Abstract
Os pacientes com um número limitado de metástases hepáticas e taxas lentas de progressão podem ser tratadas com sucesso com o tratamento local se aproxima de 1,2. No entanto, pouco se sabe sobre a heterogeneidade das metástases do fígado, e modelos animais capazes de avaliar o desenvolvimento de colónias metastáticas individuais são necessários. Aqui, apresentamos um modelo avançado de metástases hepáticas que fornece a capacidade de visualizar quantitativamente o desenvolvimento de clones tumorais individuais no fígado e estimar sua cinética de crescimento e eficiência de colonização. Geramos um painel de derivados monoclonais de células de câncer colorretal humano HCT116 estavelmente marcadas com luciferase e tdTomato e possuindo diferentes propriedades de crescimento. Com a injecção do baço seguido de uma esplenectomia, a maioria destes clones são capazes de gerar metástases hepáticas, mas com diferentes frequências de colonização e taxas de crescimento diferentes. Usando o Syste In vivo de imagensm (IVIS), é possível visualizar e quantificar o desenvolvimento de metástase com luminescente in vivo e ex vivo imagiologia fluorescente. Além disso, difusa luminescentes tomografia (DLIT) proporciona uma distribuição 3D de metástases do fígado in vivo. Ex vivo imagem fluorescente de fígados colhidos fornece medições quantitativas de colónias metastáticas hepáticas individuais, permitindo a avaliação da frequência de colonização do fígado e as cinéticas de crescimento de metástases. Uma vez que o modelo é semelhante a metástases hepáticas clinicamente observados, pode servir como uma modalidade para a detecção de genes associados com a metástase do fígado e para testar potenciais tratamentos ablativos ou adjuvantes para a doença metastática fígado.
Introduction
Os pacientes com metástases do fígado a partir de cancros colorectais primários (CRC) são caracterizados por um mau prognóstico. A taxa de sobrevida em 5 anos para primários não-metastáticos CRC (fases I - III) é estimado como 75 - 88% 3,4, enquanto os pacientes com metástases hepáticas (estágio IV) têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 8 - 12% 5 , 6. No entanto, os doentes metastáticos representam um grupo heterogêneo, apresentando-se com diferentes números de metástases e diferentes tempos de recorrência. As observações clinicas indicam que o número de metástases (o qual pode ser proporcional à capacidade de colonização ou frequência de colonização) e o tamanho de uma única metástase (proporcional à taxa de crescimento local) constituem factores de risco independentes, 1,7. Em outras palavras, o sucesso de clones que colonizam metastáticos do fígado depende de duas propriedades importantes: a sua capacidade de crescer e a sua capacidade para difundir e sobreviver no microambiente do fígado.
O designde modelos clínicos de sucesso com a capacidade de capturar e quantificar as propriedades metastáticas de clones pode melhorar drasticamente a nossa compreensão da biologia do fígado e metástases fornecer uma ferramenta eficaz para o desenho de potenciais abordagens terapêuticas. Todos os modelos de metástase hepática experimental foram previamente relatado 8,9, mas nenhum deles desde que a capacidade de capturar e descrever as propriedades dos clones metastáticos individuais tanto in vivo e ex vivo quantitativamente.
Aqui, apresentamos um novo modelo, avançado de metástase do fígado que inclui a geração de clones de tumor com diferentes eficiências de colonização fígado e propriedades de crescimento. Utilizou-se uma combinação de dupla-marcação das células cancerosas com a luciferase e a proteína fluorescente tdTomato com a geração de linhas celulares monoclonais que têm diferenças intrínsecas na capacidade metastática. Neste modelo experimental, os dados indicam que o desenvolvimento demetástases do fígado pode ser descrito em termos de frequência e tempo de duplicação de colonização (Td), o que é consistente com as observações clínicas. A natureza quantitativa deste modelo torna facilmente adotáveis para a descoberta de drogas e fins de diagnóstico.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Chicago (Protocolo # 72213-09) e realizado em condições estéreis.
1. Preparações
- Adicione 500 mL de meio para a cultura de células tumorais HCT116: Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina.
- Autoclave os instrumentos a serem utilizados para o modelo de injecção baço, incluindo 3 - 4 toalhas cirúrgicas, gazes, dois captadores Adson pequenas, um controlador de agulha, dois pares de tesouras, uma pequena braçadeira, e 3 microclips, a 251 ° F durante 20 min .
- Prepare anestesia pós-operatório para os ratinhos, a ser administrada por via subcutânea, após a injecção do baço. Dilui-se 2-4 ug de buprenorfina em 500 ul de solução salina normal a 0,9 por ratinho.
