Summary
这里，我们描述一个基于活动的探针的制备和使用（ARN14686，十一碳-10- ynyl- -N - [（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸），允许的检测和定量促炎酶ñ-acylethanolamine酸酰胺酶的活性形式（NAAA）， 在体外和离体 。
Abstract
基于活动的蛋白谱（ABPP）是用于通过使用靶向酶的活性位点的化学探针的识别在复杂蛋白质组感兴趣的酶的方法。导入探针A记者标记允许通过在凝胶荧光扫描，蛋白质印迹，荧光显微镜，或液相色谱 - 质谱法检测标记的酶。这里，我们描述了制备和使用所述化合物ARN14686的，基于活动点击化学探针（CC-ABP），其选择性识别酶Ñ-acylethanolamine酸酰胺酶（NAAA）。 NAAA是半胱氨酸水解酶，通过去激活内源性过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-α激动剂如十六酰胺乙醇（PEA）和油酰乙醇酰胺（OEA）促进炎症。 NAAA被合成为一个无效的全长酶原，由autoproteolysis在溶酶体的酸性pH激活。定位研究ħ表明NAAA在巨噬细胞等单核细胞衍生的细胞在B淋巴细胞中表达，以及AVE。我们提供的ARN14686如何能够被用来检测和通过蛋白质印迹和荧光显微镜量化活性NAAA 离体啮齿动物组织的例子。
Introduction
常用的方法来研究的表达模式，交互和蛋白质的功能，包括用于鸟枪分析1,2，酵母液相色谱-质谱平台双杂交方法3,4和体外测定法，是有限的，因为它们是无法评估在其天然状态的蛋白质的活性。基于活动的蛋白谱（ABPP）可以用来填补这一空白。在这种方法中，小分子探针能够共价结合到所关注的酶的活性位点被偶联至一个报告基团，其允许目标检测。使用点击化学（CC），记者可以集成到探针或之后发生5,6-靶接合可以引入。后者程序需要使用含有适当的化学基团，探针如末端炔或叠氮化物，其可以与许多记者试剂经由SUC生物正交反应改性H作为铜（Ⅰ）催化胡伊斯根[3 + 2]环加成7-9或Staudinger连接10,11。
最近，我们公开的化合物ARN14686作为第一ABP为在体外和半胱氨酸水解酶，NAAA 12的体内检测。 NAAA催化饱和和单不饱和的FAE，包括油酰乙醇酰胺（OEA）和十六酰胺乙醇（PEA），这是抗炎核受体PPAR-α13-15的内源性激动剂的水解失活。 NAAA在巨噬细胞等单核细胞衍生的细胞主要表达，以及在B淋巴细胞14,16，这表明在先天免疫应答的调节作用。所述酶在粗面内质网中合成的非活性形式和通过自我蛋白酶机构17中的细胞的酸性区室被激活。该裂解自我蛋白酶生成新N端半胱氨酸（C131在小鼠和大鼠，C126在人中），即是亲核体负责FAE水解18,19。 NAAA活动的药理学抑制改变有利于现场应用工程师16,20,21增加细胞水平的FAE合成/降解的平衡。数β内酯和β内酰胺衍生物已显示出抑制NAAA活性高效力和选择性16,22-26。这些抑制剂作用通过催化半胱氨酸16,27,28号第酰化。
（ - [（S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸4- cyclohexylbutyl- N）16化合物ARN14686是基于全身活性，丝氨酸衍生的β内酰胺NAAA抑制剂的化学结构，ARN726设计。 ARN726的4-丁基环己基用C 9饱和脂族链轴承与叠氮化物载运记者标签随后CC缀合末端炔标签替换。我们选择了设计一个两步ABP到minimallý改变原始支架的结构，从而保持了探针NAAA的亲和力。此外，避免引入笨重标签，这样的探针可以是更适合于不是直接ABP 体内治疗。 ARN14686抑制NAAA具有高效力（hNAAA IC 50 = 6纳米，rNAAA IC 50 = 13纳米）通过形成与酶12的催化半胱氨酸的共价加合物。在活老鼠的实验表明，该探针是在捕捉NAAA在肺部表达选择性。采用高探针浓度（10μM 体外 ，10毫克/毫升静脉内，ⅳ）12时酸性神经酰胺，共享33-34％的同一性与NAAA另一个半胱氨酸酰胺酶，也被确定为一个低亲和力靶。我们也使用ARN14686研究活性NAAA在以下完全弗氏佐剂（CFA）29的施用发炎大鼠组织的存在。
在这里，我们列出了preparati协议上ARN14686（ 图1）并将其应用到NAAA激活体外的调查。作为一个例子，我们描述的实验程序来可视化NAAA的CFA给药后的大鼠爪子。在这个实验中，蛋白从爪组织探针静脉注射后萃取，ABP标记蛋白质进行与生物素叠氮化物以CC。生物素化的样品使用链霉珠富集，并执行蛋白质印迹。在另一应用中，我们描述了活性NAAA的荧光显微镜在小鼠肺从探针处理的小鼠的本地化。在这种情况下，将组织切片并部分经受CC为罗丹明加成。工作流方案， 如图2所示。
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Protocol
注意：所有的化学反应，应在通风橱和使用实验室工作服，手套和护目镜进行。该反应应在氮气环境中也进行。
伦理声明：我们涉及动物的程序符合有关动物用于实验和其他科学目的（DM 116192）和欧共体法规的保护意大利规定执行（EC的OJ L一分之三百五十八1986年12月18日）。
注：合成[（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]乙酸铵是用于大规模收率描述（50克N-CBZ- L-丝氨酸），但是它可以很容易地按比例缩小。
1.合成
注：参见图1的合成反应方案。
- 2-吡啶基十一碳-10-炔基酯和制备十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-甲酸叔丁酯
- 在50毫升圆底烧瓶中，溶解350毫克的十一碳10炔-1-醇3.5毫升无水二氯甲烷。
- 在1.1.1的溶液中，加入25毫克的4二甲氨基吡啶（DMAP）和530毫克2- dipyridylcarbonate（DPC）的。搅拌在室温下（RT）的混合物16小时。
- 加入20毫升二氯甲烷。
- 将混合物转移到分液漏斗中。加入15ml水，摇匀，让两相分离。
- 打开活塞，收集有机相（底部），然后关闭水龙头。加入15mL饱和碳酸氢钠溶液中。摇动分液漏斗，并让两相分离。重复此步骤两次。
- 用Na 2 SO 4干燥有机层，通过棉花过滤到圆底烧瓶中（皮重第一），并蒸发，在减压下（旋转蒸发器）蒸干。
- 称重该烧瓶，将获得600毫克的油是2-吡啶基十一碳-10-炔基碳酸酯和十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-甲酸叔丁酯在1.7的比率的混合物：1。
1 H NMR（400兆赫，DMSO-Ð6）主要成分δ= 8.39（DD，J = 5.0，2.0，1H），7.98（TD，J = 7.9Hz，2.0，1H），7.40（DDD，J = 7.2Hz， 4.9，0.9，1H），7.30（D，J = 8.2Hz，1H），4.22（T，J = 6.6Hz，2H），2.73（T，J = 2.4Hz，1H），2.18 - 2.11（M，2H），1.76 - 1.62（M，2H），1.50 - 1.23（M，12H）。
1 H NMR（400兆赫，DMSO-Ð6）次要组分δ= 7.74（DD，J = 7.2Hz，1.9，1H），7.47（DD，J = 6.7，2.3，1H），6.44（D，J = 9.4Hz， 1H），6.30 - 6.25（M，1H），4.35（T，J = 6.5，2H），2.72（T，J = 2.4，1H），2.18 - 2.11（M，2H），1.77 - 1.60（M，2H ），1.52 - 1.20（M，12H）。 - 使用油而没有任何进一步的分离或纯化。
- [（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]乙酸铵的制备
- 苄制备N - [（S）-1-（羟甲基）-2 - [（4-甲氧基苯基）氨基] -2- oxoeth基]氨基甲酸叔丁酯。
- 在一个4升圆底烧瓶中，溶解141.5克对 -anisidine的在1.5升四氢呋喃和0.5升二氯甲烷。
- 冷却在冰浴中的溶液至0℃。
- 添加-N-CBZ L-丝氨酸50.0克43.9克N - （3-二甲氨基丙基） - N'-ethylcarbodiimide盐酸盐。
- 搅拌于0℃的磁棒30分钟该混合物。
- 移除冰浴的溶液中，用在RT磁棒16小时搅拌。
- 蒸发在减压（旋转蒸发器）的溶剂。
- 加入400毫升1:1的环己烷/乙酸乙酯，用刮勺搅拌，并滗析。
- 重复步骤1.2.1.7两次。
- 溶解在500ml乙酸乙酯中的胶状残余物并用400ml的0.1M的HCl溶液（10倍）洗涤，用400ml饱和NaHCO 3溶液（2次），并用400ml盐水洗涤。
- 干燥的有机层用 Na 2 SO 4，通过棉溶液过滤到圆底烧瓶中（皮重第一），并蒸发它在减压（旋转蒸发器）至干。
- 称重该烧瓶，将获得61.4克白色固体。
1 H NMR（400兆赫，DMSO-Ð6）δ= 9.86（BS，1H），7.52（D，2H，J = 9.0Hz赫兹），7.42-7.25（M，6H），6.91-6.85（M，2H） ，5.06（D，1H，J = 12.9Hz赫兹），5.02（D，1H，J = 12.9Hz赫兹），4.98（T，1H，J = 5.6Hz赫兹），4.24-4.15（M，1H），3.72（S， 3H），3.70-3.57（M，2H）。
- 的苄制备N - [（S）-1-（4-甲氧基苯基）-2-氧代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。
- 溶解58.6克N - [（S）-1-（羟甲基）-2 - [（4-甲氧基苯基）氨基] -2-氧代乙基]氨基甲酸叔丁酯在1.6升N，N-二甲基甲酰胺的。
- 冷却该溶液至0℃，用冰浴。
- 加入1,1'- sulfonyldiimidazole 50.6 G和用30分钟磁棒搅拌。
- 将溶液冷却至-20℃，用冰/氯化钠浴，并添加10.2克氢化钠（在矿物油中的60％）的部分，明智的。
- 搅拌在-20℃1小时的混合物中，然后用2毫升甲醇和1升水淬火。
- 真空过滤沉淀，用200毫升水洗涤，并在真空下干燥。
- 得到42.2g克白色固体。
1 H NMR（400兆赫，DMSO-Ð6）δ= 8.08（D，1H，J = 8.5赫兹），7.42-7.28（M，5H），7.30（D，2H，J = 8.9赫兹），6.95（四，2H，J = 8.9Hz赫兹），5.06（S，2H），4.86（DDD，1H，J = 8.5，5.6，2.6赫兹），3.90（T，1H，J = 5.6Hz赫兹），3.73（S，3H） ，3.55（DD，1H，J = 5.6Hz，2.6赫兹）。
- 的苄制备N - [（S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸。
- 暂停将9.0g苄-N - [（S）-1-（4-甲氧基苯基）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯在500ml乙腈和400ml水。
- 冷却在冰浴中的溶液至0℃。
- 添加45.4克京诚的Ç硝酸铵分批经45分钟，并搅拌，在0℃的磁棒15分钟。
- 加入500毫升饱和的NaHCO 3溶液小心，然后加入500毫升乙酸乙酯。
- 过滤沉淀物并用200毫升乙酸乙酯洗。
- 分离两相溶液，并用200毫升乙酸乙酯（3次）洗涤水层。
- 用Na 2 SO 4干燥有机层，加入5克活性炭，过滤通过硅藻土垫，并蒸发至减压（旋转蒸发器）蒸干。
- 加入乙醚并用刮勺搅拌。
- 过滤固体，将获得4.85克灰白色固体。
1 H NMR（400兆赫，DMSO-Ð6）δ= 7.97（D，1H，J = 8.7Hz赫兹），7.94（BS，1H），7.42- 7.30（M，5H），5.05（S，2H），4.67 （DDD，1H，J = 8.7，5.4，2.7赫兹），3.40（T，1H，J = 5.4赫兹，），3.09（DD，1H，J = 5.4，2.7赫兹）。
- 溶解0.93毫升乙酸245毫升乙酸乙酯。这个标记为“诱捕的解决方案。”
- 溶解3.28克的苄基N - [（R）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯298毫升乙醇中。
- 添加14.1毫升环己二烯和在碳上的3.27克10％钯。
- 搅拌在RT悬浮液12小时，然后通过硅藻土短垫过滤。直接倒入洗脱液体进入诱捕解决方案。
- 蒸发在减压（旋转蒸发器）的溶剂中，保持温度低于35℃。
- 磨碎获得的固体用四氢呋喃，将获得1.72克白色固体。
1 H NMR（400兆赫，DMSO-Ð6）δ= 7.68（BS，1H），3.99（DDD，1H，J = 5.2Hz，2.4，1.2赫兹），3.32（T，1H，J = 5.2Hz赫兹），2.79 （DD，1H，J = 5.2Hz，2.4赫兹），1.90（S，3H）。
- 苄制备N - [（S）-1-（羟甲基）-2 - [（4-甲氧基苯基）氨基] -2- oxoeth基]氨基甲酸叔丁酯。
- 的制备十一碳-10- ynyl- -N - [（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]氨基甲酸
- 在10ml的圆底烧瓶中，溶解60mg的[（3 S）-2-代氮杂环丁烷-3-基]乙酸铵在2ml无水二氯甲烷中。
- 冷却该溶液至0℃，在冰浴中，并添加81微升N，N-二异丙基乙胺逐滴。
- 溶解350毫克含十一碳-10-炔基-2-氧代吡啶-1-甲酸叔丁酯的粗混合物在2ml无水二氯甲烷中，将其添加到溶液中，并在室温搅拌15小时。蒸发溶剂在减压（旋转蒸发器）至干。
- 通过使用自动柱色谱装置柱色谱法（硅胶）纯化：
- 吸收样品在硅胶上，平衡用环己烷柱中，并将样品装入盒。
- 用环己烷/乙酸乙酯洗脱，从100：0至0：100，并收集在试管峰。
- 蒸发相应于减压（旋转蒸发器）的化合物至干燥的级分的溶剂，得到40mg白色固体。
2. CC试剂的制备
- 标签叠氮化物分子的5mM储备溶液的制备
- 在0.5ml二甲亚砜（DMSO）中溶解1.5mg的叠氮化物 - PEG3-氟545。使在0.5ml微量离心管等分试样并储存在-20℃。
- 溶解1.1毫克叠氮PEG3生物素0.5毫升DMSO中。使在0.5ml微量离心管等分试样并储存在-20℃。
- 50mM的储备溶液的Tris制备（2-羧乙基）膦（TCEP）
- 溶解14.3毫克的TCEP在1ml水中，并每次使其新鲜。
- 硫酸铜的50 mM的溶液的制备·5H 2 O
- 在玻璃小瓶中，溶解120.48毫克的CuSO 4·5H 2 O的1毫升水中。存储在RT长达一个月。
- 的Tris 83.5毫原液的制备[（1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基）甲基]胺（TBTA）
- 在玻璃小瓶中，溶解8.85毫克TBTA的在200μlDMSO中。存储在RT长达一个月。
- 准备1.7 mm工作的解决方案TBTA的（立即使用前）
- 加入20μl83.5毫TBTA的到玻璃小瓶中，并用180毫升DMSO稀释。
- 加入800微升叔丁醇和旋涡。
在终审法院处理的大鼠的爪子组织3. NAAA表达分析
注：使用雄性SD大鼠，体重175-200克，并根据道德动物使用指导原则执行所有程序。房子只在通风笼在12小时光照/黑暗周期，并给他们食物和饮水。对于CF的协议A处理，请参阅CFA管理后7天Bonezzi 等 29使用动物发表了文章。
- ARN14686静脉给药
- 在车辆（15％PEG和15％吐温盐溶液）溶解ARN14686。根据老鼠体重（剂量3mg / kg的，注射体积5mL / kg）的计算溶液的浓度。
- 在三个天真和三个终审法院处理的大鼠静脉注射进行。将每个大鼠在适当的塑料约束装置。然后，放置在温水中的鼠尾为2-4分钟，使血管扩张，并注入经尾静脉的化合物IV。
- 注射用车辆只有三只大鼠（幼稚和CFA处理）IV。
- 爪收集和解剖
- 处死大鼠用CO 2吸入4小时探针或载体给药后，通过使用解剖刀切割它们的膝关节以上0.5厘米收集他们的爪子。
- 小心取出剪刀通过辅助剥离皮肤和从骨刮他们剖析了软组织。丢弃的骨头和收集爪子的软组织。卡扣冷冻样品在-80℃的液氮和存储。
- 爪同质化和溶酶体蛋白制品
注：避免使用清洁剂和含胺的缓冲剂，因为它们能抑制CC反应。- 从3只大鼠结合爪组织（获得如第3.2.1所述）并均化它们在4ml 320毫蔗糖的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）和蛋白酶抑制剂混合物（见材料/试剂表 ）;采用高性能的分散仪（见材料/试剂表 ）。
- 离心20分钟，将组织匀浆在1000 xg离心在4℃;保存上清液。
- 加2ml的PBS 320毫蔗糖和蛋白酶抑制剂混合物至组织颗粒和均质一次。
- 离心机在1000 xg离心在4℃下20分钟，并将上清液从步骤3.3.2添加到所述一个。
- 离心30分钟收集上清液在4℃下12000 xg离心。
- 称取沉淀，重悬在PBS的两卷（ 即 200微升每100毫克的颗粒）。转移到1.5ml收集管中，并在-80℃冷冻1小时。
- 解冻样品和在-80℃下1小时再次冻结。
- 重复冷冻/解冻循环两次。
注意：此步骤是为了以溶解蛋白质。如果有必要冻结过夜。 - 离心以100,000 xg离心在4℃下1小时。收集上清液，其含有可溶性溶酶体蛋白，弃沉淀。储存在-80°C或立即用蛋白定量进行。
- 量化使用BCA蛋白质测定30市售试剂盒中的蛋白质含量（见材料/试剂表
- 在-80°C，直到使用储存样本。
- CC与叠氮PEG3生物素
注意：CC和链霉珠富集（步骤3.4-3.6）的协议稍微从斯皮尔斯和Cravatt 31日公布的协议修改。- 从探针和媒介物处理的大鼠（幼稚和CFA处理的大鼠）制备500μl的溶酶体蛋白质（1毫克/毫升，在PBS中）。
- 用40微升链霉琼脂糖的50％的淤浆预清除样品于4℃（用1毫升的PBS使用前洗涤三次）1小时。在1000 xg离心离心4分钟，4℃，取上清。
- 添加11.3微升叠氮PEG3生物素和旋涡的一个5毫米的股票。
- 添加11.3微升新鲜配制TCEP和旋涡的50毫米股票。
- 预混物34微升与11.3微升的50mM 硫酸铜 1.7毫TBTA的新鲜制备的工作溶液2 O的股票。
- 添加45.3毫升预混TBTA /硫酸铜4·5H 2 O解决方案和旋涡。
- 孵育在25℃下2小时的反应（更长的温育时间不影响反应）。在此步骤中观察的蛋白沉淀。孵化的第一个小时后混合。
- 过量CC试剂的去除
- 对于在6500 xg离心在4℃下4分钟的离心样品并除去上清液。
- 通过超声处理（5秒用探针超声波仪）添加750μl的冷的甲醇和重悬的。
- 离心4分钟的样品在6500 xg离心在4℃并除去使用注射器和针头上清液。
- 重复步骤3.5.2两次（不需要超声处理）。
- 在最后一次洗涤后，在PBS中添加325微升十二烷基硫酸钠（SDS）2.5％的所述蛋白质颗粒和超声3×5秒。
- 加热5分钟将样品在65℃，超声处理一个获得。
- 离心5分钟，在室温6500 XG并保存上清。
- 加1.4毫升的PBS至SDS浓度稀释至0.5％。在-20℃储存或继续链霉富集。
- 链霉亲和富集
- 用PBS，带来在步骤3.5.8所得到4.2毫升的样品的体积。添加40微升用切断端尖链霉琼脂糖的50％浆液（使用前用1毫升的PBS洗涤三次）。
- 在室温下孵育2小时以旋转，然后在1400×g下离心2分钟。
- 在不干燥的珠沉淀，并使用剩余的上清液至珠转移到1毫升自旋柱除去上清液（见材料/试剂表 ）。
- 通过重力与3×1毫升1％SDS（在PBS中），3×1毫升（在PBS中）6M尿素，以及4x 1毫升的PBS洗涤。
- 使用2×500微升PBS中，以在1400 xg离心珠粒转移到1.5ml管中并离心2分钟，在室温。轻轻吸用注射器和针上清液。
- 通过加入25微升洗脱缓冲液（6M尿素，2M硫脲，2％SDS和6毫生物素，所有的PBS）在室温15分钟，接着15分钟在95℃下32洗脱树脂结合的蛋白。
- 蛋白质印迹
- 添加5μl的6×Laemmli缓冲液中（对于9毫升：0.5毫升的1摩尔的Tris-HCl的pH为6.8，5毫升20％SDS，5毫克溴酚蓝，将3ml甘油，和H 2 O达9毫升）和添加5％立即β巯基乙醇使用前。短暂离心样品以2000 xg离心到树脂和负载25微升所得上清液的沉淀成4-12％聚丙烯酰胺凝胶。
- 根据制造商的说明33上的印迹膜进行凝胶电泳和蛋白质转移。
- 饱和印迹膜1小时，用10ml封闭缓冲液（见材料/试剂表 ）含有0.1％Tween-20。避免使用牛奶，因为它可以增加背景。
- 用10ml 0.05％吐温-20的PBS中洗膜，并添加10微升荧光链霉亲和的（见材料/试剂表 ）溶解在10毫升在室温下封闭缓冲液加0.1％Tween-20的1小时的。
- 在PBS中洗涤4次用0.05％吐温-20和一次用PBS单独（各10分钟）。
- 使用图像扫描仪（见材料/试剂表 ）。打开仪器和电脑相连。等到准备就绪。
- 启动收购方案，并选择了荧光模式。选择膜面积，并选择保存文件的目标文件夹。
- 设置以下采集参数：680 nm激发长度，BPFR700滤波器，1,000V，光电倍增管（PMT）值（信道2），和25微米的像素尺寸。获取图像。
4.催化活性NAAA的本土小鼠肺荧光万分之一复制
注：使用雄性8〜10周龄的小鼠，并根据对道德动物使用的指导原则执行所有程序。家鼠在通风笼在12小时的光/暗周期，并给他们食物和饮水。
- 在小鼠ARN14686静脉给药
- 溶解ARN14686在车辆：15％PEG和15％吐温20的盐溶液。根据小鼠体重（剂量3mg / kg的，注射体积5mL / kg）的计算溶液的浓度。
- 3小鼠静脉注射进行。将每个小鼠在适当的塑料约束装置。然后，放置在温水中的鼠尾为2-4分钟，使血管扩张，并通过尾静脉注射的化合物IV。
- 注只有车辆3只小鼠静脉。
- 龙收集和切片准备
警告：小心轻放在通风橱多聚甲醛，并戴手套！- 麻醉用氯仿溶剂小鼠拉尔水合物（400毫克/千克）。确认与脚趾捏麻醉。如下执行穿心灌注：
- 从表面上看用剪刀剪断腹侧皮肤并露出胸，腹膜表面。
- 从表面上看用剪刀剪开腹膜，略低于xyphoid过程，并揭露隔膜和内脏器官。要小心，不要划破任何显著血管。
- 通过切割膜片从一个外侧面到另一打开胸腔。
- 插入连接于自动注射器泵的地下25针和60毫升的4％PFA磷酸缓冲液（0.1M，pH7.4）中注入加入20ml 0.9％盐溶液，接着。
- 一旦灌注完成后，使用镊子拔出心脏，仔细剖析一下。抓住用钳子气管，并通过它用剪刀完全切断。轻轻向上拉拽气管和肋骨取出肺。解剖组织来从左侧分开右肺。
- 后缀在多聚甲醛4％组织为在冷2-甲基丁烷1小时，冷冻的样品，并将其存储在-80℃。
- 收集使用低温恒温器40微米的部分，立即装入他们的幻灯片（一个有五分之一），并处理它们的免疫组化，详情如下。
- 麻醉用氯仿溶剂小鼠拉尔水合物（400毫克/千克）。确认与脚趾捏麻醉。如下执行穿心灌注：
- 组织切片通透性和阻塞
- 用PBS（2×5分钟）洗涤并用0.1％的Triton X-100的PBS透化在室温15分钟。
- 用PBS（2×5分钟）洗涤，并用3％牛血清白蛋白（BSA）的PBS在RT下30分钟阻塞。
- 用PBS（2×5分钟）洗涤和与CC进行。
- 在组织切片CC与叠氮PEG3-氟545
- 准备通过混合在第2节中描述对于溶液1ml准备的CC试剂的溶液，加入2微升叠氮PEG3-氟545（5毫米股票），20微升的TCEP（新鲜配制的50毫米STOCK），58.8微升TBTA的（新鲜配制1.7 mm工作液），20微升硫酸铜4·5H 2 O（50毫米股票），和900微升PBS的。
- 约400微升CC组合添加到组织切片，这是根据第4.2节准备。需要注意的CC组合的选择体积足以覆盖片。在室温下孵育1小时避光。
- 用PBS（1×5分钟），冷甲醇（1×5分钟），1％吐温20和0.5毫摩尔EDTA的PBS（3×2分钟）中的溶液，和PBS（1×5分钟）洗涤。
- 空气干燥，加用DAPI防褪色封固的下降（见材料/试剂表 ），接近与盖玻片（避免泡沫的形成），并与抛光密封。储存在4℃直至分析。
- 图像采集
- 使用配有546 nm和450 nm激发激光器共聚焦显微镜（见材料/试剂表 ）以下用户指南。
- 选择具有NA = 1.40 60X物镜，确保通过目镜预览幻灯片，并专注于感兴趣的领域。
- 根据样品和设备特点确定采集参数。
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Representative Results
ARN14686是基于NAAA抑制剂ARN726的支架设计。 ARN726的4-丁基环己基用C 9饱和脂族链带有终端炔标签（ 图1）被取代。炔标签是为了允许使用两步标记过程的添加荧光团或通过CC一个生物素分子引入。这一功能使得ARN14686一个非常通用的工具，以探测NAAA 在体外和体内 。
这里，我们显示ARN14686的两个应用程序，这是代表该分子的潜在的; 图2是此处报道的实验步骤的方案。探针的静脉给药后，有两个不同的检测方法可以用于：i）在蛋白印迹活性NAAA表达的分析，和ii）通过fluorescenc细胞内活性NAAA表达和定位的分析显微术。
第一个代表性的结果，最近我们小组29日公布。我们分析了在CFA诱导爪炎症的大鼠模型NAAA表达。探针（3毫克/公斤）或载体在幼稚和CFA处理的大鼠中静脉注射。将大鼠4小时后处死。于丰富的溶酶体提取物进行CC引入生物素标记到探针标记的蛋白质。生物素蛋白是使用旁链亲和素珠丰富。洗脱蛋白通过蛋白印迹分析，显示出活性NAAA的水平相对于对照大鼠的CFA（ 图3）治疗的大鼠的爪显着增加。蛋白质印迹分析的优点是，它使所述探针反应性蛋白质，它是用凝胶电泳分离的详细检查。这种方法还允许潜在的探测脱靶揭幕。到无探头控制必须是人包括为了排除内源性生物素化的蛋白质，它们构成了实验背景的方式。在图3中的箭头表示这样的背景蛋白质，这反过来又可以作为一个装载参考对照。
在第二未发表的实验中（ 图4），我们使用ARN14686探测NAAA用于通过荧光显微镜体外检测。我们在3毫克/公斤（ⅳ）施用ARN14686到小鼠和穿心灌注治疗后2小时处死它们。肺进行收集，后缀，并在冷2- metylbutane冻结。对荧光团加入CC反应物直接在40微米厚的组织切片，用低温恒温器收集的执行。分析荧光显微镜观察显示催化活性NAAA的扩散囊泡结构属于肺泡巨噬细胞的存在。相比于使用特定的蛋白质 - 抗体中，只有一莫如酶观察。
图1：ARN14686合成反应方案十一碳-10-炔-2-醇是由dipyridylcarbonate（DPC）在催化4-二甲基氨基吡啶（DMAP）的存在下活化以产生一个混合的碳酸酯。该碳酸盐然后用氨基内酰胺获得目标分子ARN14686反应。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在本工作中所示的一般策略的工作流程方案的探针被注入到动物（大鼠或小鼠）和目标表达分析以下两种不同的实验步骤学生：我）将标记的蛋白质提取和生物素通过CC加入。生物素蛋白在链霉珠富集阶段后，探测目标是通过蛋白质印迹进行分析。 ⅱ）组织切片制备和荧光团通过CC加入。探测目标定位是由荧光显微镜分析。这个数字已被改编自Bonezzi 等 29 请点击这里查看该图的放大版本。
图3：在CFA处理的大鼠的爪NAAA活化分析从幼稚大鼠（泳道1和2）或CFA注射的大鼠链霉富含蛋白质注射后7天的蛋白印迹分析（泳道3和4）。大鼠接受赋形剂或ARN14686（3毫克/公斤）的静脉注射。该印迹膜用荧光链霉抗进行探测。箭头指示NAAA带;箭头表示大约90 kDa的含生物素的带，显示出了类似的蛋白质的量在每一泳道中加载。这个数字已经从Bonezzi 等进行修改。29 ，请点击这里查看本图的放大版本。
图 4： 的探针标记的荧光显微镜NAAA在小鼠肺媒介物（A）的肺切片或具有叠氮基PEG3-氟545 CC后ARN14686注射（B）的小鼠的代表性的图像被报道体外 检测 。在ARN14686注射小鼠中检测到阳性信号（红细胞），而v中没有检测到信号ehicle给予小鼠。叠氮化物 - PEG3-氟545阳性肺泡巨噬细胞的细节在更高的放大倍率如图℃。细胞核标记用DAPI（蓝色）。比例尺= 50微米A和10微米C. 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
酶活性是在不同的层次，包括RNA转录，蛋白质合成，蛋白质易位，翻译后修饰，和蛋白质 - 蛋白质相互作用精细调节。通常，酶表达单独不占它的活性。 ABPP的开发是为了研究在其天然状态的蛋白质的活性。两个特征是必需的：共价地结合到感兴趣的酶和记者标签的活性位点的化学探针来检测探针标记的酶。
探针设计与合成的过程的关键点。探针必须具有对其靶足够亲和力和选择性。此外，记者标签的存在必须不影响目标交战。这个问题主要是由一个两步ABP，其中，所述目标已经陷入后引入记者标签的设计克服。无标签的探针特别适用于在体内研究，在这种蛋白质活性可以在活细胞或生物体，以最少的外部改变进行评估。该NAAA探头ARN14686旨在满足上述要求。的β内酰胺是基于与β内酰胺类NAAA抑制剂16,26的事先得到的结果选择反应弹头。这些化合物通过共价键结合到酶的催化半胱氨酸抑制NAAA以有效和选择性的方式。此外，被证明是全身性活性16的化合物。我们介绍了C9饱和脂族链，考虑到NAAA的增加的亲和力的长脂肪链。添加了一个末端炔允许两步标记。
另一个关键的步骤是选择的剂量和用于体内施用的时间。这取决于在等离子体探针，其靶的亲和力，并且其选择性的稳定性。正确的剂量必须选择以允许目标捕获，同时避免了宝参与ssible脱靶。我们发现，3毫克/公斤ARN14686四是最佳捕捉NAAA选择。较高剂量导致同源半胱氨酸酰胺酶，酸性神经酰胺酶的捕获。关于治疗长度，分析公充盈器官时，像肺，很短的时间（2小时）可足以允许所述探针与靶反应。对于爪子，但是，我们不得不反应时间增加一倍。
通过蛋白质印迹指标分析一个可能的问题是由于自然生物素蛋白的存在。这些将不可避免地与特定的探测目标一起鉴定。我们发现，与引入链霉亲珠子preclearing执行步骤CC之前大大提高了我们的研究结果的质量。另一方面，天然生物素化的蛋白质的存在可能会被用来控制可能装载假象。最后，通过荧光显微术方面定位研究，它要意识到的p是很重要长袍选择性，因为不同于蛋白质印迹，荧光显微镜不会从脱靶允许靶的区别。初步选择性研究应被执行以评估可行性，并设置最佳实验条件。
所描述的技术的局限性主要是涉及到避免实验条件可以影响CC反应，如用洗涤剂和含胺的缓冲器的必要性。这些方面，必须采取在制备细胞裂解物或组织匀浆时考虑到。而且，当需要一链霉富集相，起始材料的量构成另一个问题，因为当蛋白质含量为不小于250微克此过程仅适用。此限制设置由于技术问题，如工作卷，蛋白质回收率，CC-诱导析出后，和链霉树脂所使用的量。
前情Y，NAAA活性可以仅通过进行活性测定，其中需要酶的体外活化和底物溶解14使用的活化缓冲液中进行评价。这种方法提供了总NAAA表达的信息，不是主动NAAA的存在。另一种可能性是测量PEA和OEA的组织水平，但这种方法仅代表一种间接的方式来评估NAAA活性34,35。此外，FAE水平可通过其它因素，如生物合成的影响。化学探针ARN14686是NAAA第一ABP。这里所描述的协议说明了一个简单的程序，用于捕获和可视化NAAA的活性形式，无论是在体外和体内 。所有样品的操作是到探针-靶反应随后，从而使有关酶的体内状态的可靠信息。此外，在荧光显微镜使用ARN14686代表一个独特的刀具TØ本地化活跃NAAA。可用抗体，识别NAAA催化亚基，请不要将NAAA全长酶原和活性酶区别对待。
从这里所描述的协议开始，NAAA表达和活化可以在不同的细胞系和炎症的动物模型中进行分析。共定位研究可以被执行以更好地表征在生理和病理条件NAAA的作用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
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