità sperimentale nell'indurre un'infezione pielonefrite ascendente può limitare l'utilità di questo modello per studiare le infezioni renali, nonché le strategie terapeutiche.
Questo rapporto descrive un modello di ratto chirurgico pielonefrite in cui E. coli viene iniettato direttamente nel rene del ratto. Nonostante questo modello di ratto sia invasivo, la quantità di E. coli consegnata al rene può essere efficacemente controllata che consente una forte infezione renale e infiammazione. 14 In questa procedura descriviamo ancheCome queste infezioni renali indotte possono essere monitorate in modo longitudinale con la risonanza magnetica in vivo (MRI).
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati istituzionali per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso la Case Western Reserve University. La durata della procedura chirurgica descritta di seguito è di circa 45-60 min. La procedura MRI stessa è di circa 15 minuti per ogni punto temporale.
1. Anestesia
- Anestetizzare il ratto nella camera isoflurana impostata al 2% di isoflurano mescolata all'ossigeno per facilitare la manipolazione e la ritenzione degli animali prima di somministrare anestesia iniettabile intraperitoneale.
- Dopo 3-5 minuti di esposizione all'isoflurano, verificare che l'animale sia anestetizzato e non presenta alcuna risposta al pizzico del piede.
- Ulteriore ratto sedativo con iniezione intraperitoneale di miscela di xilazina e ketamina: 75 mg / kg di ketamina / 10 mg / kg di xilazina. Durante l'esecuzione di iniezioni intraperitoneali, tirare indietro l'ago per assicurare che parti dell'intestino o altri organi vitali non siano stati forati.
- ioSomministrare 2 mg / kg di bupivacaina sottocutanea al sito di incisione per fornire sollievo al dolore topico.
2. Preparazione dell'area chirurgica
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici e le forniture prima di essere utilizzati per l'intervento chirurgico e posare sul panno chirurgico per la sterilità. La maggior parte degli strumenti e delle forniture possono essere autoclavate e riutilizzate.
- Utilizzare guanti sterili per tutte le procedure chirurgiche.
- Utilizzare un rasoio elettrico per rasare la pelliccia dal lato destro dell'animale. Rasare l'animale dalla parte inferiore della gabbia alla cima della gamba posteriore fornendo una grande zona senza capelli per l'incisione.
- Posizionare l'animale su un rilievo chirurgico sterile per isolare l'area disinfettata dalle aree circostanti.
- Scrub la pelle con un disinfettante come povidone iodio o betadina. Avviare lo scrubbaggio al centro del sito chirurgico e spostarsi all'esterno in modo circolare. Ripetere almeno tre volte con una nuova strofinata di povidone iodio o betadina. Scrub il sito chirurgico con tamponi alcolici al 70% fino a quando la pelle non è chiara, in quanto iodio può essere tossico se assorbito.
3. Procedura chirurgica
- Mantenere questa procedura in condizioni asettiche.
- Posizionare l'animale anestetizzato su un letto caldo riscaldante in posizione di decubito laterale sinistra con il lato destro rivolto verso l'alto.
NOTA: Si deve prestare attenzione a mantenere la temperatura corporea del corpo animale a 35-37 ° C per prevenire l'ipotermia. Questo letto di riscaldamento deve anche essere sterilizzato come necessario per mantenere le condizioni asettiche. - Sentitevi per la gabbia toracica e fate una piccola incisione retroperitoneale dorsale di 2-3 cm, usando una lama sterile di 10 scalpelli che inizia dalla parte inferiore della gabbia.
- Mettere la garza sterile longitudinalmente lungo entrambi i lati dell'incisione.
- Eliminare il tessuto sottocutaneo, il grasso e i muscoli per visualizzare e accedere alla cavità addominale. Utilizzare le forbici Mayo a lame curve per consentire una penetrazione più profondaRazione in ferita e tagliare i tessuti spessi.
- Una volta che il fegato è chiaramente visibile e accessibile, utilizzare pinze sbilanciate per ritirare il fegato verso l'alto.
- Utilizzando un'altra coppia di pinze sbarrate dall'altra mano, esporre il rene destro in modo che si trovi appena fuori dalla cavità addominale.
- Usa il dito del puntatore e il pollice della mano sinistra per tenere il rene in posizione. Con la mano destra, lentamente e in modo costante iniettare 0,1 ml di soluzione Uci89 E. coli (concentrazione tra 1 x 10 8 -1 x 10 9 ) da una siringa sterile nel bacino renale (che appare come una bolla bianca) 15 .
NOTA: Preparare il titolo batterico come descritto nel riferimento 15 . - Mettere una striscia di hemostat assorbibile sopra l'ago per impedire l'uscita di inoculo nel peritoneo. Tirare lentamente l'ago dalla vaschetta renale.
NOTA: Si dovrebbe prestare attenzione a non perforare o infettare i tessuti circostanti causando infezioni fuori bersaglioOns e / o complicazioni. - Usare una siringa più grande per risciacquare accuratamente il rene con una normale soluzione salina prima di riportarla nella cavità addominale.
4. Suture
Nota: La sutura che sarà sepolta nei tessuti deve essere 4-0 non sagomatura intrecciata assorbibile. Possono essere utilizzate delle suture assorbibili o di monofilamento per le superfici del corpo.
- Posizionare le suture in modo uniforme e più vicino al bordo del tessuto possibile per prevenire l'ostruzione del flusso sanguigno; In genere non è più di 0,3 cm dal bordo è necessario.
- Afferrare la pelle e aggiungerla leggermente usando una coppia di pinze a dentatura fine e ruotare il portautensile in una posizione pronata in preparazione per il piercing della pelle.
- Guidare l'ago attraverso lo spessore completo della pelle, sovrastando il polso per ruotare l'ago e passarlo attraverso la pelle.
- Ripetere questo processo per il bordo della pelle più vicino all'operatore che esegue la procedura.
- serrareLe suture abbastanza per opporsi ai bordi del tessuto. Qualsiasi più stretta ostacola l'approvvigionamento di sangue, la lenta guarigione delle ferite e può provocare la dehiscenza.
- Togliere la sutura usando nodi quadrati, come se fosse un semplice punto interrotto, tranne che solo il filo corto è tagliato, lasciando circa una coda di 3-4 mm.
- Dopo che il primo punto è stato legato, preparatevi a posizionare un secondo punto di circa 3 mm dalla prima e continuare la sutura in esecuzione.
- Una volta raggiunta la fine dell'incisione, non tirare completamente l'ultimo punto. Invece, utilizzare il loop che viene tenuto con il porta-ago come filo corto per tirare l'estremità distale della chiusura a sutura.
- Usando i legami dello strumento, legare la sutura usando i nodi quadrati. Ciò provoca 3 fili che si adattano dal nodo finale all'estremità distale.
5. Recupero degli animali
- Iniettare 2,1 mg / kg di Yohimbine intra-peritoneale dopo l'intervento chirurgico per invertire l'anestesia. UNSi prevede che i nomi si riprenderanno completamente dalla procedura chirurgica dopo 3-5 ore.
- Mantenere l'animale su un tappetino di riscaldamento (per evitare l'ipotermia) e biancheria morbida assorbente dopo l'intervento chirurgico.
- Fornire la reidratazione con i fluidi orali o parenterali finché non può tornare alla normale alimentazione (entro 24 ore). Iniettare circa 0,6 ml di soluzione salina normale peritonealmente immediatamente dopo l'intervento chirurgico per limitare gli effetti di disidratazione.
- Fornire analgesia come descritto nel protocollo Animal Care and Use, approvato dalla IACUC. Iniettare 5 mg / kg di carprofen sottocutanea per la gestione del dolore.
- Monitor incisioni regolarmente per gonfiore, esudazione, dolore o dehiscenza.
6. Convalida tramite la risonanza magnetica
- Eseguire esperimenti MRI in vivo su scanner MRI di piccole dimensioni in campo.
- Indurre l'anestesia con il 3% di isoflurano nell'ossigeno e posizionare l'animale con il rene destro nell'isocentro nello scanner MRI e appropriatoBere una radiofrequenza. Fornire animali con un'anestesia isoflurana 1-2% in modo continuo per tutta la procedura di imaging tramite un nosecone.
NOTA: Per le immagini MRI in vivo mostrate in Figura 1 è stata utilizzata una bobina di volume di dimensioni corporee (diametro interno = 72 mm). - Utilizzare un sistema di controllo e controllo degli animali per mantenere il tasso di respirazione di ciascun animale (40-60 respiri / min) e la temperatura corporea (35 ± 1 ° C).
- Utilizzare un'acquisizione MRI multi-fice multi-echo spin echo per ottenere immagini ad alta risoluzione, T2, ponderate assiali sia dei reni infetti che del controllo. I parametri di acquisizione MRI tipici sono il tempo di ripetizione = 5.000 msec, echo time = 40 msec, spessore della fetta = 2.0 mm, risoluzione spaziale in piano = 200 μm, 3 media di segnale e un tempo di acquisizione di 8 min.
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Representative Results
Le tecniche di imaging medico offrono l'opportunità di valutare non invasivamente l'UTI e l'efficacia terapeutica. Pertanto, la RM è stata utilizzata per convalidare l'induzione di infezione acuta dopo l'iniezione di 1-2 x 10 7 UTI89 E. coli e per visualizzare le alterazioni del rene prima e dopo l'intervento chirurgico. La figura 1a-b mostra una regione progressiva di infezione renale (frecce gialle). Le immagini MRI ottenute per ogni animale nei giorni 1 e 4 dopo l'infezione aiutano a caratterizzare la crescita dell'infezione acuta di pielonefriti.
Figura 1: Immagini MRI ponderate con T1 assiale da un modello roditore indotto da E. coli di pielonefriti a ( a ) Day 1 e ( b ) Day 4 post-infezione (frecce gialle).
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Discussion
La pielonefrite acuta ascendente nei roditori (ad es. Topi e ratti) può essere prodotta mediante cateterizzazione transuretrale. 16 , 17 , 18 Questo metodo di infezione transuretrale è vantaggioso in quanto non invasivo e imita la fisiopatologia umana dell'infezione ascendente. 17 , 18 , 19 , 20 Tuttavia, questo metodo può anche soffrire di tassi di infezione irregolari e di E. coli a dosaggio variabile al rene a causa di limitazioni fisiologiche come il vuoto e la variazione anatomica. 11 Fierer et al. (1971) riportarono 6 dei 40 ratti (15%) del ratto che mostravano prove di pielonefriti dopo l'infusione di E. coli nella vescica. 15 Inoltre, sono state richieste ripetute infusioni di E. coli più volte alla settimana per RELIProdurre abbastanza pielonefriti. 15 , 19
In questa relazione, descriviamo un modello alternativo di pielonefrite di roditore che introduce chirurgicamente E. coli direttamente nel bacino renale. Il vantaggio principale del modello chirurgico della tecnica pielonefrite include la somministrazione di una dose coerente di concentrazione di E. coli tra 1 x 10 8 - 1 x 10 9 così come l'iniezione dei batteri nello stesso sito anatomico (bacino renale destro) per ciascuna animale. 15 Questa iniezione diretta evita la necessità di riflusso fornire un'infezione più affidabile, nonché una determinazione più accurata della dose iniettata. Nel complesso, questo modello di pielonefrite chirurgica fornisce un'opzione alternativa per studi che richiedono un'infezione costante e riproducibile con un impatto minimo del reflusso uretrale.
Ottimizzare il successo di questa tecnica chirurgica includono:1) realizzare un'anestesia profonda per limitare il movimento respiratorio e per consentire un tempo di lavoro sufficiente; 2) rasatura dell'area di incisione chirurgica per impedire la contaminazione da aree non preparate; 3) sterilizzazione per prevenire l'introduzione della contaminazione; 4) l'iniezione attenta di una dose nota di E. coli nel bacino renale del ratto; 5) risciacquo salino completo del rene dopo iniezione; 6) ravvicinamento ravvicinato dei bordi della ferita tramite suture; E 7) monitoraggio delle complicanze intraoperatorie e postoperatorie quali ipotermia e effetti collaterali sistemici. Sebbene sia stato utilizzato un tappetino per migliorare il comfort degli animali, questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato utilizzando un sensore di temperatura rettale per mantenere la temperatura corporea. Un passo fondamentale nel raggiungere una chirurgia di sopravvivenza di successo è l'anestesia appropriata e il monitoraggio della respirazione animale. In caso contrario, si verificano tempi prolungati di chirurgia per stabilizzare il livello anestetico dell'animale e limitare lesioni indesiderate a causa di un eccessivomovimento. La sterilità compromessa della regione di lavoro e / o l'infezione involontaria del peritoneo con batteri E. coli sono anche comuni complicazioni associate al modello chirurgico. Pertanto, una preparazione adeguata per autoclave degli strumenti chirurgici, per sterilizzare l'intero spazio di lavoro, e gli sforzi procedurali per limitare ulteriori infezioni da E. coli contribuiscono a ridurre al minimo la mortalità animale, nonché i risultati errati dell'infezione.
Nonostante i vantaggi dell'iniezione diretta di E. coli nel rene, questo modello chirurgico della pielonefrite ha anche più limitazioni rispetto al metodo di consegna transuretrale. Il più grande inconveniente di utilizzare l'approccio di iniezione chirurgica diretta è l'invasività intrinseca della tecnica. Tuttavia, la mortalità è notevolmente bassa con l'implementazione di una corretta tecnica sterile e l'uso di un'adeguata gestione del dolore, la regolazione della temperatura tramite i tamponi riscaldanti e la morbida e assorbente biancheria post-chirurgica aGarantire una rapida ripresa. Inoltre, gli strumenti chirurgici autoclavabili per la sterilizzazione sono un metodo estremamente affidabile e conveniente per la sterilizzazione. L'impegno complessivo del tempo chirurgico è tipicamente inferiore a 1 h. Inoltre, la somministrazione di anestesia, così come la somministrazione locale e sistemica di farmaci per il dolore calibrati al peso corporeo, garantisce un'accurata distribuzione dei dosaggi e la sicurezza del soggetto. Un'altra limitazione potenziale nel modello chirurgico è che le tecniche chirurgiche sono più difficili nei topi a causa delle dimensioni anatomiche più piccole. In contrasto con il metodo transuretrale che può essere implementato in entrambi i ratti e i topi, il requisito di utilizzare modelli di ratto per il modello chirurgico aumenta il costo complessivo dello studio e può mettere vincoli sullo studio di varie alterazioni genetiche che possono essere più facilmente disponibili E conveniente nei modelli del mouse. Come detto sopra, un'altra limitazione significativa del metodo chirurgico è che non rappresenta la pielonefrite umana comeStrettamente come metodo transuretrale.
Qui abbiamo utilizzato tecniche MRI per monitorare le infezioni renali. Come mostrato in Figura 1 , la scansione MRI offre la possibilità di monitorare in modo non invasivo le infezioni renali nel tempo. Un approccio alternativo al monitoraggio delle infezioni da E. coli è attraverso l'etichettatura fluorescente dei batteri. 11 , 18 Tuttavia, l'imaging fluorescente è meno efficace in questo modello di ratti (a differenza dei modelli del mouse) a causa dell'assorbimento di luce da parte del tessuto con conseguente sensibilità di rilevamento notevolmente ridotta. Pertanto, la risonanza magnetica fornisce un mezzo più sensibile per monitorare le infezioni da E. coli alle prime fasi e fornire informazioni regionali sull'estensione dell'infezione in tre dimensioni.
I meccanismi della patofisiologia UTI / acuto pyelonephritis e la progressione alla fibrosi renale sono poco compresi. Gli agenti infettivi, il sottoLa risposta dell'ospite immunologica, e le reazioni infiammatorie svolgono un ruolo fondamentale, ma il significato di ciascuno è sconosciuto. Il miglioramento della consegna mirata di batteri al rene con questa procedura di iniezione diretta ha il potenziale per aumentare la riproducibilità di pielonefriti acute nei modelli roditori e forse per valutare più accuratamente gli interventi terapeutici di fase iniziale per il trattamento dell'IT. Questo metodo è stato inizialmente sviluppato come un approccio per ottimizzare la consegna di batteri al rene, ma ha anche applicazione per la consegna di altri reagenti e agenti patogeni. Questo metodo può analogamente offrire vantaggi agli studi di cistite, pielonefrite, UTI e malattie renali diabetiche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbing Pad | Fisher | 14-127-47 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisher | 22-415-469 | |
| Latex Surgical Gloves | Henry Schein Animal Health | 21540 | |
| Curved Mayo Scissors | Fisher | S17341 | |
| Straight Blunt Foreceps | Fisher | 08-895 | |
| Scalpel Handle | Fisher | 08-913-5 | |
| Sterile Scalpel Blades | Fisher | 53220 | |
| 1 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 309628 | For bacterial injections |
| 20 ml Luer-Lok Syringe | BD Biosciences | 301031 | For saline wash |
| Hemostat | Seneca Medical | 240267 | |
| 23 G 3/4 in. Needle | BD Biosciences | 305143 | |
| 30 G 1 in. Needle | BD Biosciences | 305128 | |
| U-100 Insulin Syringe | Exel International | 25846 | For medication injections |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 050033 | |
| Xylazine | Henry Schein Animal Health | 33197 | Inject IP |
| Ketamine | Patterson Vetrinary | 07-881-9413 | Inject IP |
| Yohimbine (Atipamezole) | Patterson Vetrinary | 07-867-7097 | Inject IP after surgery |
| Bupivacaine (Marcaine) | Patterson Vetrinary | 07-890-4584 | Inject SQ at site of incision |
| 4-0 Chromic Gut Suture | Ethicon Inc. | U203H | |
| 4-0 Braided Vicryl Suture | Ethicon Inc. | J304H | |
| 1 ml SubQ Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| E. coli UTI89 or CFT073 | ATCC | 700928 | |
| Surgicel Absorbable Hemostat | Ethicon Inc. | ETH1951CS | |
| Biospec 9.4T MRI | Bruker | 94/20 USR |
References
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