- Preparar alíquotas de 150 mg / 150 mL de luciferina de pirilampo para injecções intraperitoneais During os ensaios de bioluminescência. Armazenar a -20 ° C e protegido da luz.
2. Geração de luciferase / tdTomato-rotulados monoclonais celular Lines 10,11
- Descongelar e manter as células HCT116 do cancro colo-rectais humanos e 293FT células de rim embrionário humano em DMEM com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Manter em cultura em 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Produção de um lentivírus de título elevado.
- Em D 1, a placa 10 - 12 x 10 6 293FT células entre a passagem 3 e 10 em placas de cultura celular de 15 cm em 18 ml de DMEM completo (cDMEM) com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e aminoácidos não essenciais 1% . Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Em D 2, transfectar as células com a seguinte solução de transfecção:
- Para cada prato, utilizar o seguinte: uma mistura de ADN de 37,5 ug de pFUG lentiviral vector inserido com a luciferase (Luc2) e tdTomatoconstrói 11 (uma oferta do Dr. Geoffrey Greene na Universidade de Chicago), 25 ug de pCMVΔ8.74, e 12,5 ug de pMD2.G ressuspensas num total de 1062 mL de H 2 O. estéril Adicionar 188 uL de 2 M de CaCl2.
- Adicionar 1250 mL de solução salina 2x tamponada com Hepes (HBS, Hepes 50 mM, 1,5 mM de Na 2 HPO 4, e NaCl 180 mM, pH 7,12) para a solução de ADN / CaCl2, uma gota de cada vez, enquanto se fazia borbulhar bolhas através do solução com uma pipeta.
- Incubar à temperatura ambiente durante 20 min, e em seguida, adicionar 15,5 mL de RT cDMEM e cloroquina para fazer uma concentração final de 25 uM.
- Aspirar a mídia em cada prato de 293FT células e substituir com a solução de transfecção. Adicionar 16 ml da solução de transfecção lentamente, como as células plaqueadas desalojar facilmente.
- Em D 3, após 8-16 h, remover a solução de transfecção e lave as células uma vez com fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS), novamente Taking cuidado para não desalojar as células. Substituir a mídia com 18 mL de cDMEM fresco com Hepes 10 mM.
NOTA: mova lentamente pratos, aspirar a solução de transfecção, e adicionar os meios de comunicação através da parede lateral de placas de modo a não desalojar as células. - Em D 4, às 48 h desde o momento da transfecção, recolher os meios de comunicação a partir das placas por aspiração lentamente com uma pipeta, de modo a não desalojar as células. Centrifugar os meios recolhidos a 300 xg durante 5 minutos para precipitar o grande detritos celulares.
- Filtra-se o sobrenadante viral utilizando um filtro de 0,45 um balão e centrifugação utilizando um rotor SW-28 durante 2 h a 50000 xg e 4 ° C com baixa ligação às proteínas. Decantar o sobrenadante imediatamente após a conclusão da centrifugação e secar o interior do tubo com o limpa pára-brisas.
- Ressuspender o sedimento viral em 50 uL de meio de soro reduzido (RSM) com 1% de FBS. As aliquotas podem ser guardadas a -80 ° C para uso futuro (estoque viral).
- Transduzir o lentivírusES em células HCT116 e gerar um painel de clones tdTomato-positivos.
- Placa as células HCT-116 a uma densidade de 1 x 10 5 em placas de 24 poços 1 d antes da infecção viral.
- Diluir 40 uL de vírus ressuspenso (a partir de 2.2.7) em 4 ml de RSM (diluição 1: 100) com 1% de penicilina / estreptomicina e 8 ug / mL de polibreno (CRSM).
- No dia da infecção, lavar as células uma vez com DPBS, e então adicionar 250 ul de vírus diluído a partir do passo 2.3.2 a cada poço. Incuba-se durante 4 h a 37 ° C e CO2 a 5% e, em seguida, adicionar 1 ml de cDMEM a cada poço; incubar a 37 ° C e 5% de CO2 durante 48-72 h.
- Ressuspender as células com 1 ml de tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM, e em seguida adicionar 1 ml de cDMEM para neutralizar a tripsina. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga e pelete a 300 xg durante 4 min. Lava-se a pelete 3x em 1 mL de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) mais 2% de FBS.
- Ressuspender o sedimento do passo 2.3.4com tampão FACS (2% ECF e EDTA 2 mM em PBS) a uma suspensão de uma única célula a 1 x 10 6 células / ml.
