Abstract
ההתפתחות האחרונה של תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) הוכיחה כי תאי סומטיים בוגרים יכולים לחזור למצב מובחן, פלוריפוטנטיים. עכשיו, תכנות מחדש נעשה עם סוגים שונים של תאי סומטיים מבוגרים: קרטינוציטים, תאים שתן, פיברובלסטים, וכו ניסויים מוקדמים בדרך כלל נעשו עם פיברובלסטים עורי. עם זאת, זה נדרש הליך כירורגי פולשני להשיג פיברובלסטים מן המטופלים. לכן, תאי השעיה, כגון תאי דם ושתן, נחשבו אידיאליים עבור תכנות מחדש בגלל הנוחות של קבלת התאים הראשוניים. כאן אנו מדווחים פרוטוקול יעיל עבור הדור iPSC מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). על ידי ציפוי PBMCs transduced סדר צנטריפוגה באמצעות צלחת חדשה, מצופה-מטריקס, פרוטוקול זה יכול בקלות לספק מושבות iPSC. שיטה זו היא גם החלימה על תאי mononuclear דם חבל טבור (CBMCs). מחקר זה מציג prot פשוטה ויעילהocol עבור תכנות מחדש של PBMCs ו CBMCs.
Introduction
תאי גזע היו אחד החומרים הכי האטרקטיביים בטיפול קליני עבור 1 העשורים האחרונים. המאפיינים האטרקטיביים של תאי גזע הם pluripotency והיכולת עצמי לחדש. בשנת 1981, את תאי הגזע העובריים הראשון (ESCs) נותקו מן העובר העכבר 2. עם זאת, כאשר הטכניקה יושמה כדי עוברי אדם, היא נתקלה בכמה סוגיות אתיות.
בשנת 2006, כאשר ד"ר יאמאנאקה וצוותו לתכנות מחדש תא פלוריפוטנטיים הראשון מן תאי הסומטיים עכבר, בתחום תאי גזע שהעלה האפשרות שלה וריבית התעוררה מחדש 3. ידי אספקת מספר גורמים מוגדרים, תאי גזע פלוריפוטנטיים היו בהצלחה "מושרים" מן התאים הסומטיים מבוגרים, ובכך נקראו "תאי גזע מושרים (iPSCs)." בשנת 2007, טכניקה זו יושמה תאים אנושיים 4, מניב תאים עם המאפיינים המדויקים של ESCs אבל אף אחד הדיון האתי. באופן תיאורטי, שב"סCs ניתן להפיק מכל סוג תא המתקבל כל יחיד או מטופל. חולה ספציפי iPSCs עולה ככלי פוטנציאלי שיכול לדמות את פנוטיפים המחלה ותנאי אפיגנטיים של כל מטופל ומטופל. באמצעות עריכת גן או שיטות אחרות שיכול להפוך את המצב פתוגניים, iPSCs מטופל ספציפי יכול לשמש גם ברפואה אישית 5. יתר על כן, iPSCs הם פחות קשור דחייה חיסונית כי יש להם את אותה זהות חיסונית כמו התורם, קבלת השתלה אוטומטית ריאלית יותר 6. לכן, iPSCs הפך הפלטפורמה המבטיחה ביותר דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפולים רגנרטיבית. בהתחשב היתרונות הללו, פרוטוקולי שיפור שיכול לתת טהור ותשואות גבוהות יותר, בזמן הקצר ביותר ממקור התא הקטן הם כל זמן בפיתוח. שיקול מרכזי אחד למצוא את הפרוטוקול היעיל ביותר עבור יישום עתידי הוא סוג התא הראשוני. רוב פרוטו הדור iPSC מוקדםעמודות מותאמות עבור תאים חסידים מאז קווי iPSC המקוריים היו מושרה מן fibroblasts עור 4. עם זאת, בידוד והכנת תאים אלה הם עבודה אינטנסיבית. כמו כן, את הבידוד של פיברובלסטים עור כולל ניתוחים פולשניים שיכול להפוך חסרון גדול עבור יישום רחב יותר.
