Abstract
Die jüngste Entwicklung der menschlichen induzierten erwies sich pluripotente Stammzellen (hiPSCs), dass reife somatische Zellen zu einem undifferenzierten, pluripotenten Zustand zurückkehren kann. Nun Umprogrammierung ist mit verschiedenen Arten von adulten somatischen Zellen durchgeführt: Keratinozyten, Urin - Zellen, Fibroblasten usw. Frühe Experimente wurden in der Regel mit dermalen Fibroblasten durchgeführt. Jedoch benötigt dies eine invasive chirurgische Verfahren Fibroblasten von Patienten zu erhalten. Daher Suspensionszellen, wie Blut und Urin-Zellen wurden für eine Neuprogrammierung ideal angesehen wegen der Bequemlichkeit die primären Zellen zu erhalten. Hier berichten wir ein effizientes Protokoll zur iPSC Erzeugung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Durch Plattieren der transduzierten PBMCs seriell zu einer neuen, matrix-beschichtete Platte unter Verwendung von Zentrifugation kann dieses Protokoll leicht iPSC Kolonien bereitzustellen. Dieses Verfahren ist auch anwendbar auf Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMC). Diese Studie stellt eine einfache und effiziente ProtOcol für die Reprogrammierung von PBMCs und CBMC.
Introduction
Stammzellen haben in den letzten Jahrzehnten ein in der klinischen Therapie einer der attraktivsten Materialien gewesen. Die attraktiven Eigenschaften von Stammzellen sind pluripotent und die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. 1981 wurden die ersten embryonalen Stammzellen ( ES- Zellen) von der Maus - Embryo isoliert 2. Wenn jedoch die Technik, um menschliche Embryonen angewendet wurde, stand es mehreren ethische Fragen.
Im Jahr 2006, als Dr. Yamanaka und sein Team die erste pluripotenten Zelle aus der Maus somatischen Zellen umprogrammiert, wieder die Stammzellfeld seine Möglichkeit und Interesse wurde 3 neu entfacht. Durch die Bereitstellung von mehreren definierten Faktoren waren pluripotente Stammzellen erfolgreich "induziert" aus adulten somatischen Zellen und wurden so genannt "induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen)." Im Jahr 2007 wurde diese Technik auf menschliche Zellen angewendet 4 - Zellen mit den genauen Eigenschaften der WSR aber keiner der ethischen Diskussion ergibt. Theoretisch iPSCs kann aus jedem Individuum oder Patienten erhalten von jedem Zelltyp erzeugt werden. Patientenspezifische iPSCs als potentielles Werkzeug steigen, dass die Krankheit Phänotypen und epigenetische Bedingungen jedes einzelnen Patienten zu simulieren. Mit Gen - Bearbeitung oder andere Methoden , die können umkehren können die pathogenen Zustand, patientenspezifischen iPS auch 5 in der personalisierten Medizin verwendet werden. Außerdem sind iPSCs weniger mit Immunabstoßung verbunden , weil sie dieselbe Immunidentität als Donor haben, so dass die automatische Transplantation führbarer 6. Deshalb haben iPSCs die vielversprechendste Plattform in Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening werden und regenerative Therapien. In Anbetracht dieser Vorteile, verbesserte Protokolle, die reinere und höhere Erträge in der geringsten Menge an Zeit, von der kleinsten Zellquelle geben kann ständig in der Entwicklung. Ein wichtiger Aspekt der effizientesten Protokoll für die künftige Anwendung finden, ist die primäre Zelltyp. Die meisten der frühen iPSC Generation protocols für anhaftenden Zellen optimiert , da die ursprünglichen iPSC Linien von Fibroblasten der Haut 4 induziert wurden. Jedoch sind die Isolierung und Herstellung dieser Zellen arbeitsintensiv. Auch schließt die Isolierung von Haut-Fibroblasten-invasive chirurgische Verfahren, die ein großes Manko für eine breitere Anwendung werden kann.
