Abstract
Pasienter med et begrenset antall levermetastaser og langsomme satsene for progresjon kan bli vellykket behandlet med lokal behandlingsmetoder 1,2. Men lite er kjent om heterogenitet av levermetastaser, og dyremodeller som er i stand til å vurdere utviklingen av de enkelte metastatiske kolonier nødvendig. Her presenterer vi en avansert modell av levermetastaser som gir muligheten til å kvantitativt visualisere utvikling av individuelle tumor kloner i leveren og anslå deres vekstkinetikk og kolonisering effektivitet. Vi ga en panel av monoklonale derivater av HCT116 menneskelige kolorektal kreft celler stabilt merket med luciferase og tdTomato og besittelse av ulike vekstegenskaper. Med en milt injeksjon etterfulgt av en splenektomi, de fleste av disse kloner er i stand til å generere levermetastaser, men med forskjellige frekvenser av kolonisering og varierende vekstrater. Bruk av in vivo avbildning system (IVIS), er det mulig å visualisere og kvantifisere metastaseutvikling med in vivo luminescerende og ex vivo fluoriserende billeddannelse. I tillegg Diffus Luminescent Imaging tomografi (DLIT) gir en 3D-fordeling av levermetastaser in vivo. Ex vivo fluoriserende billeddannelse av høstet lever gir kvantitative målinger av individuelle hepatiske metastatiske kolonier, slik at for evaluering av frekvensen av leveren kolonisering og vekstkinetikk av metastaser. Siden modellen er lik klinisk observerte levermetastaser, kan det tjene som en modalitet for påvisning av gener assosiert med levermetastaser og for testing av potensielle ablativ eller adjuvant behandling for levermetastatisk sykdom.
Introduction
Pasienter med levermetastaser fra primær kolorektal kreft (CRC) er preget av en dårlig prognose. Den 5-års overlevelse for primære metastatisk CRC (stadium I - III) er beregnet som 75 - 88% 3,4, mens pasienter med levermetastaser (stadium IV) har en 5-års overlevelse på bare 8-12% 5 6. Men metastatiske pasienter representerer en heterogen gruppe, presentere med forskjellige antall metastaser og ulike tilbakefall ganger. Kliniske observasjoner indikerer at antallet av metastaser (som kan være proporsjonal med kolon evne eller frekvens for kolonisering) og størrelsen av en enkelt metastaser (proporsjonal med den lokale vekst) er uavhengige prognostiske faktorer 1,7. Med andre ord, suksess for metastatisk kloner colonizing leveren er avhengig av to viktige egenskaper: deres evne til å vokse og deres evne til å formidle og overleve i leveren mikromiljøet.
Designetav vellykkede kliniske modeller med evne til å fange og kvantifisere egenskapene til metastatiske kloner kan drastisk forbedre vår forståelse av levermetastaser biologi og gi et effektivt verktøy for design av potensielle terapeutiske tilnærminger. Modeller av eksperimentell levermetastaser har tidligere blitt rapportert 8,9, men ingen av dem gitt evnen til kvantitativt å fange opp og beskrive egenskapene til de enkelte metastatiske kloner både in vivo og ex vivo.
Her presenterer vi en ny, avansert modell av levermetastaser som inkluderer generering av kreft kloner med forskjellige lever kolonisering effektivitet og vekstegenskaper. Vi har anvendt en kombinasjon av to-merking av kreftceller med luciferase og tdTomato fluorescerende protein med generering av monoklonale cellelinjer som har iboende forskjeller i metastatisk kapasitet. I denne eksperimentelle modellen dataene tyder på at utvikling avlevermetastaser kan beskrives i form av kolonisering frekvens og dobling tid (Td), som er konsistent med kliniske observasjoner. Den kvantitative natur denne modellen gjør det lett adoptable for medisiner og diagnostiske formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Chicago (protokoll # 72213-09) og utføres under sterile forhold.
1. Forberedelser
- Gjør 500 ml medium for kultur av HCT116 tumorceller: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, og 100 mg / ml streptomycin.
- Autoklav instrumentene som skal brukes til milten injeksjonsmodell, inkludert 3 - 4 kirurgiske håndklær, gasbind, to små Adson pickups, en nål driver, to par saks, en liten klemme, og 3 microclips, ved 251 ° C i 20 min .
- Forberede postoperativ anestesi for mus, som skal administreres subkutant følgende milten injeksjon. Fortynnet 2-4 mikrogram av buprenorfin i 500 mL av 0,9 fysiologisk saltvann per mus.