לכן, עבור המשך שימוש iPSCs, מקור תא עם רכישה נוחה נדרש. דם נחשב כמקור תא אידיאלי שכן הוא מתקבל באמצעות הליך די פולשנית 7-9. במחקר זה, פיתחנו שינוי פשוט לפרוטוקול יצירת hiPSCs מתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). בהעדר תהליך ההתרחבות הקשה של סוג תא מסוים, כגון CD34 + תאים, תאי דם מלאים או PBMCs היו מצופה סדרתי לצלחות מצופת מטריצה על ידי צנטריפוגה לאחר התמרתי עם וירוס סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה. שיטה זו הקטינה את הזמן הדרושמצורף של תאים צפים transduced וירידה בהפסד של תאים לתכנות מחדש כי לא היו מסוגלים לצרף בכוחות עצמם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: זה פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC12TISI0861).
1. ניתוק של תאי monocytic מדם
- בידוד של תאים monocytic (יום -5)
- להשיג לפחות 10 מ"ל של דם טרי מן בתיקו דם בתוך שפופרת הכנת התא (CPT).
- מעבירים את הדם אל צינור חרוטי 50 מ"ל חדשים לדלל אותו עם בופר פוספט סטרילית (PBS) ביחס של 1: יחס 4.
הערה: יחס גבוה יותר של דילול יכול לשמש טוהר גבוה. - הוסף 10 מ"ל של התקשורת שיפוע צפיפות צינור חרוטי 50 מ"ל חדש ובזהירות שכבת הדם מדולל על גבי מדיה שיפוע צפיפות. צנטריפוגה ב 750 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא הבלם צנטריפוגה.
- להעביר בזהירות את השכבה באפי צינור חרוטי 50 מ"ל חדש, להוסיף 30 מ"ל של PBS על הצינור, לשטוף את התאים.
- צנטריפוגה התאים ב 515 XG במשך 5 דקות ב RT. </ Li>
- בטל PBS ו resuspend התאים 0.5 מ"ל של התקשורת תא דם.
- ספירת תאי צלחת 1 x 10 6 תאים לכל גם צלחת 24 באר. להוסיף PBS על הבארות סביב על מנת למנוע אידוי.
- לייצב את התאים למשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 לפני התמרה. הוסף 0.5 מיליליטר נוסף של תקשורת תא דם הטריה בימים 3-4 מבלי להפריע את התאים.
2. התמרה על ידי Virus סנדאי
- תמרה (יום 0)
- אסוף ולהעביר את תאי הדם אל צינור חרוטי 15 מ"ל ולספור אותם באמצעות hemocytometer.
- כן 3 x 10 5 תאים לכל תמרת צנטריפוגות התאים ב 515 XG במשך 5 דקות ב RT.
- בטל supernatant ידי יניקה resuspend התאים 0.5 מ"ל של התקשורת תא דם.
- מעבירים את התאים גם צלחת 24 גם שאינו מצופה.
- להפשיר את תערובת הווירוס סנדאי בקרח ולהוסיף אותו אל suתאי spended. להוסיף וירוס סנדאי אל התאים בהתבסס על המלצות היצרן.
- חותם את הצלחת עם סרט איטום צנטריפוגות אותו 1,150 XG במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס.
- לאחר צנטריפוגה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך הלילה (O / N).
- תא העברה מטריקס מזין (יום 1)
- למחרת, מעיל צלחת 24 גם עם vitronectin. לדלל את פתרון vitronectin ב PBS ריכוז 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי. הוסף 1 מ"ל של vitronectin אל באר צלחת 24-היטב דגירה זה ב RT לפחות שעה 1. הסר את פתרון הציפוי לפני השימוש. ניתן לאחסן צלחות מצופות ב RT במשך 3 ימים.
- להעביר את כל התקשורת המכילה את התאים ואת הנגיף המצופה היטב.