Daher wird für die weitere Verwendung von iPS-Zellen wird eine Zellquelle mit bequemen Erwerb erforderlich. Blut wird als ideale Zellquelle angesehen , da es durch eine eher minimal - invasive Verfahren 7-9 erhalten wird. In dieser Studie haben wir eine einfache Modifikation des Protokolls hiPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Ohne die schwierige Expansionsprozesses eines bestimmten Zelltyp, wie beispielsweise CD34 + Zellen wurden Vollblutzellen oder PBMCs seriell überzogen auf einer Matrix beschichteten Platten durch Zentrifugation nach der Transduktion mit Sendai-Virus enthält, Yamanaka Faktoren. Dieses Verfahren reduziert die Zeit für die erforderlicheBefestigung von transduzierten schwebenden Zellen und verringert den Verlust von umprogrammiert Zellen, die auf ihren eigenen nicht in der Lage zu befestigen waren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde.
1. Isolierung von monozytären Zellen aus Blut
- Isolierung von Monozyten (Tag -5)
- Erhalten Sie mindestens 10 ml frisches Blut aus einer Blutabnahme in einer Zellpräparation Röhre (CPT).
- Übertragen, um das Blut zu einem neuen 50-ml konischen Röhrchen und verdünnte es mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einem 1: 4-Verhältnis.
HINWEIS: Ein höheres Verhältnis von Verdünnungs für höhere Reinheit verwendet werden. - 10 ml Dichtegradientenmedien auf eine neue 50-ml konischen Röhrchen und sorgfältig das verdünnte Blut auf der Oberseite der Dichtegradient Medienschicht. Zentrifuge bei 750 × g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Zentrifugieren Bremse.
- übertragen Sie vorsichtig die buffy Schicht auf ein neues 50-ml konischen Röhrchen, 30 ml PBS in das Röhrchen, und die Zellen zu waschen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 515 xg für 5 min bei RT. </ Li>
- Entsorgen Sie die PBS und Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml Blut Zellmedien.
- Zählen Sie die Zellen und die Platte 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well - Platte. Hinzufügen PBS zu den umgebenden Vertiefungen Verdampfung zu verhindern.
- Stabilisierung der Zellen für 5 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2 vor der Transduktion. Fügen Sie weitere 0,5 ml frisches Blut Zellmedien an den Tagen 3-4, ohne die Zellen zu stören.
2. Transduction von Sendai-Virus
- Transduction (Tag 0)
- Sammeln Sie und übertragen Sie die Blutzellen zu einer 15-ml konischen Röhrchen und zähle sie eine Zählkammer.
- Bereiten Sie 3 x 10 5 Zellen pro Übertragung und Zentrifugieren der Zellen bei 515 g für 5 min bei RT.
- Entsorgen Sie den Überstand durch Absaugen und Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml Blut Zellmedien.
- Übertragen, um die Zellen in eine Vertiefung einer nicht-beschichteten 24-Well-Platte.
- Auftauen Mischung Sendai-Virus in Eis und fügen Sie es dem suspended Zellen. In Sendai-Virus in den Zellen basiert auf den Empfehlungen des Herstellers.
- Verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie und Zentrifuge bei 1150 × g für 30 min bei 30 ° C.
- Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C 2 über Nacht in 5% CO (O / N).
- Zellübertragung auf Feeder-Matrix (Tag 1)
- Am nächsten Tag Mantel eine 24-Well-Platte mit Vitronectin. Verdünne die Vitronectin-Lösung in PBS für eine abschließende 5 ug / ml-Konzentration. 1 ml Vitronectin an eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und Inkubation es bei RT für mindestens 1 Stunde. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor dem Gebrauch. Beschichteten Platten können für 3 Tage RT gelagert werden.
- Übertragen alle Medien die Zellen und das Virus in die gut beschichtet enthält.
- Sammeln Sie die restlichen Zellen mit zusätzlichen 0,5 ml frisches Blut Zellmedien und fügen Sie ihn in die Zellen enthaltende gut.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.150 × g für 10 min bei 35 ° C.
- Nach Centrifugation, entfernen Sie den Überstand, 1 ml iPSC Medien und erhalten die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N.
- Zweite Zelltransfer (Tag 2)
- Bestreichen Sie die Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte mit 5 ug / ml Vitronectin, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Verwenden Sie eine Vertiefung der Platte für jede Übertragung.
- Übertragen Sie die Zellsuspension aus der ersten Platte in die neu beschichteten Vitronectin Platte.