- Forbered porsjoner av 150 mikrogram / 150 mL av Firefly luciferin for intraperitoneale injeksjoner During bioluminescence analyser. Oppbevares ved -20 ° C og beskyttes mot lys.
2. Generering av luciferase / tdTomato merkede Monoklonale cellelinjer 10,11
- Tine og vedlikeholde HCT116 humane tykktarmskreftceller og 293ft humane embryonale nyreceller i DMEM med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, og 100 mg / ml streptomycin. Oppretthold i kultur ved 5% CO 2 og 37 ° C.
- Lag en høy titer lentivirus.
- På D-en, plate 10 - 12 x 10 6 293ft celler mellom passasje 3 og 10 i 15 cm cellekulturskåler i 18 ml komplett DMEM (cDMEM) med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, og 1% ikke-essensielle aminosyrer . Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2.
- På D 2, transfektere cellene ved hjelp av følgende transfeksjon løsning:
- For hver rett, bruker du følgende: en DNA blanding av 37,5 mikrogram pFUG lentiviral vektor innsatt med luciferase (Luc2) og tdTomatokonstruerer 11 (en gave fra Dr. Geoffrey Greene ved University of Chicago), 25 ug pCMVΔ8.74, og 12,5 ug pMD2.G resuspendert i totalt 1062 ul sterilt H2O Legg 188 pl 2 M CaCl2.
- Legg 1,250 mL av 2x Hepes-bufret saltvann (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na2 HPO 4, og 180 mM NaCl, pH 7,12) til DNA / CaCl2-løsning, en dråpe om gangen, mens blåse bobler gjennom oppløsning med en pipette.
- Inkuber ved RT i 20 min, og deretter legge til 15,5 ml av RT cDMEM og klorokin for å lage en endelig konsentrasjon på 25 uM.
- Aspirer media i hver tallerken av 293ft celler og erstatte med transfeksjon løsning. Legg 16 ml av transfeksjon oppløsningen langsomt, ettersom de belagte cellene lett løsne.
- På D3, etter 8-16 timer, fjern transfeksjon løsning og vaske cellene en gang med Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS), igjen taking seg ikke å løsne cellene. Bytt ut media med 18 ml av fersk cDMEM med 10 mM Hepes.
MERK: Beveg retter, aspirer transfeksjon løsning, og legge til mediene gjennom sideveggen av plater for ikke å løsne cellene. - På D 4, etter 48 timer fra tidspunktet for transfeksjon, samle media fra oppvasken ved å aspirere langsomt med en pipette for ikke å løsne cellene. Sentrifuger de innsamlede media ved 300 xg i 5 minutter for å felle ut store cellerester.
- Filtrer den virale supernatanten ved bruk av en 0,45 um lav-protein-bindende filter kolbe og sentrifuge ved anvendelse av en SW-28 rotor i 2 timer ved 50 000 xg og 4 ° C. Dekanter supernatanten umiddelbart etter sentrifugering utførelser og tørk innsiden av røret med vindusviskere.
- Resuspender viral pellet i 50 mL av Redusert Serum Medium (RSM) med 1% FBS. Aliquoter kan oppbevares ved -80 ° C for fremtidig bruk (viral lager).
- Transduce den lentiviruses inn i HCT116-celler og generere et panel av tdTomato-positive kloner.
- Plate HCT116-celler ved en tetthet på 1 x 10 5 i 24 brønners plater 1 d før virusinfeksjon.
- Fortynn 40 ul av resuspenderte virus (fra 2.2.7) i 4 ml RSM (1: 100 fortynning) med 1% penicillin / streptomycin og 8 mikrogram / ml polybren (CRSM).
- På dagen for smitte, vaske cellene gang med DPBS, og deretter legge til 250 mL fortynnet virus fra trinn 2.3.2 til hver brønn. Inkuber i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2, og deretter tilsett 1 ml cDMEM til hver brønn; Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 48-72 timer.
- Suspender cellene med 1 ml 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA, og deretter legge til 1 ml cDMEM å nøytralisere trypsin. Overfør cellene til et mikrosentrifugerør og pellet ved 300 xg i 4 min. Vask pelleten 3x i 1 ml Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) pluss 2% FBS.
- Resuspender pelleten fra trinn 2.3.4med FACS-buffer (2% FBCS og 2 mM EDTA i PBS) inn i en enkeltcellesuspensjon ved 1 x 10 6 celler / ml.
- Sortere tdTomato-positive HCT116 cellene ved hjelp av en celle sorter, gating for PE-positive celler (eksitasjon / emisjon: 556/585 nm). Dyrke de oppsamlede celler i en 10-cm plate ved 5% CO2 og 37 ° C for å generere sperre tdTomato-positive HCT116-celler (Figur 1a).