- אוסף את התאים הנותרים עם 0.5 מיליליטר נוסף של תקשורת תא דם הטריה ולהוסיף אותו לתא המכיל גם.
- צנטריפוגה את הצלחת ב 1,150 XG במשך 10 דקות ב 35 מעלות צלזיוס.
- לאחר אגורהrifugation, להסיר את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של התקשורת iPSC, ולתחזק את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 O / N.
- תא העברה שנית (יום 2)
- מעיל הבארות של צלחת 24 באר חדשה עם 5 מיקרוגרם / מ"ל vitronectin, כמתואר בשלב 2.2.1. השתמש גם אחד של הצלחת לכל תמרה.
- מעבירים את ההשעיה תא מהצלחת הראשונה לצלחת vitronectin מצופה החדש.
הערה: אם אין צורך, תאי השעיה יכולים להיות מושלכים. ההליך הנזכר בשלב 2.3 ניתן לחזור 2-3 פעמים עם תאי ההשעיה. אם הצעדים יחזור על עצמו, לקצור את התאים. - בינתיים, להוסיף 1 מ"ל של התקשורת iPSC אל הבאר של הצלחת הראשונה, לצורך תחזוקה, דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 O / N.
- לשמור על התאים מחוברים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולבצע שינוי תקשורת יומי עם תקשורת iPSC טריה. מושבות תופענה בימים 14-21 לאחר תמרה.
- Centrifugדואר צלחת המצופה החדש המכילה את תאי השעיה על 1,150 XG ו -35 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 O / N.
- למחרת, להסיר את supernatant ולהחליפה תקשורת iPSC טריה.
הערה: ההליך הנזכר בשלב 2.3 ניתן לחזור 2-3 פעמים עם תאי ההשעיה. אם הצעדים יחזור על עצמו, למסוק את התאים supernatant וחזור על שלב 2.3. - לשמור על תאים המצורפים עם שינויי תקשורת מדי יום עד 80% confluency הוא הגיע.
3. תחזוקה ניידת לתכנות מחדש
- תחזוקה מוקדם לאחר בתרבות צלחת 24 גם
- 7-10 ימים לאחר התמרה, פעם התאים הם ומחובר, להכין מצופה-vitronectin, 60 מ"מ צלחת. לדלל פתרון vitronectin ב PBS ריכוז 5 מיקרוגרם / מיליליטר סופי. הוסף 1 מ"ל של vitronectin כדי בצלחת דגירה אותו ב RT לפחות שעה 1.
- שטפו אתתאים עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל של PBS / 1 mM EDTA כדי לנתק את התאים.
- דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 דקות.
- קציר התאים צנטריפוגות אותם ב 250 XG ו RT במשך 2 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 3 מיליליטר של תקשורת iPSC הטריה.
- פלייט כל התאים resuspended על צלחת 60 מ"מ מצופה החדש.
- הוסף 10 מעכב קינאז מ"מ RHO לתאי ולשמור אותם על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עד התאים הם 80% ומחוברות.
- פיצול עבור מראה מושבה (עריכת subcloning)
- כן מצופה vitronectin, 100 מ"מ צלחת, כמתואר בשלב 3.1.2.
- שוטפים את התאים עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל של EDTA מ"מ PBS / 1 עד לנתק את התאים.
- דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 2 דקות.
- קציר התאים צנטריפוגות אותם ב 250 XG ו RT במשך 2 דקות.
- ספירת התאים באמצעות hemocytometer ולהכין 1 x 10 4 תאים לכל צלחת.
- צנטריפוגה התאים ב 250 XG ו RT במשך 2 דקות.
- גלולה 1 x 10 4 תאים 6 מ"ל של התקשורת iPSC, צלחת אותם על צלחת 100 מ"מ מצופה, ולהוסיף 10 מעכב קינאז מ"מ RHO לתקשורת.
- דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 למשך שבוע עד מופיעות מושבות גדולות.