HINWEIS: Wenn nicht benötigt, Suspensionszellen verworfen werden können. Das Verfahren in Schritt 2.3 erwähnt kann 2-3 mal mit den Suspensionszellen wiederholt werden. Wenn die Schritte wiederholt werden, ernten die Zellen. - Inzwischen 1 ml iPSC Medien zum Brunnen der ersten Platte, für die Wartung, und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N.
- Pflegen Sie die anhaftenden Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 und führen Sie eine tägliche Medienwechsel mit frischen iPSC Medien. Die Kolonien werden 14-21 nach Transduktion an den Tagen erscheinen.
- Centrifuge die neu beschichteten Platte, die Suspensionszellen bei 1.150 xg und 35 ° C für 10 min enthält.
- Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 O / N.
- Am nächsten Tag, entfernen Sie den Überstand und ersetzen Sie es mit frischen iPSC Medien.
HINWEIS: Das Verfahren erwähnt in Schritt 2.3 kann 2-3 mal mit den Suspensionszellen wiederholt werden. Wenn die Schritte wiederholt werden, Ernte der Zellen im Überstand und wiederholen Schritt 2.3. - Pflegen Sie die anhaftenden Zellen mit täglichen Medien Änderungen bis 80% Konfluenz erreicht ist.
3. Reprogrammierte Zelle Wartung
- Frühe Wartung nach der 24-Well-Platte Kultur
- 7-10 Tage nach Transduktion, sobald die Zellen konfluent sind, bereiten Sie einen Vitronectin-beschichtet, 60-mm-Schale. Verdünnte Vitronectin Lösung in PBS für eine abschließende 5 ug / ml-Konzentration. 1 ml Vitronectin an der Schale und inkubieren es bei RT für mindestens 1 Std.
- Wasch denZellen mit PBS und 1 ml PBS / 1 mM EDTA hinzu, die Zellen zu lösen.
- Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 min.
- Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge sie bei 250 xg und RT für 2 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 3 ml frischem iPSC Medien.
- Platte alle resuspendierten Zellen auf dem neu beschichteten 60-mm-Schale.
- Zugabe von 10 mM RHO - Kinase - Inhibitor zu den Zellen und halten sie bei 37 ° C in 5% CO 2 , bis die Zellen 80% konfluent sind.
- Split für Kolonie Aussehen (Subklonierung Vorbereitung)
- Bereiten Sie eine Vitronectin beschichtet, 100-mm-Schale, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben.
- Waschen der Zellen mit PBS und 1 ml PBS / 1 mM EDTA die Zellen zu lösen.
- Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 2 min.
- Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge sie bei 250 xg und RT für 2 min.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten 1 x 10 4 Zellen pro Schale.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 xg und RT für 2 min.
- Resuspendieren 1 x 10 4 Zellen in 6 ml iPSC Medien, plattieren sie auf die beschichtete 100-mm - Schale, und 10 mM RHO - Kinase in den Medien Inhibitor hinzuzufügen.
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 für eine Woche bis zu großen Kolonien erscheinen.
HINWEIS: Pflegen und die Kolonien für die Subklonierung erweitern. Subklonierung wird in der Regel in weniger als 5 Passagen durchgeführt.
- Colony Kommissionierung iPSC Kolonie unter Verwendung von Löse Lösung
- Eine Woche vor Kolonie Kommissionierung, Samen 1 x 10 4 Zellen in einer Vitronectin beschichtet, 100-mm - Schale, wie in Schritt 3.2.7 erwähnt.
- Vorbereiten eines Vitronektin beschichtet, 60-mm-Schale in 2 ml von Vitronectin Lösung zugegeben und bei RT Inkubation für mindestens 1 Std.
- Durch die Beobachtung durch ein Mikroskop (40-fache oder 100-facher Vergrößerung), markieren Kolonien mit klaren Grenzen einen Markierungsstift. Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung aus der neuen Platte gemacht in Schritt 3.3.2 und 6 mlMedien mit 10 mM RHO-Kinase ergänzt von iPS.
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen und waschen Sie sie mit 3 ml PBS.
- 1 ml der iPSC Kolonie Ablösen Lösung und inkubieren für 30 s bei RT.