- Suspender foreldre tdTomato-positive HCT116-celler fra 2.3.6 med 8 ml av 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA for 3-5 minutter, og deretter legge til 8 ml cDMEM å nøytralisere trypsin.
- Overfør cellene til et 50 ml rør og pellet ved 300 xg i 4 min. Fjern supernatanten og fortynne foreldre tdTomato-positive HCT116-celler til en celle per 200 mL i cDMEM (figur 1B).
- Plate en enkelt celle (200 ul av fortynningen) per brønn i en 96-brønners plate ved 5% CO2 og 37 ° C (figur 1C).
- Grow individuelle monoclones i kolber på 5% CO 2 og 37 ° C. (Figur 1D).
3. Kalibrering av Fluorescent signalintensitet som en funksjon av celle nummer
- Plate de transfekterte HCT116-celler, nå referert til som HCT116-L2T, ved en tetthet på 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 til 4, og 10 5-celler / brønn i 96-brønners plater i tre paralleller for hver tetthet.
- Etter 5 timer inkubasjon kvantifisere tdTomato fluorescerende intensiteter bruker IVIS 10.
- Klikk på bildet for programvare-ikonet på skrivebordet for å starte programmet. Klikk på "Initialize" -knappen for å initialisere imaging system. Etter operasjonen er fullført (som tar ca noen min), velg "fluorescens", "fire andre" eksponeringstid, "Medium" binning, "2" F / stop, "535" eksitasjon filter,og "580" utslipp filter.
- Plasser 96-brønners plate på bilde stasjonen og klikk på "Acquire" for å starte bilde. Når bildet er ervervet, klikk på "ROI Tools" i verktøypaletten og velger 12 x 8 fra spalten ikonet.
- Lag 12 x 8 åpninger for å dekke området signal på bildet av den 96-brønners plate og klikker på kategorien målinger. Observere et vindu med en tabell over ROI målinger med enheter av fotoner pr s per steradian per kvadrat cm (fotoner / s / sr / cm 2).
- Konstruere et spredningsplott med argumentet (X-akse) lik antallet av celler og funksjonen (y-aksen) som representerer signalintensitet. Beregn regresjonskurver ved hjelp av en dataanalyse-programvare for å beregne mengden av cellene svarende til den enhet av fluorescerende intensitet (figur 2) 10.
4. dyremodell av levermetastaser
- Når HCT116-L2T celler nå 70- 80% konfluens, forberede dem omtrent en time før milten injeksjon. Dissosiere cellene ved bruk av 0,05% trypsin i 0,53 mM EDTA i 3 - 5 minutter, og deretter nøytralisere dem med en lik mengde cDMEM. Sørg for å pipettere grundig for å unngå klumper.
- Tell cellene med en automatisk celleteller.
- Resuspender cellene i 1x DPBS til en konsentrasjon på 1,2 - 2 x 10 6 celler / 100 ul. Sørg for å pipette og resuspender cellene grundig for å unngå klumper.
- Hold cellene på is inntil injeksjon, noen ganger resuspending dem i røret.
- Før bedøvelse musene, tilveiebringe en preoperativ bedøvelse og væske bolus ved subkutan injeksjon av 500 ul av buprenorfin blandingen som er beskrevet i trinn 1,3. Administrere samme dose ekstra buprenorfin blandingen to ganger om dagen inntil tegn på smerte (redusert bevegelighet, sammenkrøket vekst, unnlatelse av å stelle, stemmebruk når håndteres) har løst.
- Anesthetize 6- til 8-ukers-gamle kvinnelige atymiske nakne mus med 2% isofluran i oksygen i en anestesi kammer. Kontroller at mus er helt under anestesi ved å knipe halen. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Overfør hver bedøvet mus til et individ nesekonusen for milten injeksjon. Før snitt, bør hver mus være dekket med et sterilt operasjonslaken.
- Identifiser milten som en lilla område sett eksternt gjennom huden på venstresiden av nakne mus. Ved hjelp mikrodisseksjon saks, lage en 8 mm venstrekanten snitt på huden like over milten.
- Neste, løft opp på bukveggen og lage et lite snitt. Slipper luft inn i bukhulen, slik at de indre organene beveger seg bort fra snittstedet. Utvid bukveggen snitt til ca 5 mm.
- Expose milten ved forsiktig å presse rundt snittet med en bomullspinne. Ved behov kan bukspyttkjertelen fett være forsiktig mannipulated å hjelpe med eksponering for ikke å skade milten.