- Ordenar as células HCT116 tdTomato-positivos usando um classificador de células, gating para células PE-positivas (excitação / emissão: 556/585 nm). Crescer as células recolhidas em cerca de 10 cm de placa em 5% de CO 2 e 37 ° C para gerar células HCT116 tdTomato-positiva parentais (Figura 1A).
- Ressuspender as células HCT116 tdTomato-positiva parentais de 2.3.6 com 8 ml de tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM, durante 3-5 min, e em seguida, adicionar 8 mL de cDMEM para neutralizar a tripsina.
- Transferir as células para um tubo de 50 mL e de pelotas a 300 xg durante 4 min. Remover o sobrenadante e diluir as células HCT116 tdTomato-positiva parentais para uma célula por 200 uL no cDMEM (Figura 1B).
- Placa de uma única célula (200 uL da diluição) por poço numa placa de 96 cavidades, com 5% de CO 2 e 37 ° C (Figura 1C).
- Cresça monoclones individuais em frascos de 5% de CO 2 e 37 ° C. (Figura 1D).
3. A calibração da intensidade de fluorescência de sinal em função do número de células
- Placa as células HCT-116 transfectadas, agora referidos como HCT116-L2T, a uma densidade de 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 e 10 5 células / poço em placas de 96 poços em triplicado para cada densidade.
- Após 5 horas de incubação, as quantificar tdTomato intensidades fluorescentes utilizando IVIS 10.
- Clique no ícone do software de imagem na área de trabalho para iniciar o software. Clique no botão "Iniciar" para inicializar o sistema de imagem. Depois de terminar a inicialização (que leva cerca de alguns minutos), selecione "fluorescência", "4 segundos" tempo de exposição, binning "Medium", "2" F / stop ", 535" filtro de excitação,e "580" filtro de emissão.
- Coloque a placa de 96 poços na estação de imagens e clique em "Adquirir" para iniciar a geração de imagens. Depois que a imagem é adquirida, clique em "Ferramentas de ROI" na paleta de ferramentas e selecione 12 x 8 a partir do ícone de fenda.
- Criar 12 x 8 fendas para cobrir a área de sinal na imagem da placa de 96 poços e clique na guia medições. Observe uma janela com uma tabela de medições de ROI com unidades de fótons por s por esterradiano por centímetro quadrado (fótons / s / sr / cm 2).
- Construir um gráfico de dispersão com o argumento (eixo X) igual ao número de células e a função (eixo Y) que representa a intensidade do sinal. Calcular curvas de regressão utilizando um software de análise de dados para calcular a quantidade de células correspondentes à unidade de intensidade fluorescente (Figura 2) 10.
4. Modelo Animal de metástases hepáticas
- Uma vez que as células HCT116-L2T chegar a 70- 80% de confluência, prepará-los aproximadamente 1 h antes da injecção de baço. Dissociar as células usando tripsina a 0,05% em EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 minutos, e, em seguida, neutralizá-los com uma quantidade igual de cDMEM. Certifique-se de pipetar cuidadosamente para evitar aglomeração.
- Contar as células com um contador de células automático.
- Ressuspender as células em 1X DPBS para uma concentração de 1,2 - 2 x 10 6 células / 100 ul. Certifique-se de pipeta e voltar a suspender as células cuidadosamente para evitar aglomeração.
- Manter as células em gelo até injecção, ocasionalmente, ressuspendendo-as no tubo.
- Antes de se anestesiar os ratos, fornecer um anestésico pré-operatória e de bolus fluido por injecção subcutânea de 500 ul da mistura de buprenorfina descrito no passo 1.3. Administrar a mesma dose de mistura buprenorfina adicional duas vezes por dia até que os sinais de dor (mobilidade reduzida, estatura curvada, a falta de noivo, vocalização quando manuseado) ter resolvido.
- Anestesiar de 6 a 8 semanasratinhos atímicos fêmea -old nu com 2% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de anestesia. Confirmar que os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar a cauda. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. Transfira cada rato anestesiado a um cone do nariz individual para a injeção baço. Antes da incisão, cada rato deve ser coberta com uma cortina cirúrgica estéril.
- Identificar o baço como uma área de roxo visto externamente através da pele no flanco esquerdo dos ratinhos nus. Com uma tesoura de microdissecção, fazer uma incisão 8 milímetros flanco esquerdo sobre a pele um pouco acima do baço.
- Em seguida, levante a parede abdominal e fazer uma pequena incisão. Permitir que o ar no interior da cavidade abdominal, de modo a que os órgãos internos afastar-se do local da incisão. Aumentar a incisão da parede abdominal para aproximadamente 5 mm.
- Expor o baço através da aplicação de pressão suavemente em torno da incisão com um cotonete. Se necessário, a gordura pancreático pode ser suavemente homemipulated para ajudar com a exposição de modo a não prejudicar o baço.
- Lentamente, injectar 100 ul de células usando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 27, para a ponta do baço exposta. Injectar-se lentamente, ao longo de um período de pelo menos 30 - 60 s, para evitar tumores extra-hepáticas.
- Coloque um microclipe no baço antes de remover a agulha no final da injecção para evitar a fuga da suspensão de células injectadas.
- Deixe o microclipe no local por 5 min.
- 5 min após a injecção, realizar uma esplenectomia usando um cautério de mão para hemostasia. Dissecar o hilo do baço, a partir do lado anterior. Ao dissecar grandes vasos, pré-coagulação do lado proximal do recipiente com o tecido adiposo adjacente, utilizando cautério para evitar o sangramento excessivo.
NOTA: Os métodos para hemostasia: coagular o ponto de sangramento diretamente com cautério, aplicar pressão para o ponto de sangramento por 3-5 min, ou sutura-ligadura o ponto de sangramento com um empate 5-0 seda. Fechar a incisão de flanco de cada murganho em duas camadas. Em primeiro lugar, fechar a parede abdominal com uma sutura absorvível 5-0 entrançada (por exemplo, Vicryl) num ponto horizontal. Em seguida, fechar a pele usando um 4-0 não absorvíveis sutura monofilamento (por exemplo, prolene), novamente com um único ponto horizontal. - Limpe todos os instrumentos por pulverização 70% isopropanol para manter condições estéreis entre cada procedimento.
NOTA: Certifique-se os animais são aquecidos enquanto eles despertar da anestesia. Monitorar todos os ratos pós-operatório até se tornarem ambulatorial e voltar à atividade normal. Tipicamente, o tempo de recuperação é de aproximadamente 3-5 min. Não deixar os animais sem vigilância até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.
5. In Vivo de Imagiologia bioluminescente
- Realizar imagem emsemanalmente para medir e quantificar alterações na bioluminescência ao longo do tempo.
- Coloque os ratos em uma câmara de anestesia e anestesiar-los com 2% de isoflurano em oxigênio. Confirmar que os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar as caudas. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
- Em seguida, intraperitoneal injetar cada rato com 150 mL da preprepared pirilampo luciferina a partir do passo 1.4.
- Coloque a ratos em um IVIS com cones do nariz individuais administração de isoflurano. Coloque a ratinhos em posição supina com espaçadores entre eles para minimizar o sinal de ratinhos adjacentes. Um máximo de cinco ratinhos pode ser trabalhada de uma só vez.
- Medir e analisar intensidades bioluminescentes 3 min após a injeção luciferina.
- Depois de inicializar o IVIS como descrito no passo 3.2.1, selecione "Luminescent", "um segundo" tempo de exposição e binning "Medium".
- Clique no botão "Adquirir" para iniciar imaging. Certifique-se de executar cada imagem em um tempo consistente (3 min) após a injeção luciferina.
- Depois que a imagem é adquirida, uma janela de imagem e paleta de ferramentas irá aparecer. Ferramentas clique "ROI" e selecionar "1", "2", "3", "4" ou "5", a partir do ícone de círculo, que corresponde ao número de ratinhos trabalhada.
- Para definir regiões de interesse (ROI), circule a área do sinal do sinal luminescente na cavidade abdominal do mouse e clique em "medidas" do ROI como uma unidade arbitrária de eficiência radiante ((fótons / s / cm 2 / esferorradiano) / (uW / cm2)). Certifique-se de ter um círculo ROI adicional do fundo.
- No pós-injecção e antes de sacrifício de animais de quatro semanas, execute difusa luminescentes tomografia (DLIT) usando IVIS para avaliar a carga tumoral e distribuição usando em tempo real reconstrução 3D de intensidades bioluminescentes de colónias tumorais individuais.
- Depois de inicializar o IVIS, conforme descrito na etapa 3.2.1, selecione "Assistente de Imagem", "bioluminescência", e clique em "Next". Selecione "DLIT" e clique em "Next". Escolha sondas "Firefly" e clique em "Next". Selecione "mouse" assunto de imagem, parâmetro de exposição "Auto", o campo "C-13 cm" de vista, e "0,5 cm" height assunto, e clique em "Next". Clique no botão "Adquirir" para iniciar a geração de imagens.
- Depois que a imagem é adquirida, selecione a guia "DLIT Reconstrução 3D" e "Analisar" e clique em "Reconstruir" para gerar a imagem reconstrução 3D.
- Clique em "Ferramentas" e "Animação 3D". Selecione "CCW rotação no eixo Y" na janela de animação 3D. Clique em "Record" e "Salvar" em um arquivo de formato .mov.