- Entfernen Sie die Lösung von der Platte und Inkubation es bei RT für weitere 30 sec.
- Mit Hilfe einer Pipette P200, ziehen 200 ul Medium von der Platte und lösen die gezielte Kolonien durch Pipettieren. Übertragen Sie die verstreuten Kolonien auf den neuen 100-mm-Schale.
- Inkubieren und die Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 erhalten.
Hinweis: Nach einem reinen iPSC Kolonie zu erhalten, wurden die Zellen gehalten, bis sie Passage 10. Charakterisierung erreicht wurde nach mindestens 10 Passagen getan. Antikörperverdünnungen und Primer Informationen sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode PBMCs aus dem Blut isoliert neu zu programmieren. Mit der Kombination von seriellen Plattierung und Zentrifugation wurden iPSCs erfolgreich generiert. Mit dieser Methode konnte iPSCs mit einer geringen Menge an Vollblutzellen erzeugt werden ohne Isolierung oder einen bestimmten Zelltyp zu erweitern. Wir erzielten erfolgreich iPSCs von nur 1x10 4 Zellen in einer kleinen Zellkulturplatte.
Vor Reprogrammierung wurden Blutzellen unter Verwendung von Dichtegradientenmedien isoliert. Die Blutzellen wurden 5 Tage nach der Isolierung transduziert. 1A veranschaulicht das Schema der Umprogrammierung Verfahren für die Suspensionszellen. in einem nicht-beschichtete Vertiefung nach der Isolierung wurden die PBMCs mit Virus enthält Faktoren Yamanaka Sendai transduziert. Am nächsten Tag wurden die Suspensionszellen geerntet und plattiert auf eine Vitronectin beschichteten Platte Zentrifugation, während die Zellen attwurden schmerzten auf die nicht beschichtete Vertiefung verworfen. Die anhaftenden Zellen, die auf der Vitronectin beschichteten Platte erschienen, wurden beibehalten und weiter ausgebaut. Befestigt wurden die Zellen mit täglichen Medienwechsel mit iPSC Medien erhalten. Das Beschichtungsverfahren mit der Zentrifugation wurde für die restlichen Suspensionszellen wiederholt.
Reprogrammierte iPSCs konnte durch ihre unterschiedlichen Morphologie mehrere Tage nach der Transduktion zu unterscheiden. Doch während der Reprogrammierung, war es schwer, die umprogrammiert Zellen in reiner Form zu erweitern. In der frühen Stufe der Reprogrammierung waren die iPSCs gemischt mit angebrachtem nicht umprogrammiert differenzierten Zellen (2A). Der Pfeil in Abbildung 2A zeigt die iPSC artigen Zelltypen in dem Bild. Vor dem Ausbau waren die iPS-Zellen und anderen Zellen schwer zu unterscheiden. Daher wurde eine reine Kolonie nur durch die Kolonie Kommissionierung erhalten. Indem die Zellen in einer geringen Dichte Säen, Kolonien, die L wurdenarge genug zum Aufnehmen wurden erhalten, wie in 2B gezeigt. Nachdem die Kolonie zu isolieren, wurden die Zellklumpen in einzelne Zellen und kultivierten (2C) dissoziiert. Reine iPSC Kolonien wurden danach (2D) zu sehen. Nachdem die reine iPS-Zellen erweitert wurden, wurde die Qualität der Zellen getestet. Zellen wurden mit alkalischer Phosphatase gefärbt , um die undifferenzierten Zustand des iPSCs (3A) zu bestätigen. Kolonien, die aus isolierten iPSCs alle abgeleiteten zeigte eine positive Färbung. Pluripotenten Marker wurden durch Immunfluoreszenzfärbung, gezeigt in 3B bestätigt. Die umprogrammiert Zellen hoch pluripotenten Marker ausgedrückt wie SSEA4, OCT4, SOX2, TRA-1-81, KLF4, und, was am wichtigsten ist, TRA-1-60. Die Expression von pluripotenten Marker wurde durch RT-PCR bestätigt, in 3C gezeigt. OCT4 und SOX2 wurden nachgewiesen, wie es in den Fluoreszenzdaten gezeigt. Zusätzliche Marker wie NANOG, DPPA5, TDGF1 waren positively ausgedrückt als gut.