- Sakte injisere 100 ul av celler ved anvendelse av en 1 ml sprøyte med en 27 G nål inn i spissen av den eksponerte milten. Injiser langsomt, over en periode på minst 30 - 60 s, for å unngå ekstra levertumorer.
- Plasser en microclip på milten før kanylen fjernes ved slutten av injeksjonen for å forhindre lekkasje av den injiserte cellesuspensjonen.
- La microclip på plass i 5 min.
- 5 min postinjection, utføre en splenektomi ved hjelp av en håndholdt kirurgi enhet for hemostase. Dissekere milt hilum, fra fremre side. Når dissekere store fartøyer, pre-koagulere proksimale siden av fartøy med tilstøtende fettvev, ved hjelp kirurgi for å unngå overdreven blødning.
MERK: Metoder for hemostase: koagulere blødningen punkt direkte med kirurgi, legg press på blødning punkt for 3-5 min, eller sutur-ligere blødningen poenget med en 5-0 silkeslips. Lukke flanke snittet av hver mus i to lag. Først, lukker bukveggen med en 5-0 absorberbare flettet sutur (f.eks Vicryl) i en enkelt horisontal søm. Deretter lukker huden ved hjelp av en 4-0-absorberbare monofilament sutur (f.eks prolene), igjen med en eneste horisontal søm. - Rengjør alle instrumenter ved å spraye 70% isopropanol for å opprettholde sterile forhold mellom hver prosedyre.
MERK: Pass på at dyrene blir varmet mens de våken fra anestesi. Overvåke alle mus postoperativt før de blir ambulerende og gå tilbake til normal aktivitet. Vanligvis er restitusjonstiden ca 3-5 min. Ikke la dyrene uten tilsyn før de har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert.
5. I Vivo Bioluminescent Imaging
- Utfør bildebehandling påen ukentlig basis for å måle og kvantifisere forandringer i bioluminescens over tid.
- Plasser mus i en anestesi kammer og bedøve dem med 2% isofluran i oksygen. Kontroller at mus er helt under anestesi ved å klemme halene. Bruk dyrlege salve på øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi.
- Deretter intraperitonealt injisere hver mus med 150 mL av preprepared Firefly luciferin fra trinn 1.4.
- Plasser mus i en IVIS med individuelle nese kjegler administrasjon isofluran. Plasser mus i liggende stilling med avstandsholdere mellom å minimere signal til tilstøtende mus. Maksimalt fem mus kan avbildes på en gang.
- Mål og analysere bioluminescent intensiteter tre minutter etter luciferin injeksjon.
- Etter initialisering IVIS som beskrevet i trinn 3.2.1, velg "Selvlysende", "en andre" eksponeringstid, og "Medium" binning.
- Klikk på "Hent" -knappen for å starte Tenk degg. Sørg for å utføre hver avbildning på en konsekvent tid (3 min) etter luciferin injeksjon.
- Når bildet er ervervet, vil et bilde vindu og verktøypaletten. Klikk "ROI Verktøy" og velg "1", "2", "3", "4", eller "5" fra sirkelen ikonet, som tilsvarer det antall mus avbildes.
- For å definere områder av interesse (Rois), sirkel signal område av selvlysende signal i bukhulen på mus, og klikk deretter "målinger" av avkastningen som en vilkårlig enhet av strålende effektivitet ((fotoner / s / cm 2 / steradian) / (μW / cm 2)). Sørg for å ha en ekstra avkastning sirkel av bakgrunnen.
- På fire uker etter injeksjon og før dyreoffer, utføre Diffuse Lysende Imaging Tomography (DLIT) bruker IVIS å vurdere tumorbelastning og fordeling ved hjelp av sanntids 3D-rekonstruksjon av bioluminescent intensiteter av individuelle tumor kolonier.
- Etter initialisering IVIS, som beskrevet i trinn 3.2.1, velg "Imaging wizard", "Bioluminesens", og klikk "Next". Velg "DLIT" og klikk "Next". Velg "Firefly" prober og klikk "Next". Velg "mus" image emnet, "Auto" eksponering parameter, "C-13 cm" synsfelt, og "0,5 cm" emne høyde, og klikk "Next". Klikk på "Acquire" -knappen for å starte bilde.
- Når bildet er ervervet, velg "DLIT 3D Rekonstruksjon" fanen og "Analyze" og klikk "Bygge" for å generere 3D-rekonstruksjon bilde.
- Klikk "Verktøy" og "3D animasjon". Velg "Spin CCW på Y-aksen" i animasjonsvinduet 3D. Klikk på "Record" og "Lagre" i en .mov format fil.
6. Ex Vivo Fluorescent Imaging
- Offer musene ved halshugging, mens bedøvet, eller i henhold til institusjonelle retningslinjer på 4 - 6 uker etter milt injeksjoner.
- Høste leveren. Lag en horisontal snitt fra venstre til høyre flanke. Griper xiphoid prosessen med en pickup, dissekere falciform, nedsatt blodåre, og vena cava inferior.
- Dissekere rett hepatorenalt ligament, den hepatoduodenal ligament, og den venstre hepatorenalt ligament, tar seg ikke å skade caudatus lapp mens dissekere hepatoduodenal ligament. Etter høsting leveren, fjerne galleblæren, da dette vil vise autofluorescence. Noter eventuelle ekstra ekstra leversvulster stede.
- Legg merke til tall og størrelser av leversvulster stede makroskopisk, og plasser høstet lever i DPBS.
MERK: Svulster er makroskopisk synlige for det blotte øyesom hvite tumorer (for et representativt eksempel, se figur 4). - Før plassering på bilde ark, ta hver lever og forsiktig fjerne overflødig væske av blotting på et papirhåndkle.
- Mål fluorescerende intensiteter fra hver svulst koloni med IVIS.
- Velg "fluorescens", "4 sekunder" eksponeringstid, "Medium" binning, "2" F / stop, "535" eksitasjon filter, og "580" utslipp filter. Klikk på "Acquire" -knappen for å starte bilde.
- Etter henting av bildet, finn bildevinduet og verktøypaletten. Klikk "ROI Verktøy" og velg "1" fra sirkelikonet. Å definere Rois, sirkel signal område av individuelle tumor kolonier på bildet, og klikk deretter på "målinger" av avkastningen som en vilkårlig enhet av strålende effektivitet ((fotoner / s / cm 2 / steradian) / (μW / cm 2) ). Sørg for å ha en ekstra avkastning sirkel av bakgrunnen.
- Beregne den totale tumorvolumet ved å anta at det skal være en kule. Tumorvolum = 4 x π xr 3/3 (r = radius). Beregn fraksjon av tumorkolonidannende celler (FC) som antall tumorer i leveren dividert med antall celler splenically injisert.
- Beregn det totale celle nummer per koloni (= X) fra lineær tilnærming fra trinn 3.3. Beregn antall celledelinger (= Y) som Y = log 2 X og Td som Td (dag) = 28 / Y.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med dette eksperimentet var å etablere en konsistent og lett reproduserbar dyremodell med potensial for den serielle kvantifisering av in vivo metastatisk tumorbelastning og for estimering av den koloniserende frekvens og vekstkinetikk for utvikling av levermetastaser. Figurene 2-6, med legender, finnes fra vår forrige publisering under en Creative Commons CC-BY-lisens 10.
Generering av Double-merket Tumor Cell Monoclones
Først ble et panel av selvlysende og fluorescerende merkede monoklonale cellelinjer ble generert med forskjellige metastatiske egenskaper. Etter vellykket transfeksjon av selvlysende (Luc2) og fluoriserende (tdTomato) proteiner i foreldre HCT116 kolorektal kreft celler, ble 16 doble-merket monoclones generert ved å fortynne foreldre HCT116-L2T celler til en celle / 200 ul i 96 brønners plater (figur 1) 10. In vitro-fluorescens og luminescens fra HCT116-L2T ble deretter kvantifisert ved anvendelse av en økende mengde av celler for å beregne antall tumor celler fra in vivo og ex vivo levertumor imaging (figur 2) 10.
Metastaser Utvikling av Kloner med Differential Liver Colonization
Ved siden av, for å generere levermetastaser, de 16 tidligere genererte enkelt HCT116-L2T kloner ble intrasplenically injisert i mus; splenektomi ble deretter utført. Utviklingen av levermetastaser ble overvåket av ukentlig in vivo bioluminescent bildebehandling, etterfulgt av ex vivo fluorescerende avbildning etter ofre musene. Ut av de 16 monoclones generert, valgte vi kloner utpekt som P1, P2, O1 og O2, på grunn av deres different observert kolonisering og vekstmuligheter i leveren. Klonene O1 og O2 hadde en mindre svulst byrde, som representerer "oligometastatic" kloner, og potensielt rekapitulere en fenotype av begrenset metastatisk sykdom. Kloner P1 og P2 hadde et større tumorbyrde, som representerer stor utbredelse, som også er referert til som polymetastatic sykdom. Bioluminescens var høyere i P1 og P2 mus (6,7 x 10 6 ± 4.7 x 10 6 og 3,6 x 10 6 ± 2.5 x 10 6 fotoner / s / cm 2 / steradian) sammenlignet med den O1 og O2-mus (2,0 x 10 5 ± 1,3 × 10 5 og 1,7 × 10 5 ± 9,1 × 10 4 fotoner / s / cm 2 / steradian) 3 uker etter milten injeksjon (figur 3A, B) 10. Kvantifisering av ex vivo fluorescens av leveren ved 4 uker etter injeksjonen milten viste at P1 og P2 lever hadde høyere Fluorescerendecent intensiteter sammenlignet med O1 og O2 lever (Figur 3C). Tumor distribusjoner i ex vivo fluorescerende bildene var i samsvar med makroskopiske funn (figur 3C, D) 10.
Kolonisering og vekst Kinetics av individuelle kloner
Antallet og størrelsene av tumorer visualisert makroskopisk ble talt opp og målt i hvert enkelt leveren. I tillegg ble ex vivo fluorescens-avbildning gjort på hver enkelt svulst koloni for hver monoclone (figur 4) 10. Det totale antall tumorer i P1 var høyere, i forhold til P2, O1 og O2, samtidig som størrelsen av tumorer var større i P2 enn i P1, O1 og O2 (p <0,001; figur 5A, B) 10. Det totale tumorvolumet i leveren i P1 og P2 var større i forhold til O1 og O2 (figur 5C)
3D fordeling av metastatiske svulster i lever ble demonstrert ved DLIT (figur 6) 10. Ved hjelp av denne avbildningsteknikk, er det mulig å overvåke romlig-temporal dynamisk oppførsel av metastaser ved påvisning og måling av bioluminescence enkelte levermetastatiske kolonier.
Dataene generert ble analysert ved hjelp av standard dataanalyse-programvare, og feilstolper ble vist som gjennomsnitt ± standardavvik. Pearsons korrelasjons- koeffisienter ble brukt for å evaluere forbindelser mellom parametrene. P-verdier ble vurdert ved bruk av 2-tailed Student t-test, med en p <0,05 ansett for å være statistisk signifikant.
Figur 1:. Generering av et panel av Monoclones av merket HCT116-celler (A) Grow foreldre HCT116 celler merket med luciferase og tdTomato. (B) Fortynn foreldre HCT116-celler til en celle / 200 mL. (C) Plate 200 ul av fortynningen i en 96-brønners plate. (D) Grow monoclones fra hver brønn i 96-brønners platen. (E) Sprøyt monoclones intrasplenically i mus for å generere levermetastaser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Beregning av antall celler etter Fluorescent Intensitet (A) Et luminescerende bilde av forskjellige antall celler triplicated i en 96-brønners plate.. (B) Korrelasjonen mellom antall celler og luminescens (R = 0,99, p <0,0001). Målestokk representerer lysende intensitet (fotoner / s / cm 2 / steradian). (C) Et fluoriserende bilde av forskjellige antall celler triplicated i en 96-brønners plate. intensiteter vire ervervet som strålende effektiviteten med en 535 nm eksitasjon og 580 nm emisjon. (D) Korrelasjonen mellom antall celler og fluorescens (R = 0,99, p <0,0001). Skalaen linjen representerer den fluorescerende intensitet i en vilkårlig enhet av strålingseffektivitet ((fotoner / s / cm 2 / steradian) / (μW / cm 2)). Gjengitt med tillatelse ti. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Bioluminesens og E x Vivo Fluorescens av leveren i valgte Clones (A) Representative bioluminescent bilder.. Målestokk representerer lysende intensity (fotoner / s / cm 2 / steradian). (B) Bioluminesens målt ukentlig fra 1 - 3 uker i P1 og P2, og 1 - 4 uker i O1 og O2. Data ble representert som gjennomsnittet ± standardavvik. (C) Representant ex vivo fluorescerende bilder av lever. Intensiteter ble ervervet som strålende effektiviteten med en 535 nm eksitasjon og 580 nm emisjon. Målestokken representerer fluorescerende intensitet i en vilkårlig enhet av strålingseffektivitet ((fotoner / s / cm 2 / steradian) / (μW / cm 2)). (D) Makroskopiske lever bilder (piler indikerer små hvite svulster). P1 og P2: polymetastatic kloner, O1 og O2: oligometastatic kloner. Gjengitt med tillatelse ti. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Kvantifisering av Fluorescent intensiteter av Individuell Liver Colonies bilder på venstre er representative makroskopiske funn og bilder til høyre er fluorescerende intensiteter i hver klone. De fluoriserende intensiteter ble ervervet som strålende effektiviteten med en 535 nm eksitasjon og 580 nm emisjon. P1 og P2: polymetastatic kloner, O1 og O2: oligometastatic kloner. Gjengitt med tillatelse ti. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Kvantitativ Estimering av kolon Evne og vekst Kinetics (
Figur 6: Quantificatipå av Bioluminesens av individuelle Tumor Colonies bruker Diffuse Lysende Imaging Tomography (DLIT). (A) 3D fugleperspektiv. Målestokk representerer fluorescerende intensiteten i en vilkårlig enhet av strålende effektivitet. (B) Koronale delen. (C) sagittal delen. (D) transaksialtomografiscanner delen. (E) Makroskopisk bilde av leveren. (F) Ex vivo fluorescens bilde av leveren. Gjengitt med tillatelse ti. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dyremodell presenteres i denne rapporten er basert på to viktige tilnærminger. Først, for å sikre evnen til å observere metastatiske kloner med forskjellige tilbøyeligheter til å kolonisere og proliferere i leveren, ble et panel av svært heterogene monoklonale cellelinjer etablert, snarere enn en etablert fraksjonerte kreftcellelinje 12,13. Det monoklonale tilnærming til metastaseutvikling begrunnes med siste genomiske data 14 og ble med hell brukt tidligere for å modellere metastatisk prosess 10,15,16. For det andre, var dobbelt-merking av den parentale cellelinje av luciferase og tdTomato markører innlemmet for å tilveiebringe forbedret analyse av metastatisk vekst både in vivo og ex vivo. Den selvlysende og fluorescerende markør gjør det mulig for en detaljert anatomisk undersøkelse og potensiell kvantifisering av både mengden av metastatiske tumorer (regnet som den frekvens eller effekt på lever colonization) og størrelsen av enhver individuell koloni. Det sistnevnte kan enkelt konverteres til et faktiske antall celler ved hjelp av en enkelt kalibreringsprosedyre som er beskrevet i trinn 2, og figur 2 10 og 4 10. Ved hjelp av disse data, er det mulig å anslå den Td for hver metastatisk node i leveren, og for å vurdere vekstkinetikken av levermetastaser for hver innledende monoclone injisert (figur 5) 10.
Tre forskjellige kolorektal metastatisk fenotyper ble observert i denne eksperimentelle systemet, utpekt som P1, P2, og O1 / O2. Disse metastatisk fenotyper skilte seg når man sammenligner data for hyppigheten av kolonisering og lokale vekstrater for hver metastatisk klone. Den første metastatiske fenotype, P1, viste en forbedret evne til å kolonisere leveren, men en forholdsvis lav lokal vekst, svarende til mange små metastatiske svulster i løpet av leveren. Den andre metastatiske fenotype, P2, haddeen lavere frekvens for kolonisering, men en betydelig høyere lokal vekst, noe som resulterer i et forholdsvis lite antall store sekundære svulster. Til slutt, den tredje metastatiske fenotype, O1 og O2, vist både en lav frekvens for kolonisering og langsomme lokale vekstrater. Denne tredje metastatiske fenotype kan betraktes som en representasjon av kliniske oligometastatic leversykdom (figurene 3 10 og 5 10). I tillegg genekspresjonsanalyser sammenligne disse klonene 10 identifiserte betydelige forskjeller i uttrykk mønstre. For eksempel, når man sammenligner med P1 O1 og O2 kloner, var det 756 differensielt uttrykte gener, inkludert en del av gener som er involvert i inflammatoriske responser og interferon signalering. Denne studien, så vel som andre, er implisert disse genene i å spille viktige roller i tumorvekst og overlevelse 21, 22. I tillegg når man sammenligner P2 til O1 og O2, var det 461 differensielt eksplisittd gener, med en undergruppe som involverer gener kritiske til cellevekst og spredning formidlet gjennom ERK1 / 2 signalisering.
Mangfoldet av metastatiske fenotyper produsert av denne eksperimentelle modellen er konsistent med de observerte kliniske representasjoner av metastatisk heterogenitet. For eksempel har det vist seg at størrelsen av levermetastaser (en parameter relatert til vekstpotensial) og deres antall (en parameter relatert til kolonisering evne) er uavhengige risikofaktorer for en fjernmetastaser. Med økt vekstpotensial eller kolonisering evne, egenskapene observert i P1 og P2 er i samsvar med disse dataene. I tillegg de siste observasjoner av pasienter behandlet med Stereo Body Radio-terapi (SBRT) eller med kirurgisk resected lungemetastaser peker både til antall svulster og frekvensen av progresjon som viktige faktorer generelle og sykdomsfrie utfall 17,18. Dermed kolonisering og vekst evner ser ut til åvære blant de mest kritiske faktorene for å bestemme utviklingen av metastatisk kloner på fjerne områder 19,20. Eksperimentelle modeller, som er basert på disse egenskaper av metastatiske kloner, kan gi nyttige verktøy for å forstå mekanismene for metastaseutvikling, så vel som tilveiebringe et middel for å teste nye behandlingsformer for herding av levermetastatisk sykdom.
Mens en ortotopisk modell i stand til å produsere spontane metastaser er ideell, gjenstår en mangelen av lett reproduserbare og ensartede spontane modeller. Mens modellene benytter intracecal implantasjon eller injeksjoner har blitt beskrevet, de demonstrerte variable priser av opptak og metastasedannelse 23-26. Andre metoder har utnyttet utenfor livmoren implantasjon tilnærming ved intrasplenic eller intraportal injeksjon for å generere levermetastaser. Mens den generelle teknikk fra injeksjon er den samme, den modell som presenteres her gir en sensitiv metode for å understanding mekanismene for metastaseutvikling, med start fra trinn av sirkulerende tumorceller (CTC). Følsomhet og reproduserbarhet av vår tilnærming bestemmes av dobbeltmerking av cellelinjene for å tillate både bioluminescent og fluoriserende bilde å spore dynamikken i den metastatiske prosess. På grunn av evnen til å kvantifisere den metastatiske belastning fra den luminescerende og fluoriserende data, er det mulig å systematisk måle og spore vekstkinetikken av metastaser over tid. Selv om alternative tilnærminger, for eksempel ultralydbasert avbildnings, har blitt brukt, disse modaliteter er mye mer brukeravhengig, med potensielt økt inter-brukervariasjoner 27. I tillegg, ved å generere et panel av monoklonale cellelinjer, er vi i stand til å gi reproduserbare og forskjellige metastatiske fenotyper for å bedre modell variasjon av metastatisk sykdom sett i et klinisk miljø.
Mens mestre denne eksperimentelle teknikken,spesielt intrasplenic injeksjon for in vivo musemodell (se trinn 4), er det noen viktige skritt som kan kreve modifikasjon. Av notatet, utføring av milt injeksjon er den viktigste delen av modellen som en utilstrekkelig injeksjon av milten kan føre til dårlige resultater. Lekkasje av celler under injeksjonen, eller lekkasje forårsaket av ukorrekt plassering av microclip, kan resultere i et lavere antall levermetastaser og / eller en betydelig mengde av ekstra-leversvulster eller peritoneal carcinomatoses. I tillegg er det viktig å injisere tumorcellene langsomt, for i det minste så lenge som beskrevet i protokollen, for å unngå en økning i intrasplenic trykk, noe som kan føre til ekstravasering av cellene i de tilstøtende vev og veksten av ekstra leversvulster rundt stubben av milten disseksjon.
Til slutt, i trinn 4.3, der er et celle gitt for milt injeksjon (1,2 til 2 x 10 6 </ Sup> celler). Hensikten med dette området er å ta hensyn til de enkelte operatører av denne teknikken. Det kan ta tid å kalibrere et optimalt antall celler til å injisere. Dersom for få celler blir injisert, kan levermetastaser ikke utvikle konsekvent, og hvis for mange celler blir injisert, kan portvene okklusjon forekomme, som fører til tidlig død av dyret. Kan det være klokt å først prøve flere forskjellige konsentrasjoner av tumorceller ved start av denne modellen for å finne det optimale antall.
En fallgruve av den presenterte modellen er at den er basert på en xenograft tilnærming og utnytter immunsvikt nakne mus. En alternativ metode foreslått er genereringen av et lignende panel av monoklonale derivater av det murine kolorektal cellelinje MC38, dobbeltmerket med luciferase og tdTomato eller EGFP proteiner. Disse klonene kan så brukes i syngene dyremodeller for å fange opp de interaksjonene for å utvikle levermetastaser med verten immunofluorescensne system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) for Luc2-tdTomato plasmid og HCT116 cellelinje, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) for mus ledelse, og Dr. Lara Leoni for hjelp med DLIT. Kvantifiseringen av fluorescerende og selvlysende intensiteter ble utført i den integrerte Small Animal Imaging Research Resource ved Universitetet i Chicago på en IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Dette arbeidet ble støttet av Virginia og DK Ludwig fond for kreftforskning, Lung Cancer Research Foundation (LCRF), Prostate Cancer Foundation (PCF), og Cancer Center Support Grant (P30CA014599). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In Vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3 mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
