Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Advanced Animal Model af kolorektal Metastase i Lever: Imaging teknikker og Ejendomsstyrelsen mod metastatiske kloner

Published: November 30, 2016 doi: 10.3791/54657
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 2, 2, 2
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago
* These authors contributed equally

Abstract

Patienter med et begrænset antal levermetastaser og langsomme satser for progression held kan behandles med lokal behandling nærmer 1,2. Men lidt om heterogenitet levermetastaser, og der er behov dyremodeller stand til at vurdere udviklingen af ​​individuelle metastatiske kolonier. Her præsenterer vi en avanceret model af levermetastaser, der giver evnen til kvantitativt at visualisere udviklingen af ​​individuelle tumor kloner i leveren og vurdere deres vækst kinetik og kolonisering effektivitet. Vi genererede et panel af monoklonale derivater af HCT116 humane kolorektal cancer celler stabilt mærket med luciferase og tdTomato og besidder andre vækst- egenskaber. Med en milt injektion efterfulgt af en splenektomi, de fleste af disse kloner er i stand til at generere levermetastaser, men med forskellige frekvenser af kolonisering og varierende vækstrater. Brug af in vivo-afbildning system (IVIS), er det muligt at visualisere og kvantificere metastase udvikling med in vivo luminescerende og ex vivo fluorescerende billeddannelse. Desuden Diffus Luminescent Imaging Tomography (DLIT) tilvejebringer et 3D fordeling af levermetastaser in vivo. Ex vivo fluorescerende billeddannelse af høstede lever tilvejebringer kvantitative målinger af individuelle hepatiske metastatiske kolonier, der giver mulighed for evaluering af frekvensen af leveren kolonisering og vækstkinetikken af metastaser. Eftersom modellen ligner klinisk observerede levermetastaser, kan det tjene som en modalitet til detektering gener associeret med levermetastaser og til afprøvning potentielle ablative eller adjuvans behandlinger for leveren metastatisk sygdom.

Introduction

Patienter med levermetastaser fra primære tarmkræft (CRC) er karakteriseret ved en dårlig prognose. Den 5-årige overlevelsesrate for primære nonnmetastatisk CRC (trin I - III) er estimeret som 75 - 88% 3,4, mens patienter med levermetastaser (fase IV) har en 5-års overlevelse på Kun 8 - 12% 5 6. Men metastatiske patienter udgør en heterogen gruppe, præsentere med forskellige antal metastaser og forskellige gentagelse tidspunkter. Kliniske observationer indikerer, at antallet af metastaser (som kan være proportional med koloniseringsevne eller hyppigheden af kolonisering) og størrelsen af en enkelt metastase (proportional med den lokale vækstrate) er uafhængige prognostiske faktorer 1,7. Med andre ord, succes metastatiske kloner koloniserer leveren afhænger af to vigtige egenskaber: deres evne til at vokse og deres evne til at formidle og overleve i leveren mikromiljø.

Designetaf succesfulde kliniske modeller med evnen til at opfange og kvantificere egenskaber metastatiske kloner kan drastisk forbedre vores forståelse af levermetastaser biologi og giver et effektivt redskab til design af potentielle terapeutiske tilgange. Modeller af eksperimentel levermetastaser er tidligere blevet rapporteret 8,9, men ingen af dem billede evnen til kvantitativt at indfange og beskrive egenskaberne af de enkelte metastatiske kloner både in vivo og ex vivo.

Her præsenterer vi en ny, avanceret model af levermetastaser, der omfatter generering af tumor-kloner med forskellige lever kolonisering effektivitet og vækst egenskaber. Vi anvendte en kombination af dobbelt-mærkning af cancerceller med luciferase og tdTomato fluorescerende protein med frembringelsen af ​​monoklonale cellelinier, der har iboende forskelle i metastatisk kapacitet. I denne forsøgsmodel, de data indikerer, at udviklingen aflevermetastaser kan beskrives med hensyn til kolonisering frekvens og fordoblingstid (Td), som er konsistent med kliniske observationer. Den kvantitative karakter af denne model gør det let bortadopteres for lægemiddelforskning og diagnostiske formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Chicago (protokol # 72.213-09) og udføres under sterile forhold.

1. Forberedelser

  1. Gør 500 ml medium til dyrkning af HCT116 tumorceller: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.
  2. Autoklaveres de instrumenter, der skal bruges til milten injektion model, herunder 3 - 4 kirurgiske håndklæder, gaze, to små Adson pickupper, en nål chauffør, to par saks, en lille klemme, og 3 microclips, ved 251 ° F i 20 min .
  3. Forbered postoperativ anæstesi for musene, der skal indgives subkutant efter milten injektion. Fortynd 2 - 4 ug buprenorphin i 500 pi 0,9 normalt saltvand per mus.
  4. Forbered portioner af 150 mg / 150 pi ildflue luciferin for intraperitoneale injektioner during af bioluminescens-assays. Opbevares ved -20 ° C og beskyttet mod lys.

2. Generering af Luciferase / tdTomato-mærkede monoklonale cellelinier 10,11

  1. Thaw og vedligeholde HCT116 humane colorektale cancerceller og 293FT humane embryoniske nyreceller i DMEM med 10% FBS, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. Oprethold i kultur ved 5% CO2 og 37 ° C.
  2. Fremstil en høj titer lentivirus.
    1. På D 1, plade 10 - 12 x 10 6 293FT celler mellem passage 3 og 10 i 15 cm cellekulturskåle i 18 ml komplet DMEM (cDMEM) med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin og 1% ikke-essentielle aminosyrer . Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. På D2, transficere cellerne ved anvendelse af følgende transfektionsopløsning:
      1. For hver ret, skal du bruge følgende: en DNA-blanding af 37,5 ug pFUG lentivirusvektor indsat med luciferase (Luc2) og tdTomatokonstruktionerne 11 (en gave fra Dr. Geoffrey Greene på University of Chicago), 25 ug pCMVΔ8.74, og 12,5 ug pMD2.G resuspenderet i alt 1.062 pi sterilt H 2 O. Tilføj 188 pi 2 M CaCl2.
      2. Tilføj 1.250 pi 2x Hepes-bufret saltvand (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4, og 180 mM NaCl, pH 7,12) til DNA / CaCl2-opløsning, en dråbe ad gangen, mens blæse bobler gennem opløsning med en pipette.
      3. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter, og derefter tilsættes 15,5 ml af RT cDMEM og chloroquin at foretage en endelig koncentration på 25 uM.
    3. Aspireres medierne i hvert fad af 293FT celler og erstatte med transfektion løsning. Tilføj 16 ml af transfektion opløsningen langsomt, da de udpladede celler let fjerne.
    4. På D 3, efter 8 - 16 timer, fjern transfektion opløsning og vaske cellerne en gang med Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS), igen Taking pleje ikke at løsne cellerne. Udskift medie med 18 ml frisk cDMEM med 10 mM Hepes.
      BEMÆRK: Flyt langsomt retter, opsug transfektion løsning, og tilsæt medierne gennem sidevæggen af ​​plader for ikke at løsne cellerne.
    5. På D 4, efter 48 timer fra tidspunktet for transfektion, indsamle medierne fra skålene ved sugning langsomt med en pipette for ikke at løsne cellerne. Centrifuger de indsamlede medier ved 300 xg i 5 min for at udfælde det store cellerester.
    6. Filtrer den virale supernatant under anvendelse af en 0,45 um lav-protein-bindende filter kolbe og centrifugeres under anvendelse af en SW-28 rotor i 2 timer ved 50.000 xg og 4 ° C. Dekanteres umiddelbart efter centrifugeringsfaciliteterne finish og tørre indersiden af ​​røret med visker.
    7. Resuspender virale pellet i 50 pi Reduceret Serum Medium (RSM) med 1% FBS. Alikvoter kan opbevares ved -80 ° C til fremtidig brug (viral stamopløsning).
  3. Transducere lentiviruses ind i HCT116-celler og generere et panel af tdTomato-positive kloner.
    1. Plate HCT116-celler ved en densitet på 1 x 10 5 i 24 brønds plader 1 d før virusinfektion.
    2. Fortynd 40 pi resuspenderede virus (fra 2.2.7) i 4 ml RSM (1: 100 fortynding) med 1% penicillin / streptomycin og 8 ug / ml polybren (CRSM).
    3. På dagen for infektion, vaske cellerne en gang med DPBS, og derefter tilsættes 250 pi af fortyndet virus fra trin 2.3.2 til hver brønd. Der inkuberes i 4 timer ved 37 ° C og 5% CO2, og derefter tilføje 1 ml cDMEM til hver brønd; inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 48 - 72 timer.
    4. Resuspender cellerne med 1 ml 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA, og derefter tilsættes 1 ml cDMEM at neutralisere trypsin. Overfør cellerne til et mikrocentrifugerør og pellet ved 300 xg i 4 min. Vask pelleten 3x i 1 ml Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) plus 2% FBS.
    5. Resuspender pellet fra trin 2.3.4med FACS buffer (2% FBC og 2 mM EDTA i PBS) til et enkelt-celle suspension ved 1 x 10 6 celler / ml.
    6. Sortere tdTomato-positive HCT116 celler ved hjælp af en celle sorteringsanlæg, gating til PE-positive celler (excitation / emission: 556/585 nm). Dyrke de opsamlede celler i en 10 cm skål ved 5% CO2 og 37 ° C for at generere parentale tdTomato-positive HCT116-celler (figur 1A).
    7. Resuspender de parentale tdTomato-positive HCT116-celler fra 2.3.6 med 8 ml 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA til en 3 - 5 min, og tilsæt derefter 8 ml cDMEM at neutralisere trypsin.
      1. Overfør cellerne til et 50 ml rør og pellet ved 300 xg i 4 min. Fjern supernatanten og fortyndes de parentale tdTomato-positive HCT116 celler til 1 celle pr 200 pi i cDMEM (figur 1B).
    8. Plate en enkelt celle (200 pi af fortyndingen) pr brønd i en plade med 96 brønde ved 5% CO2 og 37 ° C (figur 1C).
    9. Grow individuelle monoclones i kolber ved 5% CO2 og 37 ° C. (Figur 1D).

3. Kalibrering af fluorescenssignal Intensitet som funktion af celleantal

  1. Plate de transficerede HCT116 celler, der nu benævnes HCT116-L2T, ved en densitet på 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 og 10 5 celler / brønd i plader med 96 brønde i triplikater for hver densitet.
  2. Efter 5 timers inkubation, kvantificere tdTomato fluorescerende intensiteter ved hjælp IVIS 10.
    1. Klik på ikonet billedet software på skrivebordet for at starte softwaren. Klik på knappen "Initialiser" for at initialisere billeddannende system. Efter initialisering finish (som tager omkring par min), skal du vælge "Fluorescence", "4 sekunder" eksponeringstid, "Medium" Binning, "2" F / stop, "535" excitation filter,og "580" emission filter.
    2. Placer plade med 96 på den billeddannende station og klik på "Acquire" for at starte billeddannelse. Når billedet er erhvervet, skal du klikke på "ROI Tools" i værktøjspaletten og vælg 12 x 8 fra ikonet slids.
    3. Opret 12 x 8 spalter til at dække det område signal på billedet af brønden pladen 96 og klik på fanen målinger. Overhold et vindue med en tabel over målinger ROI med enheder af fotoner pr s pr steradian per kvadratcentimeter (fotoner / s / sr / cm2).
  3. Konstruere en scatterplot med det argument (X-akse) svarende til antallet af celler og funktionen (Y-akse), der repræsenterer signalintensitet. Beregn regressionskurver bruger dataanalyse software til at beregne mængden af felter, der svarer til enheden af fluorescensintensitet (figur 2) 10.

4. dyremodel for levermetastaser

  1. Når HCT116-L2T cellerne når 70- 80% konfluens, forberede dem ca. 1 time før milten injektion. Dissociér cellerne ved hjælp af 0,05% trypsin i 0,53 mM EDTA til stillingen 3 - 5 min, og derefter neutralisere dem med et tilsvarende beløb af cDMEM. Sørg for at pipette grundigt for at undgå klumper.
  2. Tæl cellerne med en automatisk celletæller.
  3. Resuspender cellerne i 1x DPBS til en koncentration på 1,2 - 2 x 10 6 celler / 100 pi. Sørg for at pipettere og udeluk cellerne grundigt for at undgå klumper.
  4. Holde cellerne på is indtil injektion, lejlighedsvis resuspendering dem i røret.
  5. Forud for at bedøve musene, giver en præoperativ anæstesi og fluid bolus ved subkutan injektion af 500 pi af buprenorphin blandingen beskrevet i trin 1.3. Indgiv den samme dosis af yderligere buprenorphin blanding to gange om dagen, indtil tegn på smerte (nedsat mobilitet, foroverbøjet statur, manglende groom, vokalisering, når de håndteres) har løst.
  6. Bedøver 6- til 8-ugers-Gamle kvindelige athymiske nøgne mus med 2% isofluran i oxygen i en anæstesi kammer. Bekræft, at musene er helt under anæstesi ved at klemme halen. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Overfør hver bedøvet mus til en individuel næsekeglen for milten injektion. Før indsnit bør hver mus være dækket med en steril kirurgisk afdækningsstykke.
  7. Identificere milten som et violet område set udefra gennem huden på den venstre flanke af de nøgne mus. Under anvendelse mikrodissektions saks, gøre en 8 mm venstre flanke incision på huden lige over milten.
    1. Dernæst løftes op på bugvæggen og lave et lille snit. Lade luft ind i bughulen, således at de indre organer bevæge sig væk fra incisionssted. Forstør bugvæggen snit til ca. 5 mm.
    2. Expose milten ved forsigtigt at anvende pres omkring snittet med en vatpind. Hvis det er nødvendigt, kan den bugspytkirtlen fedt være forsigtigt mandipulated til at hjælpe med eksponering for ikke at skade milten.
  8. Injicer langsomt 100 pi celler under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 27 G nål ind i spidsen af ​​den eksponerede milt. Sprøjt langsomt over en periode på mindst 30 - 60 s, for at undgå ekstra levertumorer.
  9. Placer en microclip på milten før fjernelse af nålen ved afslutningen af ​​injektionen for at forhindre lækage af den injicerede celle suspension.
  10. Lad microclip på plads i 5 minutter.
  11. 5 min efter injektion, udføre en splenektomi anvendelse af en håndholdt cautery indretning til hæmostase. Dissekere milten hilum, begyndende fra den forreste side. Når dissekering store fartøjer, præ-koagulere den proximale side af beholderne med tilstødende fedtvæv under anvendelse cautery at undgå overdreven blødning.
    BEMÆRK: Metoder til hæmostase: koagulere blødningen punkt direkte med cautery, lægge pres på blødningen point til stillingen 3 - 5 min, eller sutur-ligere blødningen point med en 5-0 silke slips. Luk flanke indsnit i hver mus i to lag. Først lukke bugvæggen med en 5-0 absorberbar flettet sutur (fx Vicryl) i en enkelt horisontal søm. Dernæst lukkes huden ved hjælp af en 4-0 ikke-absorberbar monofilament sutur (f.eks prolene), igen med et enkelt horisontalt søm.
  12. Rengør alle instrumenter ved at sprøjte 70% isopropanol at opretholde sterile forhold mellem hver procedure.
    BEMÆRK: Sørg for, at dyrene er varmet, mens de vågne fra bedøvelsen. Overvåg alle mus postoperativt, indtil de bliver ambulant og vende tilbage til normal aktivitet. Typisk restitutionstid er ca. 3 - 5 min. Efterlad ikke dyr uden opsyn, indtil de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil den er fuldt tilbagebetalt.

5. In vivo Bioluminescent Imaging

  1. Udfør imaging påugebasis at måle og kvantificere ændringer i bioluminescens over tid.
  2. Placer mus i en anæstesi kammer og bedøver dem med 2% isofluran i oxygen. Bekræfter, at musene er helt under anæstesi ved at klemme halerne. Brug dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
  3. Næste, intraperitonealt injiceres hver mus med 150 pi af preprepared ildflue luciferin fra trin 1.4.
  4. Placer mus i en IVIS med individuelle næse kegler administrerer isofluran. Placer mus i rygleje med afstandsstykker imellem at minimere signal til tilstødende mus. Højst fem mus kan afbildes på en gang.
  5. Mål og analysere bioluminiscerende intensiteter 3 min efter luciferin injektion.
    1. Efter initialisering af IVIS som beskrevet i trin 3.2.1, skal du vælge "Selvlysende", "1 sekund" eksponeringstid, og "Medium" binning.
    2. Klik på knappen "Acquire" for at starte imaging. Sørg for at udføre hver billeddannelse på en konsekvent tid (3 min) efter luciferin injektion.
    3. Når billedet er erhvervet, vil et billede vindue og værktøjspaletten vises. Klik på "ROI Tools" og vælg "1", "2", "3", "4" eller "5" fra ikonet cirkel, svarende til antallet af mus afbildet.
    4. For at definere områder af interesse (ROI), cirkel signal område af selvlysende signal i bughulen af musen, og klik derefter på "målinger" af ROI som en vilkårlig enhed af radiant effektivitet ((fotoner / s / cm2 / steradian) / (pW / cm2)). Sørg for at have en ekstra ROI kreds af baggrunden.
  6. På fire uger efter injektion og før dyr offer, udføre diffus Selvlysende Imaging Tomography (DLIT) ved hjælp IVIS at vurdere tumor byrde og fordeling ved hjælp af real-time 3D rekonstruktion af bioluminiscerende intensiteter af de enkelte tumor kolonier. Bedøver musene og injicere luciferin, som beskrevet i trin 5.2.4. DLIT udføres på en mus ad gangen.
  7. Efter initialisering af IVIS, som beskrevet i trin 3.2.1, skal du vælge "Imaging guiden", "Bioluminescens", og klik "Næste". Vælg "DLIT" og klik "Næste". Vælg "Firefly" sonder og klik på "Næste". Vælg "mus" image emne, "Auto" eksponering parameter, "C-13 cm" synsfelt, og "0,5 cm" emne højde, og klik på "Næste". Klik på "Acquire" knappen for at starte billeddannelse.
  8. Når billedet er erhvervet, skal du vælge "DLIT 3D Reconstruction" fanen og "Analyze" fanen og klik på "Rekonstruer" for at generere 3D-rekonstruktion billedet.
  9. Klik på "Funktioner" og "3D Animation". Vælg "Spin CCW på Y-aksen" i 3D-animation vinduet. Klik på "Optag" og "Gem" i en .mov format fil.

6. Ex Vivo Fluorescent Imaging

  1. Sacrifice musene ved cervikal dislokation, mens bedøvet, eller i henhold til de institutionelle retningslinjer på 4 - 6 uger efter milten injektioner.
  2. Høst leveren. Lav et vandret snit fra venstre til højre flanke. Opsigtsvækkende xiphoid proces med en pickup, dissekere falciforme, den hepatiske vene, og den nedre vena cava.
    1. Skær den rigtige hepatorenalt ligament, den hepatoduodenal ledbånd, og den venstre hepatorenalt ledbånd, pas på ikke at skade caudatus lap mens dissekere den hepatoduodenal ledbånd. Efter høst leveren, fjerne galdeblæren, da dette vil vise autofluorescens. Notér eventuelle yderligere ekstra levertumorer tilstedeværende.
  3. Vær opmærksom på antallet og størrelsen af ​​levertumorer stede makroskopisk, og placere de høstede lever i DPBS.
    BEMÆRK: Tumorer er makroskopisk synlige for det blotte øjesom hvide tumorer (for et repræsentativt eksempel, se figur 4).
  4. Forud for placering på imaging ark, tage hver leveren og forsigtigt fjerne overskydende væske ved at duppe på en papirserviet.
  5. Måle fluorescensintensiteter fra hver tumor koloni hjælp IVIS.
    1. Vælg "Fluorescence", "4 sekunder" eksponeringstid, "Medium" Binning, "2" F / stop, "535" exciteringsfilter, og "580" emission filter. Klik på "Acquire" knappen for at starte billeddannelse.
    2. Efter modtagelse af billedet, find vinduet billedet og værktøjspaletten. Klik på "ROI Tools" og vælg "1" fra ikonet cirkel. For at definere ROI'er, cirkel signal område af individuelle tumor kolonier på billedet, og klik derefter på "målinger" af ROI som en vilkårlig enhed af radiant effektivitet ((fotoner / s / cm2 / steradian) / (pW / cm2) ). Sørg for at have en ekstra ROI kreds af baggrunden.
    3. Beregn den samlede tumor volumen ved at antage, at det er en kugle. Tumorvolumen = 4 x π xr 3/3 (r = radius). Beregn den del af tumor kolonidannende celler (FC) som antallet af tumorer i leveren divideret med antallet af celler splenically injiceres.
    4. Beregn det samlede antal celler pr koloni (= X) fra den lineære tilnærmelse fra trin 3.3. Beregne antallet af celledelinger (= Y) som Y = log 2 X og Td, Td (dag) = 28 / Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med dette forsøg var at etablere en sammenhængende og let reproducerbar dyremodel med potentiale for den serielle kvantificering af in vivo metastatisk tumor byrde og for estimering af koloniserende frekvens og vækst kinetik udvikle levermetastaser. Figurerne 2-6, med legender, leveres fra vores tidligere publikation under en Creative Commons CC-BY-licens 10.

Generation af Double-mærket Tumor Cell Monoclones

Først blev et panel af luminescerende og fluorescerende mærkede monoklonale cellelinjer genereret med forskellige metastatiske evner. Efter en vellykket transfektion af selvlysende (Luc2) og fluorescerende (tdTomato) proteiner i forældrenes HCT116 kolorektal cancer celler, blev 16 dobbeltværelser-mærket monoclones genereret ved at fortynde forældrenes HCT116-L2T celler til 1 celle / 200 pi i 96 brønds plader (figur 1) 10. In vitro fluorescens og luminescens af HCT116-L2T blev derefter kvantificeret under anvendelse af en stigende mængde celler til at estimere antallet af tumorceller fra in vivo og ex vivo levertumor imaging (figur 2) 10.

Metastaser Udvikling af Clones med Differential Liver Colonization

Dernæst at generere levermetastaser, de 16 tidligere genererede individuelle HCT116-L2T kloner blev intramilt injiceret i mus; en splenektomi blev derefter udført. Udviklingen af levermetastaser blev overvåget ved ugentlige in vivo bioluminescerende billeddannelse, efterfulgt af ex vivo fluorescerende billeddannelse efter at ofre musene. Ud af de 16 monoclones genereret, valgte vi kloner betegnet som P1, P2, O1 og O2, på grund af deres different observerede kolonisering og vækst kapaciteter i leveren. Kloner O1 og O2 havde en mindre tumorbyrde, der repræsenterer "oligometastatic" kloner, og potentielt den gentog en fænotype af begrænset metastatisk sygdom. Kloner P1 og P2 havde en større tumorbyrde, der repræsenterer omfattende udbredelse, som også omtales som polymetastatic sygdom. Den bioluminescens var højere i P1 og P2 mus (6,7 × 10 6 ± 4,7 × 10 6 og 3,6 × 10 6 ± 2,5 × 10 6 fotoner / s / cm2 / steradian) sammenlignet med O1 og O2 mus (2,0 × 10 5 ± 1,3 × 10 5 og 1,7 × 10 5 ± 9,1 × 10 4 fotoner / s / cm2 / steradian) 3 uger efter milten injektion (figur 3A, B) 10. Kvantificeringen af ex vivo fluorescens af leverne ved 4 uger efter milten injektion viste, at P1 og P2 lever havde højere Lysstofrørcent intensiteter sammenlignet med O1 og O2 lever (figur 3C). Tumoren fordelinger i ex vivo fluorescerende billeder var i overensstemmelse med makroskopiske fund (figur 3C, D) 10.

Kolonisering og vækst Kinetik af individuelle kloner

Antallet og størrelser af tumorer visualiseret makroskopisk blev talt og målt i hvert enkelt leveren. Desuden blev ex vivo fluorescensimagografi foretages af hvert enkelt tumor koloni for hver monoclone (figur 4) 10. Det samlede antal tumorer i P1 var højere, sammenlignet med P2, O1 og O2, mens størrelsen af tumorer var større i P2 end i P1, O1 og O2 (p <0,001, figur 5A, B) 10. Det samlede tumorvolumen i leveren i P1 og P2 var imidlertid større sammenlignet med O1 og O2 (figur 5C) - 5 ± 1,1 × 10 - 5, med 6,0 × 10 - er 6 ± 2,3 × 10 - 6 under P1 og O1 henholdsvis p <0,001, figur 5D) 10. Selvom P2 havde en lignende evne til at kolonisere leveren som kloner O1 og O2, størrelsen af ​​tumorerne genereret var større end de andre kloner. Det samlede antal celler pr tumor koloni, Td, og antallet af celledelinger kan beregnes ud fra disse data ved hjælp af kalibrering tidligere Genbejdede fra korrelationen mellem fluorescerende intensitet og antallet af celler (figur 2 og 5E - G) 10. P1, som har frembragt mange små tumorer i leveren, som ses ved makroskopisk visuel inspektion, havde en større Fc, selvom det havde en Td ligner O1 og O2 (p <0,05). P2, som genererede et begrænset antal makroskopiske store tumorer, havde en lignende Fc men en kortere Td forhold til O1 og O2 (p <0,05). Taget sammen indikerer disse resultater, at Fc og Td er to nøgleparametre bidrager til metastatisk potentiale.

3D fordeling af metastatiske tumorer i leveren blev demonstreret ved DLIT (figur 6) 10. Ved anvendelse af denne billeddannelse teknik, er det muligt at overvåge rumlig-tidslig dynamiske opførsel af metastaser ved påvisning og måling af bioluminescens af individuelle hepatiske metastatiske kolonier.

De genererede data blev analyseret ved anvendelse af standard dataanalyse software, og fejlsøjler blev påvist som middelværdi ± standardafvigelse. Pearsons korrelationskoefficienter blev brugt til at evaluere associationer mellem parametre. P-værdierne blev vurderet ved anvendelse af 2-tailed Students t-test, med et p <0,05 betragtes som statistisk signifikant.

figur 1
Figur 1:. Dannelse af et panel af Monoclones mærket HCT116 Cells (A) Grow forældrenes HCT116 celler mærket med luciferase og tdTomato. (B) fortyndes parentale HCT116 celler til 1 celle / 200 pi. (C) Plade 200 pi af fortyndingen i en plade med 96 brønde. (D) Grow monoclones fra hver brønd i 96 brønd pladen. (E) indsprøjtes monoclones intramilt i mus til at generere levermetastaser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Estimering af antallet af celler af fluorescensintensiteter (A) luminescerende foto af forskellige antal celler triplikerede i en plade med 96.. (B) Sammenhængen mellem antallet af celler og luminescens (R = 0,99, p <0,0001). Skalaen søjle repræsenterer selvlysende intensitet (fotoner / s / cm2 / steradian). (C) Den fluorescerende billede af forskellige antal celler triplikerede i en plade med 96 brønde. intensiteter vire erhvervet som strålende effektivitetsgevinster med en 535 nm excitation og et 580 nm emission. (D) forholdet mellem antallet af celler og fluorescens (R = 0,99, p <0,0001). Skalaen søjle repræsenterer den fluorescerende intensitet i en vilkårlig enhed af strålevarme effektivitet ((fotoner / s / cm2 / steradian) / (pW / cm2)). Genoptrykt med tilladelse 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Bioluminescens og E x Vivo Fluorescens af leveren i udvalgte kloner (A) Repræsentative bioluminescerende billeder.. Skalaen søjle repræsenterer selvlysende intensity (fotoner / s / cm2 / steradian). (B) Bioluminescens målt ugentligt fra 1 - 3 uger i P1 og P2, og 1 - 4 uger i O1 og O2. Data blev repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse. (C) repræsentant ex vivo fluorescerende billeder af lever. Intensiteter blev erhvervet som strålende effektivitetsgevinster med en 535 nm excitation og et 580 nm emission. Skalaen søjle repræsenterer fluorescensintensitet i en vilkårlig enhed af strålevarme effektivitet ((fotoner / s / cm2 / steradian) / (pW / cm2)). (D) Makroskopisk liver billeder (pile indikerer små hvide tumorer). P1 og P2: polymetastatic kloner, O1 og O2: oligometastatic kloner. Genoptrykt med tilladelse 10. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 4:. Kvantificering af fluorescerende intensiteter af Individual Lever Kolonier billeder til venstre er repræsentative makroskopiske fund og billeder til højre er fluorescerende intensiteter i hver klon. De fluorescerende intensiteter er erhvervet som strålende effektivitetsgevinster med en 535 nm excitation og et 580 nm emission. P1 og P2: polymetastatic kloner, O1 og O2: oligometastatic kloner. Genoptrykt med tilladelse 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Kvantitativt skøn af koloniseringsevne og Vækst Kinetics ( (B) makroskopisk størrelse af individuelle tumorer, (C) beregnet samlede tumorvolumen i leveren, (D) koloniserer del af tumor kolonidannende celler (Fc), (E) samlede celleantal pr koloni, (F) fordoblingstid (Td), og (G) antal celledelinger af hver klon. P1 og P2: polymetastatic kloner, O1 og O2: oligometastatic kloner. Data blev repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for alle tal paneler, hvor fejlsøjler blev vist. Genoptrykt med tilladelse 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Quantificatipå af Bioluminescens af Individuelle Tumor Kolonier hjælp Diffus Selvlysende Imaging Tomography (DLIT). (A) 3D visning ovenfra. Skalaen søjle repræsenterer fluorescerende intensitet i en vilkårlig enhed af strålende effektivitet. (B) koronale snit. (C) Sagittal sektion. (D) transaksial sektion. (E) Makroskopisk billede af leveren. (F) Ex vivo fluorescerende billede af leveren. Genoptrykt med tilladelse 10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dyret model præsenteres i den aktuelle rapport er baseret på to store tilgange. Først, for at sikre evnen til at iagttage metastatiske kloner med forskellige tilbøjeligheder til at kolonisere og proliferere i leveren, blev et panel af stærkt heterogen monoklonale cellelinjer etableret, frem for en etableret ufraktioneret cancercellelinie 12,13. Det monoklonale tilgang til metastase udvikling er begrundet i de seneste genomiske data 14 og blev med succes anvendt tidligere til at modellere den metastatiske proces 10,15,16. For det andet, var dobbelt-mærkning af den parentale cellelinje ved luciferase og tdTomato markører inkorporeret for at tilvejebringe forbedret analyse af metastatisk vækst både in vivo og ex vivo. Det luminescerende og fluorescerende mærkning muliggør en detaljeret anatomisk undersøgelse og potentiel kvantificering af både mængden af ​​metastatiske tumorer (betragtes som frekvensen eller virkning liver colonization) og størrelsen af ​​en individuel koloni. Sidstnævnte kan let omdannes til en faktisk antal celler under anvendelse af en simpel kalibreringsprocedure beskrevet i trin 2 og figur 2 10 og 4 10. Hjælp af disse data er det muligt at estimere Td for hver metastatisk knudepunkt i leveren og evaluere vækstkinetik af levermetastaser for hver oprindelig monoclone injiceret (figur 5) 10.

Tre forskellige colorektale metastatiske fænotyper blev observeret i dette eksperimentelle system, angivet som P1, P2, og O1 / O2. Disse metastatiske fænotyper afveg når man sammenligner data fra hyppigheden af ​​kolonisering og lokale vækstrater for hver metastatisk klon. Den første metastatisk fænotype, P1, demonstrerede en forøget evne til at kolonisere leveren, men en relativt lav lokal vækst, der svarer til mange små metastatiske tumorer i hele leveren. Den anden metastatisk fænotype, P2, havdeen lavere frekvens af kolonisering men en markant højere lokal vækst, hvilket resulterer i et relativt lille antal store sekundære tumorer. Endelig den tredje metastatisk fænotype, O1 og O2, demonstrerede både en lav frekvens af kolonisering og langsomme lokale vækstrater. Denne tredje metastatisk fænotype kan betragtes som en repræsentation af kliniske oligometastatic leversygdom (figur 3 10 og 5 10). Desuden genekspression analyse sammenligner disse kloner 10 identificerede væsentlige forskelle i ekspressionsmønstre. For eksempel, når man sammenligner P1 med O1 og O2-kloner, der var 756 differentielt udtrykte gener, herunder en delmængde af gener involveret i inflammatoriske responser og interferon-signalering. Denne undersøgelse, såvel som andre, har impliceret disse gener i at spille centrale roller i tumorvækst og overlevelse 21, 22. Hertil kommer, når man sammenligner P2 til O1 og O2, der var 461 forskelligt expressed gener, med en delmængde involverer gener kritiske for cellulær vækst og proliferation medieret gennem ERK1 / 2 signalering.

Mangfoldigheden af ​​metastatiske fænotyper fremstillet ved denne forsøgsmodel er i overensstemmelse med de observerede kliniske repræsentationer af metastatisk heterogenitet. For eksempel er det blevet vist, at størrelsen af levermetastaser (en parameter forbundet med potentiel vækst) og deres numre (en parameter relateret til etableringsevne) er uafhængige risikofaktorer for fjernmetastase 1. Med forbedret vækstpotentiale eller kolonisering evne, de observerede i P1 og P2 egenskaber er i overensstemmelse med disse data. Desuden seneste observationer af patienter behandlet med stereotaktisk Krop Radio-terapi (SBRT) eller med kirurgisk resektion lungemetastaser peger både til antallet af tumorer og den udviklingshastighed som centrale faktorer, der bestemmer den samlede og sygdomsfri udfald 17,18. Således kolonisering og vækst evner synes atvære blandt de mest kritiske faktorer til at bestemme udviklingen af metastatiske kloner på fjerne steder 19,20. Forsøgsmodeller, som er baseret på disse egenskaber metastatiske kloner, kan tilvejebringe nyttige værktøjer til at forstå mekanismerne i metastase udvikling, samt tilvejebringe et middel til afprøvning af nye behandlingsmodaliteter for helbredelse af leveren metastatisk sygdom.

Mens en orthotopisk model kan producere spontane metastaser er ideel, er der stadig for få let reproducerbare og konsekvente spontane modeller. Mens modeller anvender intracecal implantation eller injektioner er blevet beskrevet, de viste variable satser for optagelse og metastase dannelse 23-26. Andre fremgangsmåder har udnyttet en ektopisk implantation tilgang ved milten eller intraportal injektion for at generere levermetastaser. Selv om det overordnede teknik til injektion er den samme, den model præsenteres her tilvejebringer en følsom metode til understanding mekanismerne i metastase udvikling, startende fra scenen af ​​cirkulerende tumorceller (CTC). Følsomhed og reproducerbarhed i vores tilgang er bestemt af den dobbelt-mærkning af de cellelinjer at give mulighed for både selvlysende og fluorescerende billeddannelse til at spore dynamikken i den metastatiske proces. På grund af evnen til at kvantificere metastatisk byrde fra luminescerende og fluorescerende data, er det muligt systematisk at måle og spore vækstkinetikken af ​​metastaser over tid. Selvom alternative tilgange, såsom ultralyd-baserede imaging, er blevet anvendt, er disse modaliteter er langt mere brugervenlige afhængige, med potentielt øget inter-bruger variabilitet 27. Desuden ved at generere et panel af monoklonale cellelinier, er vi i stand til at give reproducerbare og tydelige metastatiske fænotyper for bedre model variabiliteten af ​​metastatisk sygdom observeret i den kliniske indstilling.

Mens mastering denne eksperimentelle teknik,specifikt milten injektion til in vivo-musemodellen (se trin 4), der er et par kritiske trin, der kan kræve modifikation. Af note, udfører milt injektion er den vigtigste del af modellen, som en utilstrækkelig injektion af milten kan resultere i dårlige resultater. Udsivning af celler under injektionen, eller lækage forårsaget af uhensigtsmæssig placering af microclip, kan resultere i et lavere antal levermetastaser og / eller en betydelig mængde ekstra-levertumorer eller peritoneal carcinomatoses. Desuden er det vigtigt at injicere tumorcellerne langsomt, i mindst så længe som beskrevet i protokollen, for at undgå en forøgelse af trykket i milten, hvilket kan føre til ekstravasation af cellerne i de tilstødende væv og væksten af ekstra-levertumorer omkring stubben af ​​milten dissektion.

Endelig i trin 4.3, er der en række celler givet for milten injektion (1,2 - 2 x 10 6 </ Sup> celler). Formålet med denne serie er at tage højde for individuelle operatører af denne teknik. Det kan tage tid at kalibrere et optimalt antal celler til at injicere. Hvis for få celler injiceres, kan levermetastaser ikke udvikle konsekvent, og hvis for mange celler injiceres, kan der forekomme portal venøs okklusion, der fører til tidlig død af dyret. Det kan være klogt at begynde med prøve flere forskellige koncentrationer af tumorceller ved start denne model for at finde det optimale antal.

En faldgrube af det præsenterede model er, at den er baseret på en xenograft tilgang og udnytter immundefekte nøgne mus. En alternativ metode foreslået er dannelsen af en tilsvarende panel af monoklonale derivater af den murine kolorektal cellelinie MC38, dobbelt-mærket med luciferase og tdTomato eller EGFP proteiner. Disse kloner kan derefter anvendes i syngene dyremodeller for at fange de interaktioner af udviklingslandene levermetastaser med værten IMMUne system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) for Luc2-tdTomato plasmidet og HCT116 cellelinie, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) for mus styring, og Dr. Lara Leoni for bistand med DLIT. Kvantificering af fluorescerende og selvlysende intensiteter blev udført i det integrerede Mindre Husdyrs Imaging Research Ressource på University of Chicago den en IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Dette arbejde blev støttet af Virginia og DK Ludwig fond for Cancer Research, Lung Cancer Research Foundation (LCRF), Prostate Cancer Foundation (PCF) og Cancer Center Support Grant (P30CA014599). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).

Tags

Cancer Research Oligometastases heterogenitet levermetastaser kolorektal cancer eksperimentel model milt injektion, vækstkinetik
Advanced Animal Model af kolorektal Metastase i Lever: Imaging teknikker og Ejendomsstyrelsen mod metastatiske kloner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman,… More

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter