Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

voorbereiding en Published: November 23, 2016 doi: 10.3791/54652
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Drug Discovery and Development, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Departments of Anatomy and Neurobiology, Pharmacology, and Biological Chemistry, University of California, Irvine School of Medicine

Summary

Hier beschrijven we de bereiding en toepassing van een op activiteit gebaseerde probe (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) waarmee voor de detectie en kwantificering van de actieve vorm van het enzym N proinflammatoire -acylethanolamine acid amidase (NAAA), zowel in vitro en ex vivo.

Abstract

Activiteitsgestuurde eiwitprofilering (ABPP) is een methode voor de identificatie van een enzym van belang in een complex proteoom door het gebruik van een probe die chemisch actieve plaatsen van het enzym gericht. Een reporter tag ingebracht in de probe maakt de detectie van de gemerkte enzym in de gel fluorescentie scanning, eiwitblot, fluorescentiemicroscopie of vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Hier beschrijven we de bereiding en het gebruik van de verbinding ARN14686, een click chemie activiteit-gebaseerde probe (CC-ABP) die selectief herkent het enzym N -acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is een cysteïne hydrolase die de ontsteking bevordert door het uitschakelen van endogene peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor (PPAR) -alfa agonisten zoals palmitoylethanolamide (PEA) en oleoylethanolamide (OEA). NAAA wordt gesynthetiseerd als een inactieve pro-enzym met volledige lengte, die wordt geactiveerd door autoproteolyse in de zure pH van het lysosoom. Lokalisatiestudies have aangetoond dat NAAA voornamelijk tot expressie wordt gebracht in macrofagen en andere van monocyt afgeleide cellen, en in B-lymfocyten. Wij geven voorbeelden van hoe ARN14686 kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren actieve NAAA ex vivo knaagdieren weefsel met eiwitblot en fluorescentie microscopie.

Introduction

Veel gebruikte methodes om de expressiepatronen interacties en functies van eiwitten, waaronder vloeistofchromatografie-massaspectrometrie platforms voor jachtgeweer analyse 1,2, gist two-hybrid onderzoeken methoden 3,4 en in vitro assays, zijn beperkt doordat ze in staat om de activiteit van eiwitten bepalen in hun natieve toestand. Activity-based eiwit profiling (ABPP) kan worden gebruikt om deze leemte op te vullen. In deze benadering, kleine-molecule probes covalent binden aan de actieve plaats van een enzym van belang geconjugeerd aan een reporter groep die zorgt voor doeldetectie. Met behulp van click chemie (CC), kan de verslaggever worden geïntegreerd in de probe of kan worden ingevoerd na doelwit betrokkenheid heeft plaatsgevonden 5,6. De laatste procedure vereist het gebruik van probes die geschikte chemische groepen, zoals een terminale alkyn of azide, die met een aantal reporter reagens kan worden gewijzigd via bio-orthogonale reacties such als Cu (I) -gekatalyseerde Huisgen [3 + 2] cycloadditie 7-9 of Staudinger ligation 10,11.

Onlangs beschreven wij de verbinding ARN14686 als eerste ABP voor de in vitro en in vivo detectie van de cysteïne hydrolase, NAAA 12. NAAA katalyseert de hydrolytische inactivering van verzadigde en enkelvoudig onverzadigde FAES, waaronder oleoylethanolamide (OEA) en palmitoylethanolamide (PEA), die endogene agonisten van de anti-inflammatoire nucleaire receptor PPAR-alpha 13-15 zijn. NAAA wordt voornamelijk tot expressie gebracht in macrofagen en andere van monocyt afgeleide cellen, en in B-lymfocyten 14,16, suggereert een rol in de regulatie van de aangeboren immuunrespons. Het enzym wordt gesynthetiseerd in het ruw ER in een inactieve vorm en zure compartimenten van de cel wordt geactiveerd door een autoproteolytische mechanisme 17. De autoprotolytische splitsing genereert een nieuw N-terminale cysteïne (C131 bij muizen en ratten, C126 bij de mens), die het nucleofiel belast FAE hydrolyse 18,19. Farmacologische remming van NAAA activiteit verandert de FAE synthese / afbraak balans in het voordeel van verhoogde cellulaire niveaus van Faes 16,20,21. Verschillende β-lacton en β-lactam derivaten aangetoond dat NAAA activiteit te remmen met hoge potentie en selectiviteit 16,22-26. Deze remmers werken via S-acylering van het katalytische cysteïne 16,27,28.

De verbinding ARN14686 werd ontworpen op basis van de chemische structuur van de systemisch actieve serine-afgeleide β-lactam NAAA inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat) 16. De 4-butyl- cyclohexyl groep ARN726 werd vervangen door een C9 verzadigde alifatische keten die van een terminal alkyn tag CC daaropvolgende conjugatie met een azide-dragende reporter tag. Wij kozen voor een tweestaps ABP ontwerpen om minimally veranderen de structuur van de oorspronkelijke steiger, waardoor het behoud van de affiniteit van de sonde voor NAAA. Bovendien vermijden van de introductie van omvangrijke markeringen dergelijke sonde kan meer geschikt zijn voor in vivo behandeling van een directe ABP zijn. ARN14686 remt NAAA met hoge potentie (hNAAA IC 50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) door vorming van een covalente adduct met de katalytische cysteïne van het enzym 12. Experimenten in levende ratten toonde aan dat de sonde selectief vastleggen NAAA uitgedrukt in longen. Zuur ceramidase, een cysteïne amidase dat 33-34% identiteit deelt met NAAA, werd ook geïdentificeerd als een lage-affiniteit doelwit Als hoge probe concentraties (10 uM in vitro, 10 mg / ml intraveneus, iv) 12. We hebben ook ARN14686 de aanwezigheid van actieve NAAA in ontstoken weefsels ratten na toediening van adjuvans (CFA) 29 volledig Freund bestuderen.

Hier schetsen we een protocol voor de preparatiop van ARN14686 (figuur 1) en de toepassing ervan op het onderzoek naar NAAA activering ex vivo. Als voorbeeld beschrijven we een experimentele procedure NAAA visualiseren rat poten na CFA toediening. In dit experiment worden eiwitten geëxtraheerd uit weefsel poot na intraveneuze injectie van de sonde en het ABP-gemerkte proteoom wordt onderworpen aan CC biotine-azide. Gebiotinyleerde monsters worden verrijkt via streptavidine parels en eiwitblots worden uitgevoerd. In een andere toepassing, beschrijven we de lokalisatie van actieve NAAA van fluorescentiemicroscopie in muizenlongen van probe-behandelde muizen. In dit geval wordt het weefsel doorgesneden en secties worden onderworpen aan CC rhodamine toevoeging. Een werkstroom schema is weergegeven in figuur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Alle chemische reacties moeten in een geventileerde zuurkast en met het gebruik van een lab jas, handschoenen en een veiligheidsbril worden uitgevoerd. De reacties moeten ook in een stikstofatmosfeer uitgevoerd.

Ethische verklaring: Onze procedures waarbij dieren worden uitgevoerd in overeenstemming met de Italiaanse regelgeving inzake de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (DM 116.192), en de Europese Economische Gemeenschap voorschriften (PB van de EG L 358/1 1986/12/18 ).

OPMERKING: Synthese van [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetaat wordt beschreven voor grootschalige opbrengst (50 g N-Cbz-L-Serine), maar het kan gemakkelijk worden verkleind.

1. Synthese

OPMERKING: Zie figuur 1 voor de synthese reactieschema.

  1. Bereiding van 2-pyridyl undec-10-ynyl carbonaat en undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylaat
    1. In een 50 ml rondbodemkolf, los 350 mg undec-10-yn-1-ol in 3,5 ml droge dichloormethaan.
    2. Aan de oplossing in 1.1.1, voeg 25 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP) en 530 mg 2-dipyridylcarbonate (DPC). Roer het mengsel bij kamertemperatuur (KT) gedurende 16 uur.
    3. Voeg 20 ml dichloormethaan.
    4. Breng het mengsel in een scheitrechter. Voeg 15 ml water, schud het, en laat de twee fasen te scheiden.
    5. Open de kraan, het verzamelen van de organische fase (onder), en sluit het kraantje. Voeg 15 ml van een verzadigde NaHCO3 oplossing. Schud de scheitrechter en laat de twee fasen te scheiden. Herhaal deze stap nog twee keer.
    6. Droog de organische laag met Na 2 SO 4, filtreer door katoen in een rondbodemkolf (tarra eerst) en damp tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
    7. Weeg de kolf en het verkrijgen van 600 mg olie die een mengsel van 2-pyridyl undec-10-ynyl carbonaat en undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylaat in een verhouding van 1,7: 1.
      1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) hoofdcomponent δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) gering aandeel δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30-6,25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. Gebruik de olie zonder verdere scheiding of zuivering.
  2. Bereiding van [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetaat
    1. Bereiding van benzyl-N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyfenyl) amino] -2-oxoethyl] carbamaat.
      1. In een 4-L rondbodemkolf, los 141,5 g p-anisidine in 1,5 L tetrahydrofuran en 0,5 liter dichloormethaan.
      2. Koel de oplossing tot 0 ° C in een ijsbad.
      3. Voeg 50,0 g N-Cbz-L-serine en 43,9 g N - (3-dimethylaminopropyl) - N-ethylcarbodiimide hydrochloride.
      4. Roer het mengsel met een magneetstaaf bij 0 ° C gedurende 30 minuten.
      5. Verwijder de oplossing uit het ijsbad en roer met een magneetstaaf bij kamertemperatuur gedurende 16 uur.
      6. Verdamp het oplosmiddel onder verlaagde druk (roterende verdamper).
      7. Voeg 400 ml 1: 1 cyclohexaan / ethylacetaat, geroerd met een spatel en decanteren.
      8. Herhaal stap 1.2.1.7 twee keer.
      9. Los het gomachtige residu in 500 ml ethylacetaat en wassen met 400 ml 0,1 M HCl-oplossing (10 maal), met 400 ml verzadigde NaHCO3-oplossing (2 maal) en met 400 ml pekel.
      10. Droog de organische laag metNa 2 SO 4 Filtreer de oplossing door katoen in een rondbodemkolf (tarra eerst) en damp aan droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
      11. Weeg de kolf en het verkrijgen van 61,4 g van een witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
    2. Bereiding van benzyl-N - [(S) -1- (4-methoxyfenyl) -2-oxo-azetidine-3-yl] carbamaat.
      1. Ontbinden 58,6 g N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4-methoxyfenyl) amino] -2-oxo-ethyl] carbamaat in 1,6 liter N, N-dimethylformamide.
      2. Koel de oplossing tot 0 ° C met een ijsbad.
      3. Voeg 50,6 g 1,1-sulfonyldiimidazole en roer met een magnetische bar voor 30 min.
      4. Koel de oplossingtot -20 ° C met een ijs / NaCl-bad en voeg 10,2 g natriumhydride (60% in minerale olie) in porties.
      5. Roer het mengsel bij -20 ° C gedurende 1 uur, en onder afkoelen met 2 ml methanol en 1 liter water.
      6. Vacuümfiltreer het neerslag, wassen met 200 ml water, en droog onder vacuüm.
      7. Het verkrijgen van 42,2 g van een witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
    3. Bereiding van benzyl-N - [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat.
      1. Suspendeer 9,0 g benzyl-N - [(S) -1- (4-methoxyfenyl) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat in 500 ml acetonitril en 400 ml water.
      2. Koel de oplossing tot 0 ° C in een ijsbad.
      3. Voeg 45,4 g Ceric ammoniumnitraat portiegewijs in 45 minuten en roeren met een magneetstaaf bij 0 ° C gedurende 15 minuten.
      4. Voeg 500 ml van een verzadigde NaHCO3-oplossing voorzichtig, en voeg vervolgens 500 ml ethylacetaat.
      5. Filtreer het precipitaat en wassen met 200 ml ethylacetaat.
      6. Scheid de bifasische oplossing en was de waterlaag met 200 ml ethylacetaat (3 maal).
      7. Droog de organische laag met Na 2 SO 4, voeg 5 g actieve kool, filter door een laag diatomeeënsilica en damp tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
      8. Voeg diethylether en roeren met een spatel.
      9. Filtreer de vaste stof en het verkrijgen van 4,85 g van een gebroken-witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
      Bereiding van [(S) -2-oxoazetidin-3-yl] -ammonium acetaat.
      1. Ontbinden 0,93 ml azijnzuur in 245 ml ethylacetaat. Markeer dit als "trapping oplossing."
      2. Ontbinden 3,28 g benzyl-N - [(R) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat in 298 ml ethanol.
      3. Voeg 14,1 ml cyclohexadieen en 3,27 g 10% palladium op koolstof.
      4. Roer de suspensie bij kamertemperatuur gedurende 12 uur en vervolgens gefiltreerd door een kort kussen van diatomeeënaarde. Giet de eluerende vloeistof direct in de trapping oplossing.
      5. Verdamp het oplosmiddel onder verlaagde druk (roterende verdamper), waarbij de temperatuur onder 35 ° C.
      6. Vermaal de verkregen vaste stof met tetrahydrofuran en het verkrijgen van 1,72 g van een witte vaste stof.
        1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7,68 (bs, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
  3. Bereiding van undec-10-ynyl- N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamaat
    1. In een 10 ml rondbodemkolf, los 60 mg [(3S) -2-oxoazetidin-3-yl] ammoniumacetaat in 2 ml droge dichloormethaan.
    2. Koel de oplossing tot 0 ° C in een ijsbad en voeg 81 pl N, N- diisopropylethylamine druppelsgewijs.
    3. Oplossen 350 mg van het ruwe mengsel dat undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-carboxylaat in 2 ml droog dichloormethaan, toevoegen aan de oplossing en geroerd bij kamertemperatuur gedurende 15 uur. Damp het oplosmiddel tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper).
    4. Zuiver door middel van kolomchromatografie (silicagel) met behulp van een geautomatiseerde kolomchromatografie inrichting:
      1. Absorbeert het monster op silicagel, equilibreren van de kolom met cyclohexaan en plaats het monster in de patroon.
      2. Elueren met cyclohexaan / ethylacetaat 100: 0 tot 0: 100 en laat pieken op reageerbuizen.
      3. Verdamp het oplosmiddel van de fracties overeenkomend met de verbinding tot droog onder verlaagde druk (roterende verdamper) en het verkrijgen van 40 mg van een witte vaste stof.