6. Ex Vivo Fluorescent Imagem
- Sacrificar os ratos por deslocamento cervical, enquanto anestesiados, ou de acordo com as diretrizes institucionais em 4 - 6 semanas após as injecções de baço.
- Colher o fígado. Faça uma incisão horizontal da esquerda para o flanco direito. Agarrando o processo xifóide com um captador, dissecar o falciforme, a veia hepática e da veia cava inferior.
- Dissecar o ligamento direito hepato-renal, o ligamento hepatoduodenal, eo ligamento hepato-renal esquerda, tomando cuidado para não ferir o lobo caudado, enquanto dissecando o ligamento hepatoduodenal. Após a colheita do fígado, remover a vesícula biliar, pois isso irá exibir autofluorescência. Tome nota de quaisquer tumores extra-hepáticas adicional presente.
- Tome nota dos números e tamanhos de tumores hepáticos presente macroscopicamente, e colocar os fígados colhidos em DPBS.
NOTA: Os tumores são macroscopicamente visível a olho nucomo tumores branco (para um exemplo representativo, ver Figura 4). - Antes da colocação na folha de imagem, tome cada fígado e remova cuidadosamente o excesso de líquido borrando em uma toalha de papel.
- Medem-se as intensidades de fluorescência de cada colónia tumor utilizando o IVIS.
- Selecione "fluorescência", "4 segundos" tempo de exposição, binning "Medium", "2" F / stop ", 535" filtro de excitação, e "580" filtro de emissão. Clique no botão "Adquirir" para iniciar a geração de imagens.
- Depois de adquirir a imagem, localizar a janela de imagem e paleta de ferramentas. Clique em "Ferramentas de ROI" e selecione "1" a partir do ícone do círculo. Para definir ROIs, circule a área do sinal de colónias tumorais individuais sobre a imagem e clique em "medidas" do ROI como uma unidade arbitrária de eficiência radiante ((fótons / s / cm 2 / esterradiano) / (mW / cm 2) ). Certifique-se de ter um círculo ROI adicional do fundo.
- Calcule o volume total do tumor, assumindo que ela seja uma esfera. O volume do tumor = 4 x π XR 3/3 (r = radius). Calcula-se a fracção de células formadoras de colónias do tumor (Fc) como o número de tumores no fígado, dividido pelo número de células splenically injectado.
- Calcule o número total de células por colónia (= X) a partir da aproximação linear a partir do passo 3.3. Calcule o número de divisões celulares (= Y) como Y = log 2 X eo Td como Td (dia) = 28 / Y.
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Representative Results
O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo animal consistente e facilmente reproduzível com o potencial para a quantificação de série da carga tumoral metastático in vivo e para a estimativa da frequência de colonização e cinética de crescimento do desenvolvimento de metástases hepáticas. Figuras 2-6, com lendas, são fornecidos a partir de nossa publicação anterior sob uma licença Creative Commons CC-BY 10.
Geração de Monoclones duplamente marcada tumor de células
Em primeiro lugar, um painel de luminescente e linhas celulares monoclonais marcados com fluorescência foram gerados com diferentes capacidades metastáticas. Após a transfecção bem sucedida de luminescente (Luc2) e proteínas fluorescentes (tdTomato) em células de cancro colo-rectal HCT116 parentais, 16 monoclones de marcação dupla foram gerados por diluição da HCT1 parentalCélulas de 16 L2T para 1 célula / 200 ul em placas de 96 poços (Figura 1) 10. In vitro de fluorescência e luminescência de HCT116-L2T foi depois quantificada utilizando uma quantidade crescente de células para estimar o número de células tumorais a partir de in vivo e ex vivo de imagens de tumores do fígado (Figura 2) 10.
Desenvolvimento metástases por clones com Diferencial fígado Colonização
Em seguida, para gerar metástases do fígado, os 16 clones individuais HCT116-L2T anteriormente gerados foram intrasplenically injectados em ratinhos; uma esplenectomia foi realizada em seguida. O desenvolvimento de metástases do fígado foi monitorizada in vivo por imagiologia bioluminescente semanal, seguido por ex vivo imagiologia fluorescente após sacrificar os ratinhos. Dos 16 monoclones gerados, seleccionámos clones designados por P1, P2, O1, O2 e, devido ao seu different observado capacidades de colonização e crescimento no fígado. Clones O1 e O2 tinha uma carga tumoral menor, representando clones "oligometastatic", e, potencialmente, recapitulando um fenótipo de doença metastática limitada. Clones de P1 e P2 tinha uma maior carga tumoral, representando difusão generalizada, a qual também é referida como doença polymetastatic. A bioluminescência foi maior no P1 e ratinhos P2 (6,7 x 10 6 ± 4,7 x 10 6 e 3,6 x 10 6 ± 2,5 x 10 6 fotões / s / cm 2 / steradian) em comparação com os ratos O1 e O2 (2,0 × 10 5 ± 1,3 x 10 5 e 1,7 x 10 5 ± 9,1 × 10 4 fotões / s / cm 2 / steradian) 3 semanas após a injecção do baço (Figura 3A, B) 10. A quantificação da fluorescência ex vivo de fígado a 4 semanas após a injecção de baço demonstraram que P1 e P2 fígados tinha FLUORES superioresintensidades cento em comparação com o O1 e O2 fígados (Figura 3C). As distribuições de tumor nas imagens fluorescentes ex vivo foram consistentes com os achados macroscópicos (Figura 3C e D) de 10.
Colonização e Crescimento Kinetics dos clones individuais
Os números e tamanhos de tumores visualizadas macroscopicamente foram contadas e medido em cada indivíduo fígado. Além disso, ex vivo imagiologia de fluorescência foi feito em cada colónia tumor individual para cada monoclona (Figura 4) 10. O número total de tumores em P1 foi maior, em comparação com P2, O1, O2 e, enquanto que o tamanho dos tumores foi maior do que em P2 em P1, O1, O2 e (p <0,001; Figura 5A, B) 10. No entanto, o volume total do tumor no fígado em P1 e P2 foi maior, em comparação com O1 e O2 (Figura 5C)
A distribuição 3D de tumores metastáticos no fígado foi demonstrada por DLIT (Figura 6) 10. Usando esta técnica de imagem, é possível monitorar o comportamento dinâmico espaço-temporal das metástases de detecção e medição da bioluminescência de colónias metastáticas hepáticas individuais.
Os dados gerados foram analisados utilizando software de análise de dados de padrão e barras de erro foram demonstrados como a média ± desvio padrão. Os coeficientes de correlação de Pearson foram utilizados para avaliar associações entre parâmetros. Os valores de P foram avaliados através de testes t de Student 2 de cauda, com um p <0,05 considerado estatisticamente significativo.
Figura 1:. Geração de um painel de Monoclones de células HCT116 marcado (A) Cultivar células HCT116 parentais marcadas com luciferase e tdTomato. (B) Dilui-se células HCT116 parentais para 1 célula / 200 ul. (C) placa 200 uL da diluição numa placa de 96 poços. (D) Grow monoclones de cada poço na placa de 96 poços. (E) Injectar monoclones intrasplenically em camundongos para gerar metástases hepáticas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A imagem luminescente de números diferentes de células triplicou em uma placa de 96 poços estimativa do número de células através de intensidades fluorescentes (A).. (B) A correlação entre o número de células e a luminescência (r = 0,99, p <0,0001). A barra de escala representa a intensidade luminescente (fótons / s / cm 2 / esterradiano). (C) A imagem fluorescente de números diferentes de células triplicou em uma placa de 96 poços. intensidades nósre adquirido como eficiências radiantes com uma excitação de 535 nm e uma emissão de 580 nm. (D) A correlação entre o número de células e da fluorescência (r = 0,99, p <0,0001). A barra de escala representa a intensidade de fluorescência numa unidade arbitrária de eficiência radiante ((fotões / s / cm 2 / esferorradiano) / (uW / cm2)). Reproduzido com permissão 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A bioluminescência e E x Vivo fluorescência do Fígado em clones selecionados (A) imagens bioluminescentes representativos.. A barra de escala representa luminescente intensity (fótons / s / cm 2 / esterradiano). (B) Bioluminescência medido semanalmente a partir de 1 - 3 semanas em P1 e P2, e 1 - 4 semanas em O1 e O2. Os dados foram representados como a média ± desvio padrão. (C) Representante ex vivo imagens fluorescentes de fígados. Intensidades foram adquiridos como eficiências radiantes com uma excitação de 535 nm e uma emissão de 580 nm. A barra de escala representa a intensidade de fluorescência numa unidade arbitrária de eficiência radiante ((fotões / s / cm 2 / esferorradiano) / (uW / cm2)). (D) imagens hepáticas macroscópicas (setas indicam tumores brancas pequenas). P1 e P2: Os clones polymetastatic, O1 e O2: clones oligometastatic. Reproduzido com permissão 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Quantificação de fluorescentes intensidades de Individual fígado Colonies Imagens à esquerda são achados macroscópicos representativos e imagens à direita são intensidades fluorescentes em cada clone. As intensidades fluorescentes foram adquiridos como eficiências radiantes com uma excitação de 535 nm e uma emissão de 580 nm. P1 e P2: Os clones polymetastatic, O1 e O2: clones oligometastatic. Reproduzido com permissão 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Estimativa quantitativa da capacidade de colonização e Cinética do Crescimento (
Figura 6: Quantificatina de bioluminescência das Colónias tumor individual usando difusa luminescentes tomografia (DLIT). vista aérea (A) 3D. A barra de escala representa intensidade de fluorescência em uma unidade arbitrária de eficiência radiante. (B) Secção coronal. (C) sagital seção. Secção (D) Transaxial. (E) imagem macroscópica do fígado. (F) ex vivo imagem fluorescente do fígado. Reproduzido com permissão 10. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo animal apresentado no relatório atual é baseada em duas abordagens principais. Em primeiro lugar, a fim de garantir a capacidade de observar os clones metastáticas com diferentes propensões para colonizar e proliferar no fígado, um painel de linhas celulares monoclonais altamente heterogénea foi estabelecida, ao invés de uma linha de células de cancro não fraccionada estabelecida 12,13. A abordagem monoclonal para o desenvolvimento de metástase é justificada por dados genômicos recentes 14 e foi usado com sucesso anteriormente para modelar o 10,15,16 processo metastático. Em segundo lugar, com dupla marcação da linha de células parental através de marcadores de luciferase e tdTomato foi incorporado, a fim de proporcionar melhor análise de crescimento metastático in vivo e ex vivo. O luminescente e marcação fluorescente permite um exame detalhado anatómica e potencial de quantificação a quantidade de tumores metastáticos (considerada como a frequência ou a eficácia do fígado colonization) e o tamanho de qualquer colónia individual. Este último pode ser facilmente convertido para um número real de células utilizando um procedimento de calibração simples descrito no passo 2 e as figuras 2 a 10 e 4 10. Usando estes dados, é possível estimar a Td para cada nó metastático no fígado e para avaliar a cinética de crescimento de metástases do fígado de cada monoclona inicial injectada (Figura 5) 10.
Três fenótipos metastáticos colorrectais diferentes foram observados neste sistema experimental, designados por P1, P2, e O1 / O2. Estes fenótipos metastáticos diferente quando se comparam os dados de frequência de colonização e as taxas de crescimento locais para cada clone metastático. O primeiro fenótipo metastático, P1, demonstraram uma maior capacidade para colonizar o fígado, mas uma taxa de crescimento local relativamente baixa, correspondendo a muitos tumores metastáticos pequenos por todo o fígado. O segundo fenótipo metastático, P2, teveuma menor frequência de colonização, mas uma taxa significativamente mais elevada crescimento local, resultando em um relativamente pequeno número de grandes tumores secundários. Por último, o terceiro fenótipo metastático, O1 e O2, demonstrado tanto uma baixa frequência de colonização e as taxas de crescimento locais lentas. Este terceiro fenótipo metastático podem ser consideradas como uma representação de doença hepática oligometastatic clínicos (Figuras 3 e 10, 5 10). Além disso, a análise da expressão do gene da comparação destes clones 10 identificou diferenças significativas nos padrões de expressão. Por exemplo, quando se compara com os clones P1 O1 e O2, havia 756 genes expressos diferencialmente, incluindo um subconjunto de genes envolvidos em respostas inflamatórias e sinalização do interferão. Este estudo, bem como outros, têm implicado destes genes em desempenhando papéis importantes no crescimento e sobrevivência do tumor 21, 22. Além disso, quando se comparam P2 para O1 e O2, havia 461 diferencialmente expressegenes D, com um subconjunto envolvendo genes críticos para o crescimento e a proliferação celular mediada através de ERK1 sinalização / 2.
A diversidade de fenótipos metastáticos produzidos por este modelo experimental é consistente com as observações clínicas observadas de heterogeneidade metastático. Por exemplo, demonstrou-se que o tamanho das metástases do fígado (um parâmetro relacionado com o potencial de crescimento) e os seus números (um parâmetro relacionado com a capacidade de colonização) são factores de risco independentes para metástase distante 1. Com o aumento do crescimento ou potencial capacidade de colonização, as propriedades observadas em P1 e P2 são consistentes com estes dados. Além disso, observações recentes de pacientes tratados com estereotáxica corpo do rádio-terapia (SBRT) ou com metástases pulmonares cirurgicamente ressecado apontar tanto para o número de tumores e a taxa de progressão como principais factores que determinam global e resultados livres de doença 17,18. Assim, as capacidades de colonização e de crescimento parecemestar entre os fatores mais críticos para determinar o desenvolvimento de clones metastáticas em locais distantes 19,20. Os modelos experimentais, que são à base de tais propriedades metastáticas de clones, pode fornecer ferramentas úteis para a compreensão dos mecanismos do desenvolvimento de metástases, bem como fornecer um meio para testar novas modalidades de tratamento para a cura da doença metastática fígado.
Embora um modelo ortotópico capaz de produzir metástases espontâneas é ideal, continua a haver uma escassez de modelos espontâneos facilmente reproduzíveis e consistentes. Enquanto modelos que utilizam o implante intracecal ou injeções têm sido descritos, eles demonstraram taxas variáveis de absorção e metástase formação 23-26. Outros métodos utilizaram uma abordagem de implante ectópico por injecção interna do baço ou intraportal para gerar metástases hepáticas. Embora a técnica geral de injecção é o mesmo, o modelo apresentado aqui proporciona uma abordagem sensível à undersensão os mecanismos do desenvolvimento de metástases, desde a fase de circulação de células tumorais (CTC). A sensibilidade e a reprodutibilidade da nossa abordagem é determinada pela dupla-marcação das linhas celulares para permitir a ambos bioluminescente e imagiologia fluorescente para controlar a dinâmica do processo metastático. Devido à capacidade de quantificar a carga metastática do luminescente e dados fluorescentes, é possível medir e controlar sistematicamente a cinética de crescimento de metástases ao longo do tempo. Embora as abordagens alternativas, como a imagiologia à base de ultra-som, têm sido utilizados, essas modalidades são muito mais dependentes do usuário, com potencial aumento inter-usuário Variabilidade 27. Além disso, através da geração de um painel de linhas de células monoclonais, que são capazes de fornecer fenótipos metastáticos reprodutíveis e distintas, a fim de melhor modelo a variabilidade de doença metastática visto no contexto clínico.
Enquanto dominar esta técnica experimental,especificamente a injeção interna do baço para o vivo modelo de rato in (consulte o passo 4), existem alguns passos críticos que podem requerer modificação. De nota, realizando a injecção do baço é a parte mais importante do modelo, como uma injecção inadequada do baço podem resultar em resultados pobres. O vazamento de células durante a injecção ou vazamento causado pela colocação imprópria do microclipe, pode resultar em um menor número de metástases do fígado e / ou uma quantidade significativa de tumores extra-hepáticos ou carcinomatoses peritoneais. Além disso, é importante para injectar as células tumorais lentamente, durante, pelo menos, tão longa, como descrito no protocolo, a fim de evitar o aumento da pressão interna do baço, o que pode conduzir a extravasamento das células para tecidos adjacentes e o crescimento de tumores extra-hepáticas em torno do coto da dissecção baço.
Finalmente, no passo 4.3, existe uma variedade de células dadas para a injecção do baço (1,2-2 x 10 6 </ Sup> células). A finalidade deste intervalo é para ter em conta os operadores individuais desta técnica. Pode levar algum tempo para calibrar um número ideal de células para injetar. Se muito poucas células são injectadas, metástases do fígado pode não se desenvolver de forma consistente, e se muitas células são injectados, pode ocorrer a oclusão venosa portal, levando à morte prematura do animal. Pode ser prudente para tentar inicialmente várias concentrações diferentes de células tumorais quando se inicia este modelo a fim de encontrar o número ideal.
Uma armadilha do modelo apresentado é que ele se baseia numa abordagem de xenoenxerto e explora ratinhos nus imunodef icientes. Um método alternativo proposto é a geração de um painel semelhante de derivados monoclonais da linha celular colorrectal murino MC38, duplamente marcada com luciferase e tdTomato ou proteínas EGFP. Estes clones podem então ser utilizados em modelos animais singeneicos, a fim de capturar as interacções de desenvolvimento de metástases do fígado com o imu hospedeirosistema ne.
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Acknowledgments
Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Geoffrey L. Greene (Universidade de Chicago) para o plasmídeo Luc2-tdTomato ea linha de células HCT116, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) para a gestão ratos, e Dr. Lara Leoni pela assistência com a DLIT. Quantificações de intensidades fluorescentes e luminescentes foram realizados no Resource Research imagem Small Animal Integrado da Universidade de Chicago, em um espectro IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Este trabalho foi apoiado pela Virgínia e Fundo Ludwig DK para Pesquisa do Câncer, a Fundação Lung Cancer Research (LCRF), a Fundação do Câncer de Próstata (PCF), e o Centro de Suporte Grant Câncer (P30CA014599). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In Vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3 mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
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