Zur weiteren Analyse wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt. Wie in 4A gezeigt ist , zeigten die erzeugten iPSCs eine normale chromosomale Muster. Um wahre Pluripotenz zu bestätigen, wurden die Zellen differenziert in Ektoderm, Mesoderm und Endoderm. Die erzeugten iPS - Zellen differenziert erfolgreich in alle drei Keimblätter, in 4B zu sehen. Da Sendai - Virus für seine Integration freie Eigenschaft bekannt ist, wird die Entfernung von viraler DNA in 4C gezeigt. Einer von drei Zellen neigten virale DNA zu haben, bleiben auch nach mehreren Passagen. Jedoch war die integrierte Gen entfernbar durch Prozesse Subklonierung.
Zusammenfassend haben wir ein Protokoll zu erzeugen iPSCs Aufschwimmen PBMCs gezeigt. Das Protokoll zeigte eine hohe Effizienz und benötigt nur eine geringe Menge Blut. Die erzeugten iPS-Zellen hatten hohe Pluripotenz und vermieden vi ral Integration.
Abbildung 1: Schema des iPSC Generation Protokoll von PBMCs. Ein detailliertes Diagramm der entworfenen Protokoll basierend auf dem Medientyp und Zeitleiste. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Hellfeld - Bild von iPS - Zellen aus PBMCs erzeugt. (A) Frühe Morphologie von Zellen umprogrammiert. (B) Bild einer Kolonie vor Kommissionierung. (C) Zellen nach der Kolonie Kommissionierung Reinigungsprozess. (D) Morphologie einer reinen Kolonie. Alle Maßstabsbalken zeigen an 200 & mgr; m. /ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54650/54650fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Pluripotenz von iPS - Zellen aus PBMCs erzeugt. (A) Kolonien mit alkalischer Phosphatase gefärbt. (B) Fluoreszenzbild der erzeugten iPS - Zellen. Die Antikörperverdünnungsverhältnis wird in Tabelle 1 gezeigt. (C) PCR - Analyse von pluripotenten Marker. Primer Informationen werden in Tabelle 2 bereitgestellt. Alle Maßstabsbalken zeigen an 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
laden / 54650 / 54650fig4.jpg "/>
Figur 4: Eine weitere Analyse der erzeugten iPSCs. (A) Normale Karyogramm der iPSC. (B) Fluoreszenzbild der Zellen nach drei Keimschicht Differenzierung. (C) PCR - Analyse von Sendai virale Vektoren. Nicht-transduzierte Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet, und die Zellen einen Tag geerntet nach Transduktion als positive Kontrolle verwendet wurden. Primer Informationen werden in Tabelle 2 bereitgestellt. Alle Maßstabsbalken zeigen an 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Antikörper - Name | Konzentration |
| SSEA4 | 1: 200 |
| Oct3 / 4 | 1: 100 |
| TRA-1-60 | 1: 200 |
| Sox2 | 1: 100 |
| TRA-1-81 | 1: 100 |
| Klf4 | 1: 250 |
| Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Maus-IgG (H + L) -Antikörper | 1: 400 |
| Alexa Fluor 594 Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) -Antikörper | 1: 400 |
Tabelle 1. Antikörper - Verdünnungen.
| Zielname | Richtung | Primer - Sequenz | Größe |
| OCT3 / 4 | Vorwärts | ACC CCT GGT GCC GTG AA | 190 |
| Umkehren | GGC TGA ATA CCT TCC CAEin ATA | ||
| SOX2 | Vorwärts | CAG CGC ATG GAC AGT TAC | 321 |
| Umkehren | GGA GTG GGA GGA AGA GGT | ||
| NANOG | Vorwärts | AAA GGC AAA CAA CCC ACT | 270 |
| Umkehren | GCT ATT CTT CGG CCA GTT | ||
| Lin28 | Vorwärts | GTT CGG CTT CCT GTC CAT | 122 |
| Umkehren | CTG CCT CAC CCT CCT TCA | ||
| DPPB5 | Vorwärts | CGG CTG CTG AAA GCC ATT TT | 215 |
| Umkehren | AGT TTG AGC ATC CCT CGC TC | ||
| TDGF1 | Vorwärts | TCC TTC TAC GGA CGG AAC TG | 140 |
| Umkehren | AGA AAT GCC TGA GGA AAG CA | ||
| SeV | Vorwärts | GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C | 181 |
| Umkehren | ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC | ||
| KOS | Vorwärts | ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC | 528 |
| Umkehren | ACC TTG ACA ATC CTG ATG TGG | ||
| Klf4 | Vorwärts | TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C | 410 |
| Umkehren | AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA |
Tabelle 2. Primer Informationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Da embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mehrere Mängel zeigte, wurde die Notwendigkeit eines alternativen Werkzeug erforderlich. Daher kam die Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka im Rahmen des internationalen Rampenlicht. Es ist schon seit fast einem Jahrzehnt Yamanaka entdeckt, dass Pluripotenz, indem nur vier Gene in adulten somatischen Zellen induziert werden kann. Da iPSCs "induziert" von reifen somatischen Zellen sind, können sie ethische Fragen ausweichen, die einst die Sorge gewesen war, zu WSR im Zusammenhang. Im Gegensatz zu WSR kann iPSCs von jedem einzelnen erzeugt werden. Daher können sie in der personalisierten medizinischen Forschung und anderen Studien, wie zum Beispiel Drogen-Screening, Krankheitsmodelle oder regenerative Medizin verwendet werden.
Die erste menschliche iPS wurde aus dermalen Fibroblasten erzeugt im Jahr 2007. Verschiedene Gruppen erfolgreich diesen Zelltyp neu programmiert, sondern eine invasive chirurgische Verfahren wurde diese primäre Zelle zu erhalten benötigt. Daher war es nicht die Ideel Quelle für verschiedene Krankheits iPSCs oder der Gestaltung der regenerativen Medizin zu erzeugen. Eine alternative und leicht erhalten Zelltypen wurden benötigt, wie Keratinozyten, Urin Monozyten und Blutzellen. Jedoch sind diese Zellen schwer zu erweitern, und einige von ihnen haben eine höhere Wahrscheinlichkeit der Kontamination 10.
In dieser Studie zeigten wir ein Protokoll, das iPSCs aus Vollblutzellen wie erfolgreich PBMCs erzeugen kann. Ohne Expansionsprozess eines bestimmten Zelltyps, schlägt dieses Protokoll ein relativ einfaches Verfahren iPSCs zu erzeugen, auch aus einer geringen Menge an Primärblutzellen. Sobald die PBMCs aus dem Blut isoliert wurden, wurden die Zellen für 5 Tage in Blutzellmedien stabilisiert. Der Stabilisierungsschritt vor Transduktion war kritisch bei diesem Protokoll. Die Umprogrammierung Effizienz war besser, nachdem die Zellen in Blutzellen Medien inkubiert. Dieses Medium wurde für die Expansion von CD34 + Zellen verwendet. Wenn jedoch Vollblutzellen wurden in dieser me beibehaltendia für 5 Tagen wurde die Zellzahl nahezu identisch mit dem ersten Zählwert. Mit Vollblutzellen, es war schwer zu bestätigen, ob die CD34 + Zellen erweitert worden war. Dennoch schien das Stabilisierungsschritt selbst für eine erfolgreiche Anpassung wichtig.
Nach Transduktion überzogen wir seriell die Zellen auf eine Vitronectin beschichteten Platte durch Zentrifugation. Ursprünglich sank die umprogrammiert Zellen an den Boden der Vertiefung nach Transduktion. Durch die Steigerung der Zellen mit mechanischer Kraft oder Zentrifugation wurden die transduzierten Zellen in der Lage zu befestigen und zu vermehren. Da jedoch das Protokoll Vollblutzellen verwendet wird, die Hälfte der versuchten Versuche mit verschiedenen Proben resultierten in verschiedenen Arten von Morphologien, wenn erweitert. Daher Isolierung reiner iPSC Kolonien durch Kolonie Kommissionierung war kritisch in diesem Protokoll. Die Zellen aus der isolierten Kolonie erweitert zeigte alle Eigenschaften eines reinen iPSCs.