2. Bereiding van CC reagentia

  1. Voorbereiding van 5 mM Stock oplossing van Tag-azide Molecules
    1. Los op 1,5 mg azide-PEG3-Fluor 545 in 0,5 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Voeg aliquots in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
    2. Los op 1,1 mg azide-PEG3-biotine in 0,5 ml DMSO. Voeg aliquots in 0,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C.
  2. Bereiding van 50 mM voorraadoplossing van Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP)
    1. Los op 14,3 mg TCEP in 1 ml water, en maakt het fris elke keer.
  3. Bereiding van 50 mM oplossing van CuSO4 · 5H 2 O
    1. In een glazen flesje, oplossen 120,48 mg CuSO4 · 5H 2 O in 1 ml water. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal één maand.
  4. Bereiding van 83,5 mM voorraadoplossing Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazool-4-yl) methyl] amine (TBTA)
    1. In een glazen flesje, los 8,85 mg TBTA in 200 ul DMSO. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal één maand.
  5. Bereiding van 1,7 mm Working Solution van TBTA (direct voor gebruik)
    1. Voeg 20 ul van 83,5 mM TBTA een glazen flesje en verdun met 180 ml van DMSO.
    2. Voeg 800 ul van tert-Butanol en vortex.

3. NAAA expressie analyse in Paw Tissue van CFA-behandelde ratten

LET OP: Gebruik mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 175-200 g, en het uitvoeren van alle procedures in overeenstemming met de richtlijnen voor ethisch gebruik van dieren. Huis ratten in geventileerde kooien op een 12-uur licht / donker-cyclus en geef ze vrije toegang tot voedsel en water. Voor het protocol van CFEen behandeling verwezen naar de gepubliceerd door Bonezzi et al. 29 Gebruik dieren 7 dagen na toediening CFA artikel.

  1. Intraveneuze toediening van ARN14686
    1. ARN14686 oplossen in het voertuig (15% PEG en 15% Tween-zoutoplossing). Bereken de oplossing concentratie overeenkomstig rat gewicht (dosis 3 mg / kg, injectievolume 5 ml / kg).
    2. Ga verder met iv injecties in drie naïeve en drie CFA-behandelde ratten. Plaats elke rat in een geschikte plastic terughoudendheid apparaat. Plaats vervolgens de staart rat in warm water voor 2-4 minuten tot vaatverwijding mogelijk te maken, en injecteer de verbinding iv via de staartader.
    3. Injecteren drie ratten (naïef en CFA-behandelde) iv met enige voertuig.
  2. Paw Collection en Dissection
    1. Offer de ratten door CO 2 inhalatie 4 uur na toediening probe of voertuig en het verzamelen van hun poten door te snijden 0,5 cm boven het kniegewricht met behulp van een scalpel.
    2. Verwijder voorzichtig de huid door-schaar bijgestaan ​​dissectie en ontleden zachte weefsels door ze te schrapen van het bot. Gooi de botten en het verzamelen van de zachte weefsels van de poten. Snap freeze monsters in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.
  3. Paw homogenisering en lysosomale Eiwit Voorbereiding
    LET OP: Vermijd het gebruik van detergenten en amine bevattende buffers, zoals ze de CC reactie kan remmen.
    1. Combineer poot weefsel van 3 ratten (verkregen zoals beschreven in paragraaf 3.2.1) en homogeniseer ze in 4 ml van 320 mM sucrose in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) en een cocktail van proteaseremmers (zie / reagens tabel); gebruik maken van een high-performance verspreidende instrument (zie Materiaal / reagens Table).
    2. Centrifugeer de weefselhomogenaat gedurende 20 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C; sla het supernatant.
    3. Voeg 2 ml van 320 mM sucrose in PBS en de proteaseremmer cocktail aan het weefsel pelletmeng opnieuw.
    4. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1000 xg bij 4 ° C en voeg het supernatant aan die uit stap 3.3.2.
    5. Centrifugeer de supernatanten verzameld gedurende 30 min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
    6. Weeg de pellet en resuspendeer in twee volumina PBS (dwz 200 pi per 100 mg tablet). Verwijzing naar een 1,5 ml verzamelbuis en invriezen bij -80 ° C gedurende 1 uur.
    7. Ontdooi de monsters en opnieuw bevriezen 1 uur bij -80 ° C.
    8. Herhaal het bevriezen / ontdooien cyclus twee keer.
      LET OP: Deze stap is bedoeld om het eiwit oplosbaar. Bevriezen 's nachts indien nodig.
    9. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 100.000 xg bij 4 ° C. Verzamel de bovenstaande vloeistof, die oplosbaar zijn lysosomale eiwitten bevat, en gooi de pellet. Bewaar bij -80 ° C of onmiddellijk doorgaan met eiwit kwantificering.
    10. Kwantificeren het eiwitgehalte met behulp van een BCA proteïne test 30 commerciële kit (zie Materiaal / reagens Table
    11. Bewaar de monsters bij -80 ° C tot gebruik.
  4. CC met azide-PEG3-biotine
    LET OP: Het protocol van CC en streptavidine kraal verrijking (stappen 3,4-3,6) zijn enigszins gewijzigd ten opzichte van de uitgave van Speers en Cravatt 31 protocol.
    1. Bereid 500 pl (1 mg / ml in PBS) van lysosomale eiwitten van probe- en met hulpmiddel behandelde ratten (naïef en CFA-behandelde ratten).
    2. Preclear monsters met 40 pi van een 50% suspensie van streptavidine agarose (Was driemaal met 1 ml PBS vóór gebruik) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer 4 min bij 1000 xg bij 4 ° C en neem de supernatant.
    3. Voeg 11,3 ul van een 5 mM voorraad van azide-PEG3-biotine en vortex.
    4. Voeg 11,3 ul van een 50 mM voorraad van vers bereide TCEP en vortex.
    5. Premix 34 ul van een vers bereide werkoplossing van 1,7 mM TBTA met 11,3 ui van een 50 mM CuSO4 2 O voorraad.
    6. Voeg 45,3 ml van een gerede TBTA / CuSO4 · 5H 2 O-oplossing en vortex.
    7. Incubeer de reactie bij 25 ° C gedurende 2 uur (een langere incubatietijd laat de reactie). Observeer eiwit neerslag bij deze stap. Meng na het eerste uur van de incubatie.
  5. Verwijdering van Excess CC reagentia
    1. Centrifugeer de monsters gedurende 4 minuten bij 6500 xg bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
    2. Voeg 750 ul van koude methanol en resuspendeer door sonicatie (5 sec met een sonde ultrasoonapparaat).
    3. Centrifugeer de monsters gedurende 4 minuten bij 6500 xg bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof met een injectiespuit en naald.
    4. Herhaal stap 3.5.2 tweemaal (sonicatie is niet nodig).
    5. Na de laatste wasbeurt, voeg 325 ul van natriumdodecylsulfaat (SDS) 2,5% in PBS om het eiwit pellet ultrasone trillingen 3x gedurende 5 sec.
    6. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten bij 65 ° C en een ultrasone trillingenkrijgen.
    7. Centrifugeer 5 min bij 6500 xg bij kamertemperatuur en bewaar het supernatant.
    8. Voeg 1,4 ml PBS aan de SDS te verdunnen tot 0,5%. Bewaren bij -20 ° C of doorgaan met streptavidine verrijking.
  6. streptavidine Enrichment
    1. Met PBS, breng het volume van het product verkregen in stap 3.5.8 tot 4,2 ml monsters. Voeg 40 ul van een 50% suspensie van streptavidine agarose met een cut-end tip (Was driemaal met 1 ml PBS vóór gebruik).
    2. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder rotatie en centrifugeer gedurende 2 min bij 1400 x g.
    3. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder het drogen van de korrels pelleteren en gebruik overblijvende supernatant aan de korrels dragen aan een 1 ml Spin Column (zie / reagens tabel).
    4. Wassen zwaartekracht met 3x 1 ml 1% SDS (in PBS), 3 x 1 ml 6 M ureum (in PBS), en 4x 1 ml PBS.
    5. Gebruik 2x 500 pl PBS om de kralen overdracht naar een 1,5 ml buis en centrifugeer gedurende 2 min bij 1400 xg bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant met een spuit en naald.
    6. Elueer de hars gebonden eiwitten door toevoeging van 25 ui elutiebuffer (6 M ureum, 2 M thioureum, 2% SDS, en 6 mM biotine, alle in PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door 15 min bij 95 ° C 32.
  7. eiwit Blot
    1. Voeg 5 ul van 6x Laemmli buffer (9 ml: 0,5 ml 1 M Tris-HCl pH 6,8, 5 ml 20% SDS, 5 mg broomfenolblauw, 3 ml glycerol en H 2 O tot 9 ml) en voeg 5% β-mercaptoethanol onmiddellijk voor gebruik. Kort Centrifugeer de monsters bij 2000 xg om het hars en de belasting 25 ul van de supernatant verkregen pellet in een 4-12% polyacrylamide gel.
    2. Voeren gelelektroforese en eiwit overdracht op een blotting membraan volgens de instructies van de fabrikant 33.
    3. Verzadigen blotting membraan gedurende 1 uur met 10 ml van een blokkerende buffer (zie / reagens tabel) dat 0,1% Tween-20.Gebruik geen melk, omdat de achtergrond kan verhogen.
    4. Was het membraan met 10 ml 0,05% Tween-20 in PBS en voeg 10 ul van fluorescent streptavidine (zie / reagens Table) opgelost in 10 ml blokkerende buffer plus 0,1% Tween-20 gedurende 1 uur bij KT.
    5. Was 4 keer met 0,05% Tween-20 in PBS en eenmaal met PBS alleen (10 min elk).
    6. Gebruik een afbeelding scanner (zie Materiaal / reagens Table). Schakel het instrument en de aangesloten computer. Wacht tot er klaar voor.
    7. Start de acquisitie programma en selecteer de fluorescentie-modus. Selecteer het membraanoppervlak en kies de doelmap voor opgeslagen bestanden.
    8. Stel de volgende verwervingsparameters: 680 nm excitatie lengte BPFR700 filter, 1000 V fotomultiplicatorbuis (PMT) waarde (kanaal 2), en 25 urn pixelgrootte. Het verwerven van de afbeelding.

4. Lokalisatie van katalytisch actieve NAAA in Muis Lungs door Fluorescentie Microskopiëren

LET OP: Gebruik male 8 tot 10 weken oude muizen en voer alle procedures in overeenstemming met de richtlijnen voor de ethische gebruik van dieren. Huis muizen in geventileerde kooien op een 12 uur licht / donker-cyclus en geef ze vrije toegang tot voedsel en water.

  1. Intraveneuze toediening van ARN14686 in Muizen
    1. Ontbinden ARN14686 in het voertuig: 15% PEG en 15% Tween-20 zoutoplossing. Bereken de oplossing concentratie overeenkomstig muisgewicht (dosis 3 mg / kg, injectievolume 5 ml / kg).
    2. Ga verder met de iv injectie van 3 muizen. Plaats elke muis in een geschikte plastic terughoudendheid apparaat. Plaats vervolgens de staart muis in warm water voor 2-4 minuten tot vaatverwijding mogelijk te maken en te injecteren de verbinding iv via de staartader.
    3. Injecteren 3 muizen iv met enige voertuig.
  2. Lung Collection en Slice Voorbereiding
    Waarschuwing: Behandel paraformaldehyde met zorg in een zuurkast, en draag handschoenen!
    1. Verdoven muizen met chloral hydraat (400 mg / kg). Bevestig anesthesie met een teen knijpen. Voer een transcardial perfusie als volgt:
      1. Oppervlakkig snijd de ventrale huid met een schaar en bloot de borstkas en peritoneale membraanoppervlakken.
      2. Oppervlakkig stuurde de peritoneale membraan met een schaar, net onder de xyphoid proces en bloot het middenrif en viscerale organen. Wees voorzichtig geen significante vaatstelsel niet te verscheuren.
      3. Open de borstholte door het snijden van het membraan van de ene laterale zijde naar de andere.
      4. Steek de 25 G naald verbonden met het geautomatiseerde spuitpomp en trekken 20 ml 0,9% zoutoplossing, gevolgd door 60 ml van 4% PFA in fosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4).
    2. Zodra de perfusie is voltooid, trekt het hart met behulp van een tang en zorgvuldig ontleden het uit. Pak de trachea met een tang en snijd volledig door gebruik van een schaar. Trek voorzichtig de luchtpijp naar boven en verwijder de longen van de ribbenkast. Ontleden het weefselscheiden de rechterlong van links.
    3. Postfix het weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur, bevriezen monsters koude 2-methylbutaan, en bewaar ze bij -80 ° C.
    4. Verzamel 40 urn secties met een cryostaat, zet onmiddellijk op objectglaasjes (één per vijfde) en verwerken voor immunohistochemie zoals hieronder beschreven.
  3. Tissue Slices Permeabilisatie en blokkeren
    1. Was met PBS (2 x 5 min) en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Was met PBS (2 x 5 min) en geblokkeerd met 3% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was met PBS (2x 5 min) en ga verder met CC.
  4. CC met azide-PEG3-Fluor 545 op Tissue Slices
    1. Bereid een oplossing door het mengen van de CC reagentia bereid zoals beschreven in hoofdstuk 2. 1 ml oplossing toe: 2 pl azide-PEG3-Fluor 545 (5 mM stock), 20 gl TCEP (vers bereide 50 mM stock), 58,8 pl TBTA (vers bereide 1,7 mM werkoplossing), 20 gl CuSO4 · 5H 2 O (50 mM voorraadoplossing), en 900 pl PBS.
    2. Voeg ongeveer 400 pi CC mix de weefselcoupes, die werden bereid volgens paragraaf 4.2. Let erop dat de gewenste hoeveelheid CC mengsel voldoende is om de plakken te dekken. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
    3. Was met PBS (1x gedurende 5 min), koude methanol (1 x gedurende 5 min) werd een oplossing van 1% Tween-20 en 0,5 mM EDTA in PBS (3 x 2 min), en PBS (1x gedurende 5 min).
    4. Air droog is, voeg een druppel antifade inbedmiddel met DAPI (zie Materiaal / Reagent Table), in de buurt met dekglaasjes (het vermijden van belvorming), en afdichting met polish. Bewaren bij 4 ° C tot analyse.
  5. Afbeeldingen verwerving
    1. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met een 546 nm en 450 nm excitatie lasers (zie Materiaal / reagens Table) volgendede handleiding.
    2. Selecteer een 60X objectief met NA = 1,40, en zorg ervoor dat de dia een voorbeeld door de oculairs en te focussen op een gebied van belang.
    3. Bepaal de verwervingsparameters volgens het monster en materiaal eigenschappen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ARN14686 is gemaakt op basis van de steiger van de NAAA inhibitor ARN726. De 4-butyl- cyclohexyl groep ARN726 werd gesubstitueerd met een C9 verzadigde alifatische keten die van een tag terminale alkyn (figuur 1). Het alkyn tag werd ingevoerd om het gebruik van een labelingsprocedure twee stappen laten een fluorofoor of biotine molecuul via CC voegen. Deze functie maakt ARN14686 een zeer veelzijdig instrument om NAAA onderzoeken in vitro en in vivo.

Hier tonen we twee toepassingen van ARN14686, die representatief zijn voor het potentieel van dit molecuul. Figuur 2 is een schema van de experimentele procedure hier gerapporteerd. Na intraveneuze toediening van de probe kunnen twee verschillende detectiemethoden worden gebruikt: i) analyse van actieve NAAA expressie van eiwit blot en ii) de analyse van actieve NAAA expressie en lokalisatie in cellen door fluorescence microscopie.

De eerste representatief resultaat werd onlangs gepubliceerd door onze groep 29. We analyseerden NAAA expressie in een rattenmodel van CFA geïnduceerde pootontsteking. De sonde (3 mg / kg) of vehikel werd iv geïnjecteerd in naïeve en CFA-behandelde ratten. De ratten werden 4 uur later gedood. CC werd uitgevoerd op verrijkte lysosomale extracten een biotine-label te introduceren op de-probe gelabelde eiwitten. Gebiotinyleerde eiwitten werden vervolgens verrijkt met behulp streptavidineparels. De geëlueerde eiwitten werden geanalyseerd door eiwitblot, waaruit blijkt dat de niveaus van actieve NAAA aanzienlijk verhoogd in de poten van ratten behandeld met CFA opzichte van die van controleratten (figuur 3). Het voordeel van eiwit blot analyse dat daardoor een gedetailleerd onderzoek van de probe-reactieve proteoom, die wordt gescheiden door gelelektroforese. Deze aanpak maakt het ook mogelijk voor de onthulling van potentiële probe off-targets. Een no-probe controle moet al zijnmanieren opgenomen om de endogene gebiotinyleerde eiwitten, die de experimentele achtergrond vormen sluiten. De pijlpunt in Figuur 3 blijkt dat dergelijke achtergrond eiwitten, die op hun beurt kunnen worden gebruikt als een lading referentiecontrole.

In een tweede gepubliceerde experiment (figuur 4), gebruikten we ARN14686 sonderen NAAA ex vivo detectie door fluorescentie microscopie. We ARN14686 toegediend aan muizen bij 3 mg / kg (iv) en opgeofferd ze 2 uur na behandeling transcardial perfusie. Longen werden verzameld, gefixeerd en bevroren in koude 2-metylbutane. De CC reactie voor fluorofoor toevoeging werd direct uitgevoerd op weefselcoupes van 40 urn dik, verzameld met een cryostaat. Analyse met fluorescentie microscopie toonde de aanwezigheid van katalytisch actieve NAAA in diffuus vesiculaire structuren behorende bij alveolaire macrofagen. Vergeleken met het gebruik van een eiwit-specifiek antilichaam, alleen eenctive enzym wordt waargenomen.

Figuur 1

Figuur 1:. ARN14686 synthese reactieschema undec-10-yn-2-ol werd geactiveerd door dipyridylcarbonate (DPC) in aanwezigheid van katalytisch 4-dimethylaminopyridine (DMAP) om een gemengde carbonaat produceren. Dit carbonaat werd vervolgens met de amino-lactam aan het doelmolecuul ARN14686 te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Workflow schema van de algemene strategie die in de huidige werk De sonde wordt geïnjecteerd in dieren (ratten of muizen) en target expressie wordt geanalyseerd volgende twee verschillende experimentele procedures: i) De gelabelde proteoom wordt gewonnen en biotine wordt toegevoegd door CC. Na verrijking fase van gebiotinyleerde eiwitten op streptavidine parels, worden probe doelen geanalyseerd door eiwitblot. ii) weefselcoupes bereid en een fluorofoor wordt toegevoegd door CC. Probe doel lokalisatie geanalyseerd door fluorescentie microscopie. Dit cijfer is aangepast van Bonezzi et al. 29 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3:. Analyse van NAAA activering in poten van CFA-behandelde ratten Protein blotanalyse van met streptavidine verrijkte eiwitten uit naïeve ratten (lanen 1 en 2) of CFA-geïnjecteerde ratten 7 dagen na injectie (lanen 3 en 4). Ratten ontvingen iv injecties van voertuig of ARN14686 (3 mg / kg). De blotting membraanwerd onderzocht met een fluorescent streptavidine. De pijl geeft de NAAA band; de pijlpunt geeft een biotinebevattende band van ongeveer 90 kDa, waaruit blijkt dat een gelijke hoeveelheid eiwit in elke laan werd geladen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Bonezzi et al. 29 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4: Ex vivo detectie van gemerkte probe NAAA in muizenlongen door fluorescentiemicroscopie Representatieve Foto longsecties van voertuig- (A) of ARN14686 geïnjecteerd (B) muizen na CC met azide-PEG3-Fluor 545 gerapporteerd.. Een positief signaal (rode bloedcellen) werd gedetecteerd in ARN14686 geïnjecteerde muizen, terwijl er geen signaal werd gedetecteerd in v-Oertuig toegediend muizen. Een detail van een azide-PEG3-Fluor 545 positieve alveolaire macrofaag wordt getoond in C bij een grotere vergroting. Kernen werden gemarkeerd met DAPI (blauw). Schaal bar = 50 micrometer in A en 10 micrometer C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Enzymactiviteit fijn gereguleerd op verschillende niveaus, zoals RNA transcriptie, eiwitsynthese, eiwittranslocatie, post-translationele modificatie en eiwit-eiwit interactie. Vaak enzymexpressie alleen houdt geen rekening met de activiteiten. ABPP werd ontwikkeld om de activiteit van eiwitten te bestuderen in hun natieve toestand. Twee functies nodig: een chemische probe die covalent bindt aan de actieve plaats van een enzym van belang en een reporter tag aan de probe gelabeld enzym detecteren.

Probe-ontwerp en synthese kritische punten van de procedure. De sonde moet voldoende affiniteit en selectiviteit voor zijn doel te hebben. Bovendien moet de aanwezigheid van een verslaggever tag geen invloed op richten engagement. Dit probleem wordt grotendeels opgelost door het ontwerp van een tweestaps ABP, waarbij de reporter tag wordt ingevoerd na het doel is gevangen. Label-free probes zijn bijzonder geschikt voor in vivo studies waarin eiwitactiviteitkan worden geëvalueerd in een levende cel of organisme, met minimale externe verandering. De NAAA probe ARN14686 werd ontworpen om de bovengenoemde eisen te voldoen. De β-lactam reactieve kernkop werd gekozen op basis van eerdere resultaten verkregen met de β-lactam klasse NAAA remmers 16,26. Deze verbindingen remmen NAAA in een krachtige en selectieve wijze door covalente binding aan het katalytische cysteïne van het enzym. Bovendien werden de verbindingen getoond systemisch actief 16 is. Introduceerden we een C9 verzadigde alifatische keten, rekening houdend met de verhoogde affiniteit van NAAA lange alifatische ketens. Een aansluitpunt alkyn werd toegevoegd om het tweestaps labeling.

Een andere belangrijke stap is het selecteren van de dosis en de tijd voor in vivo toediening. Dit is afhankelijk van de stabiliteit van de sonde in plasma, zijn doel affiniteit en de selectiviteit. De juiste dosis moet worden gekozen om voor doel vast te leggen terwijl het vermijden van betrokkenheid van de possible off-targets. We vonden dat 3 mg / kg iv ARN14686 was optimaal NAAA selectief vangen. Hogere doses resulteerde in de vangst van de homologe cysteïne amidase, zuur ceramidase. Wat behandelingsduur bij het onderzoek goed doorbloede organen, zoals longen, kan een korte tijd (2 uur) voldoende om de probe te reageren met het doelwit. Voor poten, maar werden we verplicht om de reactietijd te verdubbelen.

Een mogelijk probleem in target analyse door eiwitblot is door de aanwezigheid van natuurlijk gebiotinyleerde eiwitten. Deze zullen onvermijdelijk dat geïdentificeerd specifieke probe doelen. We vonden dat de invoering van een preclearing stap met streptavidine kralen voor het uitvoeren van CC sterk gegroeid in de kwaliteit van onze resultaten. Anderzijds kan de aanwezigheid van natieve gebiotinyleerde eiwitten worden gebruikt om te controleren op mogelijke belading artefacten. Tenslotte, met betrekking tot lokalisatie studies van fluorescentiemicroscopie, is het zeer belangrijk om in de gaten probe selectiviteit omdat, in tegenstelling eiwit vlekken, fluorescentiemicroscopie niet het onderscheid van het doel mogelijk te maken van off-targets. Voorlopige selectiviteit studies moeten worden uitgevoerd om de haalbaarheid te evalueren en voor het opzetten van een optimale experimentele omstandigheden.