הערה: לשמור ולהרחיב את המושבות עבור subcloning. Subcloning נעשה בדרך כלל מתחת לגיל 5 קטעים.
- המושבה לקטוף באמצעות המושבה iPSC ניתוק פתרון
- שבוע לפני קטיף מושבה, זרעים 1 x 10 4 תאים מצופים vitronectin, 100 מ"מ צלחת, כאמור בשלב 3.2.7.
- כן מצופה vitronectin, 60 מ"מ צלחת על ידי הוספת 2 מיליליטר של תמיסת vitronectin ו דוגרים על RT במשך לפחות 1 שעה.
- על ידי התבוננות דרך מיקרוסקופ (40X או הגדלה 100X), לסמן מושבות עם גבולות ברורים באמצעות עט סימון. הסר את פתרון vitronectin מהצלחת החדשה שנעשתה בשלב 3.3.2 ולהוסיף 6 מיליליטרהתקשורת של iPSC בתוספת 10 קינאז מ"מ RHO.
- הסר בינוני תרבות מן התאים ולשטוף אותם עם 3 מ"ל של PBS.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק המושבה iPSC דגירה אותם למשך 30 שניות ב RT.
- הסר את הפתרון מהצלחת דגירה זה ב RT למשך 30 שניות נוספות.
- בעזרת פיפטה P200, לצייר 200 μl של תקשורת מהצלחת ולנתק את המושבות הממוקדות על ידי pipetting. מעביר את המושבות המפוזרות על צלחת 100 מ"מימ החדשים.
- דגירה ולתחזק את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2.
הערה: לאחר קבלת מושבת iPSC טהורה, תאים היו מתוחזקים עד שהגיעו מעבר 10. אפיון נעשה לאחר 10 קטעים לפחות. דילולים נוגדן ומידע פריימר מוצגים בלוחות 1 ו -2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה לתכנת מחדש PBMCs מבודד מדם. באמצעות השילוב של ציפוי צנטריפוגה סדר, iPSCs נוצר בהצלחה. באמצעות שיטה זו, iPSCs יכול להיווצר עם כמות קטנה של תאי דם שלם בלי בידוד או הרחבה של סוג תא מסוים. יצרנו iPSCs בהצלחה רק 1x10 4 תאים בצלחת תרבית תאים קטנה.
לפני תכנות מחדש, תאי דם בודדו באמצעות מדיה שיפוע צפיפות. תאי דם היו transduced 5 ימים לאחר בידוד. איור 1 א ממחיש את התוכנית של שיטת תכנות מחדש של תאים ההשעיה. לאחר בידוד, PBMCs היה transduced עם וירוס סנדאי המכיל גורמי יאמאנאקה בבאר הלא מצופה. למחרת, תאי ההשעיה נקצרו מצופים על צלחת מצופה vitronectin באמצעות צנטריפוגה, ואילו עו"ד התאיםכאבו אל הבאר שאינו מצופה שהושלכו. התאים המחוברים שהופיעו על צלחת vitronectin המצופה נשמרו והרחיבו עוד יותר. תאים מצורפים היו מתוחזקים עם שינויי תקשורת היומית באמצעות תקשורת iPSC. תהליך הציפוי עם צנטריפוגה חזר על עצמו עבור תאי השעיה הנותרות.
iPSCs לתכנות מחדש יכול להיות מכובד על ידי כמה ימי המורפולוגיה הייחודיים שלהם לאחר תמרה. עם זאת, במהלך תכנות מחדש, זה היה קשה להרחיב את התאים לתכנות מחדש בצורה טהורה. בשלב המוקדם של תכנות מחדש, את iPSCs היו מעורב עם תאים מובחנים שאינם לתכנות מחדש מצורפים (איור 2 א). החץ באיור 2 א מציג את סוגי תאי iPSC-כמו בתמונה. לפני ההרחבה, iPSCs ותאים אחרים היו קשים להפלות. לכן, מושבה טהורה הושגה רק על ידי תהליך קטיף המושבה. על ידי זריעת התאים בצפיפות נמוכה, מושבות שהיו large מספיק לקטיף התקבל, כפי שמוצג באיור 2B. לאחר לבודד את המושבה, גושי התא היו ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבית (איור 2 ג). מושבות iPSC טהורות נראו לאחר מכן (2D איור). לאחר iPSCs הטהור הורחב, איכות התאים נבדקת. תאים הוכתמו phosphatase אלקליין כדי לאשר את המדינה המובחנת של (איור 3 א) iPSCs. מושבות נגזרות iPSCs מבודד כל הראה מכתים חיובי. סמנים פלוריפוטנטיים אושרו על ידי מכתים immunofluorescence, שמוצג באיור 3 ב. התאים reprogrammed מאוד הביע סמנים pluripotent כגון SSEA4, Oct4, Sox2, TRA-1-81, KLF4, והכי חשוב, TRA-1-60. הביטוי של סמנים פלוריפוטנטיים אושר על ידי RT-PCR, שמוצג באיור 3C. Oct4 ו Sox2 אותרו, כמוצג נתוני הקרינה. סמנים נוספים כגון NANOG, DPPA5, TDGF1 היו positivאיליי מבוטאים היטב.
לניתוח נוסף, ניתוח קריוטיפ נעשה. כפי שניתן לראות בתרשים 4A, את iPSCs שנוצר הראה דפוס כרומוזומליות נורמלי. כדי לאשר pluripotency נכון, התאים היו מובחן לתוך האאקטודרם, המזודרם, ואת האנדודרם. IPSCs שנוצר הבדיל בהצלחה לכל שלוש שכבות הנבט, שניתן לראות באיור 4B. מאז וירוס סנדאי ידוע נכס האינטגרציה נטולה, הסרת DNA הנגיפי מוצגת באיור 4C. אחד מתוך שלושה תאים נטו יש DNA הנגיפי להישאר, גם לאחר קטעים מספר. עם זאת, הגן המשולב היה נשלף על ידי subcloning תהליכים.
לסיכום, הראינו פרוטוקול יצירת iPSCs מ PBMCs צף. הפרוטוקול הראה יעילות גבוהה נדרש רק כמות קטנה של דם. IPSCs שנוצר היה גבוה pluripotency ונמנע vi אינטגרציה RAL.
איור 1: תוכנית של פרוטוקול הדור iPSC מ PBMCs. תרשים מפורט של פרוטוקול שנועד בהתאם לסוג וציר זמן בינוני. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ברייט-שדה תמונה של iPSCs המופק PBMCs. (א) מורפולוגיה מוקדמת של תאים לתכנות מחדש. (ב) תמונה של מושבה לפני לקטוף. (ג) תאים לאחר תהליך טיהור קטיף המושבה. (ד) מורפולוגיה של מושבה טהורה. כל ברי הסולם עולים 200 מיקרומטר. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: pluripotency של iPSCs המופק PBMCs. (א) מושבות מוכתמות phosphatase אלקליין. (ב) תמונה פלואורסצנטי של iPSCs שנוצר. יחס דילול נוגדן מוצג בטבלה 1. (ג) ניתוח PCR של סמנים פלוריפוטנטיים. מידע פריימר מסופק בטבלה 2. כל ברי הסולם עולים 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להעלות / 54,650 / 54650fig4.jpg "/>
איור 4: ניתוח נוסף של iPSCs שנוצר. (א) רגילה karyogram של iPSC. (ב) תמונה פלואורסצנטי של תאים לאחר בידול שכבה תלת נבט. (C) PCR ניתוח של וקטורים ויראליים סנדאי. תאי-transduced ללא שימשו כביקורת שלילית, ותאי שנקטפו יום לאחר התמרה שימשו כביקורת חיובית. מידע פריימר מסופק בטבלה 2. כל ברי הסולם עולים 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שם נוגדן | ריכוז |
| SSEA4 | 1: 200 |
| Oct3 / 4 | 1: 100 |
| TRA-1-60 | 1: 200 |
| Sox2 | 1: 100 |
| TRA-1-81 | 1: 100 |
| Klf4 | 1: 250 |
| אלקסה פלואוריד 488 עז אנטי עכבר IgG (H + L) נוגדן | 1: 400 |
| אלקסה פלואוריד 594 IgG נגד ארנב עיזים (H + L) נוגדן | 1: 400 |
דילולים נוגדן לוח 1..
| שם יעד | כיוון | רצף פריימר | גודל |
| OCT3 / 4 | קָדִימָה | ACC CCT GGT GCC GTG AA | 190 |
| לַהֲפוֹך | GGC TGA ATA CCT TCC CAATA | ||
| Sox2 | קָדִימָה | CAG CGC ATG GAC AGT TAC | 321 |
| לַהֲפוֹך | GGA GTG GGA GGA AGA GGT | ||
| NANOG | קָדִימָה | ACT CCC CAA AAA GGC AAA | 270 |
| לַהֲפוֹך | GCT ATT CTT CGG CCA GTT | ||
| LIN28 | קָדִימָה | CAT GTC GTT CGG CTT CCT | 122 |
| לַהֲפוֹך | TCA CTG CCT CAC CCT CCT | ||
| DPPB5 | קָדִימָה | CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT | 215 |
| לַהֲפוֹך | AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC | ||
| TDGF1 | קָדִימָה | TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG | 140 |
| לַהֲפוֹך | GC AGA AATC TGA GGA AAG CA | ||
| sev | קָדִימָה | GGA TCA CTA GGT גת ATC GAG C | 181 |
| לַהֲפוֹך | ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC | ||
| KOS | קָדִימָה | GC ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC | 528 |
| לַהֲפוֹך | ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG | ||
| Klf4 | קָדִימָה | TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C | 410 |
| לַהֲפוֹך | AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA |
טבלה 2. מידע פריימר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאחר ותאי גזע עובריים (ESCs) הראו כמה חסרונות, את הצורך של כלי חלופי נדרש. לכן, הפיתוח של תאי גזע מושרים (iPSCs) על ידי יאמאנאקה בא תחת אור הזרקורים הבינלאומיים. זה כבר כמעט עשור מאז יאמאנאקה גילתה כי pluripotency יכול להיגרם על ידי הוספה רק ארבעה גנים לתוך תאי סומטיים מבוגרים. מאז iPSCs הוא "מושרה" מן התאים הסומטיים בוגרים, הם יכולים להתחמק סוגיות אתיות, שפעם הייתה החשש הנוגעים ESCs. בניגוד ESCs, iPSCs ניתן להפיק מכל אחד במחוז. לכן, הם יכולים לשמש במחקר רפואי אישית ומחקרים אחרים, כגון הקרנת סמים, דוגמנות המחלה, או רפואה רגנרטיבית.
IPSC האדם הראשון נוצר מתוך פיברובלסטים עורי בשנת 2007. קבוצות שונות בהצלחה לתכנות מחדש תאים מסוג זה, אלא הליך כירורגי פולשני נדרש להשיג התא הראשוני הזה. לכן, זה לא היה הרעיוןl מקור להפקה iPSCs מחלה שונה או בעיצוב רפואת רגנרטיבית. חלופה סוגי תאים להשיג בקלות היו נחוצים, כגון קרטינוציטים, מונוציטים שתן, ותאי דם. עם זאת, תאים אלו קשה להתרחב, וחלק מהם יש סיכוי גבוה יותר של זיהום 10.
במחקר זה, הצגנו פרוטוקול כי ניתן להפיק iPSCs בהצלחה מתאי הדם כולו כגון PBMCs. ללא כל תהליך הרחבת סוג תא מסוים, פרוטוקול זה מציע שיטה פשוטה יחסית כדי ליצור iPSCs, אפילו כמות קטנה של תאי דם ראשוניים. לאחר PBMCs בודד מהדם, התאים היו התייצבו בתקשורת תא דם במשך 5 ימים. צעד הייצוב לפני התמרה היה קריטי בפרוטוקול זה. יעילות תכנות מחדש הייתה טובה יותר לאחר דוגרי התאים בתקשורת תא דם. מדיה זו שימשה להרחבת תאים + CD34. עם זאת, כאשר תאי דם כולו נשמרו זה ליdia במשך 5 ימים, את המספר הסלולרי היה כמעט זהה עם הספירה הראשונה. שימוש בתאי דם מלאים, זה היה קשה כדי לאשר אם תאי CD34 + הורחבו. עם זאת, צעד הייצוב עוצמה נראה חשוב לתכנות מחדש מוצלח.
לאחר תמרה, אנו מצופים בתאים סדרנו לצלחת מצופה vitronectin ידי צנטריפוגה. במקור, תאי reprogrammed שקעו לקרקעית הבאר לאחר תמרה. על ידי הגדלת את התאים עם כוח מכני או צנטריפוגה, התאים transduced הצליחו לצרף מתרבים. עם זאת, מאז הפרוטוקול המשמש תאי דם כולו, מחצית הניסויים ניסו עם מדגמים שונים הביאה סוגים שונים של מורפולוגיות כאשר מורחבת. לכן, הבידוד של מושבות iPSC טהורות ידי לקטוף מושבה היה קריטי בפרוטוקול זה. התאים המורחבים מהמושבה המבודדת הראו את כל המאפיינים של iPSCs טהור.
למרות יתרונות אחרים, iPSCs ישמשוך כמה להתגבר. מאז מספר גורמים יאמאנאקה ידועים אונקוגנים, ישנם חששות כי iPSCs יכול להתפתח גידולים in vivo. לכן, חשוב כי התאים reprogrammed אין ביטוי גנים אקסוגניים הנותרים על ידי אינטגרציה. בשנים הראשונות לאחר פיתוח של iPSCs, וירוסים, כגון רטרווירוסים ו lentiviruses, שימשו תכנות מחדש. שיעור תכנות מחדש היה גבוה בהצלחה, עדיין וירוסים אלה נדרשים שילוב אקראי לתוך הגנום התא. מסיבה זו, מספר שיטות אחרות פותחו. וירוסים כמו וירוס סנדאי ידועים transduce התאים ללא שילוב, ושיטות אחרות באמצעות מולקולות קטנות, ובדרך וקטורים episomal פותחו גם כן. במחקר זה, השתמשנו וירוס סנדאי עבור תכנות מחדש. שיעור הקליטה היה נמוך יחסית lentiviruses. גם אנחנו אישר כי היו כמה מרכיבים נגיפיים שנותרו iPSCs שנוצר. אחד מתוך שלושה ניסויים הביאו integratיון, גם לאחר 15-20 קטעים. עם זאת, שילוב זה היה נשלף על ידי subcloning המושבות נגזרות תא בודד אחד. מניסיוננו, הצפיפות להשיג מושבה בריאה נגזרה מתא בודד הייתה 1x10 4 תאים לכל צלחת 100 מ"מימ. המושבות שכתוצאה ממנה צורה מעגלית מושלמת נקטפו והרחיב עבור PCR מחדש אישור של מרכיבים נגיפיים הנותרים. המושבות שמקורם בתאים שאינם משולבים נשמרו לשימוש נוסף. לאחר המחיקה, התאים נשמר המדינה שאינם משולבים.
במחקר זה, אנו מציעים פרוטוקול תכנות מחדש של תאי דם. הוספנו כמה צעדים, כגון ציפוי סדרתי צנטריפוגה, כדי להגדיל את שיעור תכנות מחדש של תאים צפים. שיטה זו נעשתה עם PBMCs ותאי mononuclear דם טבורים (CBMCs). פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי ליצור iPSCs הומוזיגוטי במתקני GMP בדרום קוריאה. הקבוצה שלנו מצפה האצה של תהליך תכנות מחדש iPSC באמצעותהפרוטוקול שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 ml Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