Trotz anderer Vorteile, iPS-Zellen habeneinige Hürden zu überwinden. Da mehrere Yamanaka Faktoren Onkogene bekannt sind, gibt es Bedenken , dass iPS - Zellen in Tumoren in vivo zu entwickeln. Daher ist es wichtig, dass die umprogrammiert Zellen durch Integration keine verbleibenden exogenen Genexpression. In den ersten Jahren nach der Entwicklung von iPSCs, Viren, wie Retroviren, Lentiviren und wurden für eine Neuprogrammierung verwendet. Die Umprogrammierung Rate war erfolgreich hoch, doch sind diese Viren zufällige Integration in das Zellgenom erforderlich. Aus diesem Grund wurden verschiedene andere Verfahren entwickelt worden. Viren wie Sendai-Virus sind bekannt, die Zellen ohne Integration zu transduzieren, und andere Verfahren unter Verwendung von kleinen Molekülen und episomale Vektoren sind auch entwickelt worden. In dieser Studie verwendeten wir Sendai Virus für die Umprogrammierung. Die Integrationsrate relativ niedrig im Vergleich zu Lentiviren. Wir bestätigten auch, dass es in den erzeugten iPSCs einige verbleibende virale Komponenten wurden. Einer von drei Studien führten zu integratIonen, auch nach 15-20 Passagen. Jedoch war diese Integration entfernbar durch die Kolonien Subklonierung aus einer einzelnen Zelle abgeleitet sind. Nach unserer Erfahrung eine gesunde Kolonie die Dichte von einer einzigen Zelle betrug 1x10 4 Zellen pro 100-mm - Schale abgeleitet zu erhalten. Die Kolonien, die in einer perfekten Kreisform geführt wurden für die PCR-Wieder Bestätigung der verbleibenden viralen Komponenten aufgenommen und erweitert. Die Kolonien, die von nicht-integrierten Zellen wurden zur weiteren Verwendung gehalten. Nach dem Löschen behielten die Zellen, die den nicht-integrierten Zustand.
In dieser Studie schlagen wir ein Protokoll für die Blutzellen Neuprogrammierung. Wir haben mehrere Schritte, wie beispielsweise serielle Plattierung und Zentrifugation, die Neuprogrammierung Rate der schwimmenden Zellen zu steigern. Dieses Verfahren wurde mit PBMCs und Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMC) durchgeführt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um homozygote iPSCs in GMP-Anlagen in Südkorea erzeugen. Unsere Gruppe freut sich auf die Beschleunigung des iPSC Umprogrammierung mitunser Protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 ml Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 ml Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 ml Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 ml Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| 24-well Plate | TPP | 92024 | |
| PBMC Isolation Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| StemSpan | STEMCELL Technologies | 9805 | Blood cell media |
| CC110 | STEMCELL Technologies | 8697 | Blood cell media supplement (100x) |
| iPSC Generation and Culture Materials | |||
| CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A16518 | |
| TeSR-E8 Media | STEMCELL Technologies | 5940 | iPSC media |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TrypLE express (TrypLE) | Life Technologies | 12604-039 | |
| ReleSR | STEMCELL Technologies | 12604-039 | Colony detaching solution |
| Quality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Rinse Buffer |
| Sodium Chloride | Duchefa Biochemie | S0520.1000 | Rinse Buffer |
| Tween-20 | BIOSESANG | T1027 | Rinse Buffer |
| Hydrochloric Acid | Duksan | 1129 | Rinse Buffer |
References
- Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30 (6), 350-359 (2012).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Chun, Y. S., Byun, K., Lee, B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat Cell Biol. 44 (4), 245-255 (2011).
- Seki, T., Fukuda, K. Methods of induced pluripotent stem cells for clinical application. World J Stem Cells. 7 (1), 116-125 (2015).
- Churko, J. M., Burridge, P. W., Wu, J. C. Generation of human iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells using non-integrative Sendai virus in chemically defined conditions. Methods Mol Biol. 1036, 81-88 (2013).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Ohmine, S., et al. Induced pluripotent stem cells from GMP-grade hematopoietic progenitor cells and mononuclear myeloid cells. Stem Cell Res Ther. 2 (6), (2011).
- Mae, S., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nat Commun. 4, 1367 (2013).