Beperkingen van de beschreven techniek voornamelijk betrekking op de noodzaak te voorkomen dat de experimentele omstandigheden CC reactie kan beïnvloeden, zoals het gebruik van detergenten en amine bevattende buffers. Deze aspecten moeten worden genomen om rekening te houden bij de voorbereiding van een cellysaat of weefsel homogenaat. Bovendien, wanneer een streptavidine verrijking fase vereist is, de hoeveelheid uitgangsmateriaal vormt een ander probleem, omdat deze procedure is alleen van toepassing wanneer het eiwitgehalte ten minste 250 ug. Deze limiet ingesteld vanwege technische problemen, zoals het werken volumes eiwit herstel na-CC geïnduceerde precipitatie, en de hoeveelheid streptavidine te gebruiken hars.

Previously, kon NAAA alleen activiteit geëvalueerd door het uitvoeren activiteit assays die het gebruik van een activering buffer voor de in vitro activatie van het enzym en substraat solubilisatie 14 vereisen. Deze benadering levert gegevens betreffende NAAA expressie niet om de aanwezigheid van actieve NAAA. Een andere mogelijkheid is weefselconcentraties van PEA en OEA meten, maar deze methode vertegenwoordigt slechts een indirecte manier NAAA activiteit 34,35 evalueren. Bovendien kan FAE niveaus worden beïnvloed door andere factoren zoals biosynthese. De chemische probe ARN14686 is de eerste ABP voor NAAA. De hier beschreven protocol illustreert een eenvoudige procedure voor het vastleggen en visualiseren van de actieve vorm van NAAA, zowel in vitro als in vivo. Alle monster manipulaties zijn na probe-target reacties, waardoor betrouwbare informatie over de in vivo toestand van het enzym geven. Bovendien is het gebruik van ARN14686 fluorescentiemicroscopie vertegenwoordigt een uniek instrument to lokaliseren actief NAAA. Verkrijgbare antilichamen, die NAAA katalytische subeenheid herkent geen onderscheid tussen de NAAA full-length pro-enzym en de actieve enzym.

Uitgaande van de hier beschreven protocol, kan NAAA expressie en activering worden geanalyseerd in verschillende cellijnen en diermodellen van ontsteking. Co-localisatie studies kunnen worden uitgevoerd om beter te karakteriseren de rol van NAAA in fysiologische en pathologische omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole  Sigma Aldrich 367818 Harmful
2-dipyridylcarbonate Fluorochem 11331 Harmful
2-Methylbutan Sigma Aldrich M32631 Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine Sigma Aldrich 107700 Toxic
Acetic acid Sigma Aldrich 695092 Flammable, Corrosive
Acetonitrile  Sigma Aldrich 34998 Flammable, Toxic
Activated charcoal Sigma Aldrich 161551
Ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 Harmful
Azide-PEG3-Biotin Jena Biosciences CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545 Jena Biosciences CLK-AZ109
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227
Bio-spin columns Biorad 732-6204
Biotin Sigma Aldrich B4501
Blocking buffer Li-Cor Biosciences 927-40000
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250 Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA) Sigma Aldrich A7030
Bromophenol blue Sigma Aldrich B0126
Bruker Avance III 400 Bruker
Celite Sigma Aldrich 419931 Health hazard
Ceric ammonium nitrate  Sigma Aldrich 22249 Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate Sigma Aldrich C8383 Higly toxic
CuSO4.5H2O  Sigma Aldrich 209198 Toxic
Cyclohexadiene Sigma Aldrich 125415 Flammable, Health hazard
Cyclohexane Sigma Aldrich 34855 Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane Sigma Aldrich 34856 Harmful, Health hazard
Diethyl ether Sigma Aldrich 296082 Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Acros Organics 348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) Sigma Aldrich 175943
Ethanol Sigma Aldrich 2860 Flammable, Harmful
Ethyl acetate Sigma Aldrich 34858 Flammable, Harmful
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Irdye 680-LT Streptavidin Li-Cor Biosciences 925-68031
IRDye680-LT Streptavidin  Licor 925-68031 Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol Sigma Aldrich 34966 Highly toxic
Methanol Sigma Aldrich 34860 Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma Aldrich E7750 Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine Sigma Aldrich D125806 Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide Sigma Aldrich 227056 Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine Fluorochem M03053 Harmful
Nikon A1 confocal microscopy Nikon Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel Thermo Fisher Scientific NP0335BOX
Palladium on carbon Sigma Aldrich 330108
p-anisidine Sigma Aldrich A88255 Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde sigma Aldrich 441244 Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)  Sigma Aldrich P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI  Thermo Fisher Scientific P36931 Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich P8340
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)  Sigma Aldrich L3771 Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride  Sigma Aldrich 452912 Flammable
Sodium sulfate Sigma Aldrich 239313
Starion FLA-9000 immage scanner FUJIFILM Read  the user manual
Streptavidin agarose Thermo Fisher Scientific 20349
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Tert-butanol Sigma Aldrich 360538 Toxic, flammable
Tetrahydrofuran Sigma Aldrich 186562 Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea Acros Organics 424542500 Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris Sigma Aldrich RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Sigma Aldrich C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
Triton-x100 Sigma Aldrich X100 Toxic
Tween-20 Sigma Aldrich P9416
Tween-80 Sigma Aldrich P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer IKA
Undec-10-yn-1-ol Fluorochem 13739 Harmful
Urea Sigma Aldrich U5378 Toxic, warm at 50 °C to dissolve

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Tags

Biochemie activity-based eiwit profiling activity-based sonde klik chemie, ontsteking fluorescentiemicroscopie
voorbereiding en<em&gt; In Vivo</em&gt; Gebruik van een Activity-based Probe voor<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Acid amidase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S.,… More

Romeo, E., Pontis, S., Ponzano, S., Bonezzi, F., Migliore, M., Di Martino, S., Summa, M., Piomelli, D. Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase. J. Vis. Exp. (117), e54652, doi:10.3791/54652 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter