Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

Patiënten met een beperkt aantal levermetastasen en langzame snelheden van progressie succes kan worden behandeld met lokale behandeling benaderingen 1,2. Er is echter weinig bekend over de heterogeniteit van levermetastasen en diermodellen staat zijn de ontwikkeling van afzonderlijke metastatische kolonies nodig. Hier presenteren we een geavanceerd model van levermetastasen dat het vermogen om kwantitatief visualiseren de ontwikkeling van individuele klonen tumor in de lever en schatten hun groeikinetiek en kolonisatie efficiëntie wordt bereikt. We genereerden een paneel van monoklonale derivaten van HCT116 humane colorectale kankercellen stabiel gelabeld met luciferase en tdTomato en die verschillende groei-eigenschappen. Met een milt injectie, gevolgd door een splenectomie, de meerderheid van deze klonen kunnen levermetastasen genereren, maar met verschillende frequenties kolonisatie en variërende groei. Met behulp van de in vivo beeldvorming System (IVIS), is het mogelijk te visualiseren en kwantificeren metastase ontwikkeling van in vivo en ex vivo luminescerende fluorescente beeldvorming. Bovendien Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) een 3D verdeling van levermetastasen in vivo. Ex vivo fluorescentie beeldvorming van geoogste levers levert kwantitatieve metingen van afzonderlijke hepatische metastatische kolonies, waardoor de evaluatie van de frequentie van de lever kolonisatie en groeikinetiek van uitzaaiingen. Omdat het model lijkt op klinisch waargenomen levermetastasen, kan het dienen als een modaliteit voor het detecteren van genen geassocieerd met levermetastasen en voor het testen van potentiële ablatieve of adjuvante therapieën voor lever metastasen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Patiënten met levermetastasen van primaire colorectale kanker (CRC) worden gekenmerkt door een slechte prognose. De 5-jaarsoverleving voor de primaire nonmetastatic CRC (stadium I - III) wordt geschat op 75-88% 3,4, terwijl patiënten met leveruitzaaiingen (fase IV) hebben een 5-jaarsoverleving van slechts 8 - 12% 5 , 6. Echter, metastatische patiënten vormen een heterogene groep, die zich presenteren met verschillende aantallen metastasen en verschillende herhaling tijden. Klinische waarnemingen geven aan dat het aantal metastasen en de grootte van een enkele metastase (evenredig aan de plaatselijke groeisnelheid) (die evenredig koloniserend vermogen of de frequentie van kolonisatie kan zijn) onafhankelijke prognostische factoren 1,7. Met andere woorden, het succes van klonen metastatische kolonisatie van de lever is afhankelijk van twee belangrijke eigenschappen: ze kunnen groeien en hun vermogen om te verspreiden en te overleven in de lever micromilieu.

Het ontwerpsuccesvolle klinische modellen met de mogelijkheid van het vastleggen en kwantificeren van de eigenschappen van metastatische klonen drastisch ons begrip van levermetastasen biologie verbeteren en een effectief hulpmiddel voor het ontwerpen van mogelijke therapeutische benaderingen. Modellen van experimentele levermetastasen zijn eerder gerapporteerd 8,9, maar geen van beide ontvangen het vermogen om kwantitatief vast te leggen en te beschrijven eigenschappen van afzonderlijke uitgezaaide klonen zowel in vivo als ex vivo.

Hier presenteren we een nieuwe geavanceerde model van levermetastasen dat de vorming van tumor klonen met verschillende efficiënties lever kolonisatie en groei eigenschappen omvat. We gebruikten een combinatie van dubbele-labeling van kankercellen met luciferase en tdTomato fluorescerend eiwit met de productie van monoklonale cellijnen die intrinsieke verschillen in metastatische capaciteit. In dit experimentele model, de gegevens blijkt dat de ontwikkeling vanlevermetastasen kan worden beschreven in termen van frequentie en kolonisatie verdubbelingstijd (Td), wat overeenkomt met klinische waarnemingen. De kwantitatieve karakter van dit model maakt het gemakkelijk adoptable voor de ontdekking van geneesmiddelen en diagnostische doeleinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Chicago (Protocol # 72213-09) en uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

1. Voorbereidingen

  1. Voeg 500 ml medium voor de kweek van HCT 116 tumorcellen: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine.
  2. Autoclaaf de instrumenten die worden gebruikt voor de milt injectiemodel, waaronder 3-4 chirurgische handdoeken, gaas, twee kleine Adson pickups, een naald driver, twee scharen, een klemmetje en 3 microclips, bij 251 ° F gedurende 20 min .
  3. Bereid postoperatieve anesthesie voor de muizen subcutaan worden toegediend na de milt injectie. Verdun 2-4 ug buprenorfine in 500 ul van 0,9 fysiologische zoutoplossing per muis.
  4. Bereid hoeveelheden van 150 ug / 150 pl van vuurvlieg luciferine voor intraperitoneale injecties during de bioluminescentie assays. Bewaren bij -20 ° C en beschermen tegen licht.

2. Genereren van Luciferase / tdTomato gemerkte monoklonale cellijnen 10,11

  1. Ontdooien en onderhouden HCT116 humane colorectale kankercellen en 293FT humane embryonale niercellen in DMEM met 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine. Handhaven in de cultuur bij 5% CO 2 en 37 ° C.
  2. Maak een high-titer lentivirus.
    1. Op D 1, plate 10 - 12 x 10 6 293FT cellen tussen passage 3 en 10 in 15 cm celcultuurschalen in 18 ml compleet DMEM (cDMEM) met 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine en 1% niet-essentiële aminozuren . Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
    2. Op D 2, transfecteren van de cellen met het volgende transfectie oplossing:
      1. Voor elk gerecht, gebruikt u de volgende: een DNA-mengsel van 37,5 ug pFUG lentivirale vector ingebracht met de luciferase (Luc2) en tdTomatoconstrueert 11 (een gift van Dr. Geoffrey Greene aan de University of Chicago), 25 ug pCMVΔ8.74 en 12,5 ug pMD2.G geresuspendeerd in een totaal van 1062 pl steriel H2O Voeg 188 ul van 2 M CaCl2.
      2. Voeg 1250 ul 2x Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4, en 180 mM NaCl, pH 7,12) bij de DNA / CaCl2 oplossing werd een druppelsgewijs, terwijl bellenblaas via oplossing met een pipet.
      3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min en voeg 15,5 ml RT cDMEM en chloroquine tot een eindconcentratie van 25 uM maken.
    3. Aspireren de media in elk gerecht van 293FT cellen en te vervangen door de transfectie oplossing. Voeg 16 ml van de transfectie oplossing langzaam, zoals de vergulde cellen gemakkelijk los te maken.
    4. Op D 3, na 8-16 uur, verwijder de transfectie-oplossing en was de cellen eenmaal met Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), opnieuw taking zorg de cellen niet te verjagen. Vervang de media met 18 ml vers cDMEM met 10 mM Hepes.
      OPMERKING: Verplaats gerechten, zuigen de transfectie oplossing en voeg de media door de zijwand van de platen om te voorkomen dat de cellen los te maken.
    5. Op D 4, bij 48 uur vanaf het moment van transfectie, laat de inhoud van de gerechten door langzaam opzuigen met een pipet om te voorkomen dat de cellen los te maken. Centrifugeer de verzamelde media bij 300 xg gedurende 5 minuten om de grote celafval neer te slaan.
    6. Filtreer het virale supernatant met een 0,45 urn lage eiwitbinding filter kolf en centrifuge met een SW-28 rotor gedurende 2 uur bij 50.000 xg en 4 ° C. Decanteer het supernatant onmiddellijk na het centrifugeren voltooid en droog de binnenzijde van de buis met wissers.
    7. Resuspendeer de virale pellet in 50 ul van Reduced Serum Medium (RSM) met 1% FBS. Aliquots kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik (virusvoorraad).
  3. Transduceren de lentiviruses in de HCT116-cellen en het genereren van een panel van tdTomato-positieve klonen.
    1. Plaat de HCT116-cellen in een dichtheid van 1 x 10 5 in 24 putjes 1 d vóór de virale infectie.
    2. Verdun 40 pi geresuspendeerde virus (uit 2.2.7) in 4 ml RSM (1: 100 verdunning) met 1% penicilline / streptomycine en 8 ug / ml polybreen (CRSM).
    3. Op de dag van infectie was de cellen eenmaal met DPBS en voeg 250 ul verdunde virusoplossing uit stap 2.3.2 aan elk putje. Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C en 5% CO2 en voeg 1 ml cDMEM aan elk putje; incuberen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 48-72 uur.
    4. Resuspendeer de cellen met 1 ml 0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA en voeg 1 ml cDMEM de trypsine te neutraliseren. Overdracht van de cellen naar een microcentrifugebuis en pellet bij 300 g gedurende 4 min. Was de pellet 3x in 1 ml Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) plus 2% FBS.
    5. Resuspendeer de pellet uit stap 2.3.4met FACS buffer (2% FBCS en 2 mM EDTA in PBS) in een enkele-celsuspensie bij 1 x 10 6 cellen / ml.
    6. Sorteer de tdTomato-positieve HCT116 cellen met behulp van een cel sorter, venstertijd voor PE-positieve cellen (excitatie / emissie: 556/585 nm). Groeien de verzamelde cellen in een 10 cm schotel bij 5% CO 2 en 37 ° C op ouderschapsverlof tdTomato-positieve HCT116 cellen (Figuur 1A) te genereren.
    7. Resuspendeer de ouderlijke tdTomato-positieve HCT116 cellen van 2.3.6 met 8 ml van 0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA gedurende 3-5 minuten en voeg 8 ml cDMEM om de trypsine te neutraliseren.
      1. Overdracht van de cellen om een ​​50 ml buis en pellet bij 300 g gedurende 4 min. Verwijder de bovenstaande vloeistof en verdun de ouderlijke tdTomato-positieve HCT116 cellen 1 cel per 200 pl in cDMEM (Figuur 1B).
    8. Plaat een enkele cel (200 ul van de verdunning) per putje in een 96-putjes plaat bij 5% CO2 en 37 ° C (Figuur 1C).
    9. Grow individuele monoclones in kolven bij 5% CO 2 en 37 ° C. (Figuur 1D).

3. Calibration van Fluorescent intensiteit van het signaal als een functie van het aantal cellen

  1. Plaat de getransfecteerde HCT116 cellen, nu aangeduid als HCT116-L2T, bij een dichtheid van 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4, en 10 5 cellen / putje in 96 putjes in triplo voor elke dichtheid.
  2. Na 5 uur incubatie kwantificeren tdTomato fluorescentie intensiteiten middels IVIS 10.
    1. Klik op het icoon software-image op het bureaublad om de software te starten. Klik op de "initialiseren" toets om de imaging-systeem initialiseren. Na de initialisatie is voltooid (dat duurt ongeveer paar min), selecteer "Fluorescentie", "4 seconden" belichtingstijd, "Medium" binning, "2" F / stop, "535" excitatie filter,en "580" emissie filter.
    2. Plaats de plaat met 96 op de imaging station en klik op "Ophalen" om beeldvorming te starten. Nadat het beeld wordt verkregen, klikt u op "ROI Tools" in het palet en selecteer 12 x 8 van het pictogram spleet.
    3. Maak een 12 x 8 spleten om het gebied van het signaal op het imago van de plaat met 96 dekken en klik op het tabblad metingen. Observeer een venster met een lijst van ROI metingen met eenheden van fotonen per s per steradiaal per vierkante cm (fotonen / s / sr / cm2).
  3. Teken een scatterplot met het argument (X-as) gelijk aan het aantal cellen en de functie (y-as) die signaalintensiteit. Bepalen regressiekrommen met een gegevensanalyse software om de hoeveelheid cellen die overeenkomt met de eenheid van fluorescentie-intensiteit te berekenen (figuur 2) 10.

4. diermodel van leveruitzaaiingen

  1. Zodra de HCT 116-L2T cellen te bereiken 70- 80% confluentie, bereid ze ongeveer 1 uur voor de injectie milt. Distantiëren de cellen met behulp van 0,05% trypsine in 0,53 mM EDTA gedurende 3-5 minuten, en vervolgens neutraliseren ze met evenveel cDMEM. Zorg ervoor dat u grondig pipet om klonteren te voorkomen.
  2. Tel de cellen met een automatische cel teller.
  3. Resuspendeer de cellen in 1x DPBS tot een concentratie van 1,2-2 x 10 6 cellen / 100 pl. Zorg ervoor dat u pipet en resuspendeer de cellen grondig te klonteren te voorkomen.
  4. Houd de cellen op ijs tot injectie, ze af te resuspenderen in de buis.
  5. Voorafgaand aan de muizen verlamming, bieden een preoperatieve verdoving vloeistofbolus door subcutaan injecteren 500 pi van de buprenorfine mengsel in stap 1.3 beschreven. Dien dezelfde dosis buprenorfine aanvullende mengsel tweemaal per dag tot tekenen van pijn (verminderde mobiliteit, gebogen gestalte, niet verzorgen, vocalisatie bij hantering) opgelost.
  6. Verdoven 6- tot 8-weekse-old vrouwelijke athymische naakt muizen met 2% isofluraan in zuurstof in een anesthesie kamer. Controleer of de muizen volledig onder verdoving door knijpen de staart. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving. Transfer elk verdoofd muis om een ​​individuele neuskegel van de milt injectie. Vóór incisie moet elke muis worden bedekt met een steriele chirurgische doek.
  7. Identificeer de milt als paarse gebied buiten gezien door de huid op de linkerflank van het naakt muizen. Met behulp van microdissectie schaar, maak een 8 mm linker flank incisie op de huid net boven de milt.
    1. Vervolgens til op de buikwand en maak een kleine incisie. Zodat de lucht in de buikholte is de inwendige organen verder weg van de incisie. Vergroot de buikwand incisie tot ongeveer 5 mm.
    2. Expose de milt door voorzichtig druk uit te oefenen rond de incisie met een wattenstaafje. Indien nodig kan de pancreas vet voorzichtig manipulated om blootstelling om te voorkomen dat de milt verwonden.
  8. Injecteer langzaam 100 ul cellen onder toepassing van een 1 ml spuit met een 27 G naald in het uiteinde van het blootgestelde milt. Injecteer langzaam gedurende een periode van ten minste 30 - 60 s, om extra levertumoren voorkomen.
  9. Plaats een microclip de milt voordat de naald aan het einde van de injectie om lekken van de geïnjecteerde celsuspensie voorkomen.
  10. Laat de microclip in de plaats voor 5 min.
  11. 5 min na de injectie, splenectomie voeren via een handbediende cauterisatie inrichting voor hemostase. Ontleden de milt hilum, vanaf de voorste kant. Bij het ontleden van grote schepen, pre-stollen de proximale zijde van de schepen met aangrenzende vetweefsel, met behulp van cauterisatie aan overmatig bloeden te voorkomen.
    LET OP: Methoden voor hemostase: stollen het bloeden punt rechtstreeks met cauterisatie, druk uit te oefenen om het bloeden voor 3-5 min of hechting-ligeren het bloeden punt met een 5-0 zijden stropdas. Sluit de flank insnijding van elke muis in twee lagen. Ten eerste, sluit de buikwand met een 5-0 absorbeerbare gevlochten hechtmateriaal (bijvoorbeeld Vicryl) in een enkele horizontale steek. Vervolgens sluit de huid met behulp van een niet-absorbeerbare 4-0 monofilament hechtdraad (bijv prolene), opnieuw met een enkele horizontale steek.
  12. Reinig alle instrumenten door het sproeien van 70% isopropanol om steriele omstandigheden tussen elke procedure te handhaven.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de dieren worden opgewarmd, terwijl ze ontwaken uit narcose. Monitor alle muizen postoperatief totdat ze ambulant worden en terug te keren naar de normale activiteit. Kenmerkend is de hersteltijd is ongeveer 3-5 minuten. Hebben dieren niet onbeheerd achter te laten totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld niet meer terug.

5. bioluminescentie beeldvorming

  1. Voer beeldvorming opwekelijks te meten en veranderingen in de bioluminescentie te kwantificeren in de tijd.
  2. Plaats muizen in een kamer anesthesie en verdoven ze met 2% isofluraan in zuurstof. Controleer of de muizen volledig onder verdoving door knijpen de staarten. Gebruik dierenarts zalf op de ogen te voorkomen droogheid terwijl onder verdoving.
  3. Vervolgens intraperitoneaal injecteren elke muis met 150 ul van de voorbereide vuurvlieg luciferine van stap 1,4.
  4. Plaats de muizen in een IVIS met individuele neus kegels toedienen van isofluraan. Plaats de muizen in rugligging met afstandhouders tussen het signaal aan aangrenzende muizen minimaliseren. Een maximum van vijf muizen kunnen worden afgebeeld in een keer.
  5. Meten en analyseren lichtgevende intensiteiten 3 minuten na luciferine injectie.
    1. Na het initialiseren van de IVIS zoals beschreven in stap 3.2.1, selecteer "Lichtende", "1 seconde" belichtingstijd, en "Medium" binning.
    2. Klik op de knop "Ophalen" naar Imagin beginneng. Zorg ervoor dat u elke beeldvorming uit te voeren op een consistente tijd (3 min) na de luciferine injectie.
    3. Nadat het beeld wordt verkregen, zal een beeld venster en het gereedschap palet verschijnen. Klik "ROI Tools" en kies "1", "2", "3", "4" of "5" van de cirkel icoon voor het aantal muizen afgebeeld.
    4. Om Regions of Interest (ROI) te definiëren, omcirkelen het signaal gebied van het luminescente signaal in de buikholte van de muis, en klik vervolgens op "metingen" van de ROI als een willekeurige eenheid van stralende efficiëntie ((fotonen / s / cm2 / steradiaal) / (uW / cm 2)). Zorg ervoor dat u een extra ROI cirkel van de achtergrond te hebben.
  6. Vier weken na de injectie en vóór dieroffer Voer Diffuse Luminescent Imaging Tomography (DLIT) via IVIS de tumorlast en verspreiden via real-time 3D reconstructie van lichtgevende intensiteiten van individuele tumor kolonies evalueren. Verdoven de muizen en injecteer luciferine, zoals beschreven in stap 5.2.4. DLIT wordt uitgevoerd op één muis tegelijk.
  7. Na het initialiseren van de IVIS, zoals beschreven in stap 3.2.1, selecteer "Imaging tovenaar", "Bioluminescentie", en klik op "Next". Selecteer "DLIT" en klik op "Next". Selecteer 'Firefly' sondes en klik op "Next". Selecteer "mouse" image onderwerp, "Auto" exposure parameter, "C-13 cm" gezichtsveld, en "0,5 cm" subject hoogte, en klik op "Next". Klik op de "Acquire" om beeldvorming te starten.
  8. Nadat het beeld wordt verkregen, selecteert u het tabblad "DLIT 3D reconstructie" en de "Analyseren" tab en klik op "Reconstruct" het imago van de 3D-reconstructie te genereren.
  9. Klik op "Tools" en "3D-animatie". Selecteer "Spin CCW op de Y-as" in de animatie venster 3D. Klik op "Record" en "Save" in een .mov formaat bestand.

6. Ex Vivo TL-Imaging

  1. Offer de muizen door cervicale dislocatie terwijl verdoofd of volgens de institutionele richtlijnen op 4-6 weken na de injecties milt.
  2. Oogst de lever. Maak een horizontale snede van links naar rechts flank. Grijpen de zwaardvormig proces met een pick-up, ontleden de falciform, de leverader en de vena cava inferior.
    1. Ontleden het recht hepatorenale ligament, de hepatoduodenale ligament, en de linker hepatorenale ligament, het verzorgen van de Spiegelse kwab niet te verwonden, terwijl het ontleden van de hepatoduodenale ligament. Na het oogsten van de lever, verwijder de galblaas, omdat dit autofluorescentie wordt weergegeven. Noteer eventuele aanvullende extra-levertumoren aanwezig.
  3. Nemen nota van de aantallen en de grootte van levertumoren aanwezig macroscopisch, en leg de geoogste levers in DPBS.
    OPMERKING: Tumoren zijn macroscopisch zichtbaar voor het blote oogals witte tumoren (een representatief voorbeeld zie figuur 4).
  4. Voorafgaand aan plaatsing op de beeldvorming vel, neem elke lever en verwijder voorzichtig overtollige vloeistof door te deppen op een papieren handdoek.
  5. Meet de fluorescentie-intensiteiten van elke tumor kolonie met behulp van de IVIS.
    1. Selecteer "Fluorescentie", "4 seconden" belichtingstijd, "Medium" binning, "2" F / stop, "535" excitatie filter, en "580" emissie filter. Klik op de "Acquire" om beeldvorming te starten.
    2. Na het verkrijgen van het beeld, zoek de afbeelding raam en gereedschap palet. Klik op "ROI Tools" en selecteer "1" van de cirkel icoon. Om ROI te definiëren, omcirkelen het signaal gebied van individuele tumor kolonies op de afbeelding en klik vervolgens op "metingen" van de ROI als een willekeurige eenheid van stralende efficiëntie ((fotonen / s / cm2 / steradiaal) / (uW / cm2) ). Zorg ervoor dat u een extra ROI cirkel van de achtergrond te hebben.
    3. Bereken de totale tumorvolume van de veronderstelling dat een bol. Tumor volume = 4 x π xr 03/03 (r = straal). Bereken de fractie van tumorcellen kolonievormende cellen (Fc) als het aantal tumoren in de lever gedeeld door het aantal cellen splenically geïnjecteerd.
    4. Bereken het totale aantal cellen per kolonie (= X) van de lineaire benadering van stap 3.3. Bereken het aantal celdelingen (= Y) als Y = log 2 x en de Td Td (dag) = 28 / Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het doel van dit experiment was om een consistente en reproduceerbaar diermodel met het potentieel voor de seriële kwantificering van de in vivo metastatische tumorlast en voor de bepaling van de kolonisatie frequentie en groeikinetiek ontwikkelen levermetastasen. Figuren 2-6, met legendes, zijn voorzien van onze vorige publicatie onder een Creative Commons CC-BY-licentie 10.

Generatie van Double-gelabelde Tumor Cell Monoclones

Eerst werd een panel van luminescente en fluorescent gelabelde monoklonale cellijnen werd geproduceerd met verschillende metastatisch vermogen. Na succesvolle transfectie van lichtgevende (Luc2) en TL (tdTomato) eiwitten in het ouderlijk HCT116 colorectale kanker cellen, werden 16 dubbel-gelabeld monoclones gegenereerd door verdunning van de ouderlijke HCT116-L2T cellen 1 cel / 200 uL in 96 putjes (figuur 1) 10. In vitro fluorescentie en luminescentie van HCT116-L2T werd vervolgens gekwantificeerd onder toepassing van een toenemende hoeveelheid cellen om het aantal tumorcellen schatten van in vivo en ex levertumor vivo beeldvorming (figuur 2) 10.

Uitzaaiingen Development door Klonen met Differential Liver Colonization

Vervolgens om levermetastasen te genereren, de 16 eerder gegenereerde individuele HCT 116-L2T klonen werden intrasplenically geïnjecteerd in muizen; een splenectomie werd vervolgens uitgevoerd. De ontwikkeling van levermetastasen werd gevolgd door wekelijkse bioluminescentie beeldvorming, gevolgd door ex vivo fluorescerende beeldvorming na het opofferen van de muizen. Van de 16 monoclones gegenereerd, selecteerden we aangeduid als P1, P2, O1 en O2, klonen door hun different waargenomen kolonisatie en groei mogelijkheden in de lever. Klonen O1 en O2 hadden een kleinere tumor last, wat neerkomt op "oligometastatic" klonen, en mogelijk indient een fenotype van beperkte gemetastaseerde ziekte. Klonen P1 en P2 heeft een grotere tumorlast, die brede verspreiding, die ook wordt aangeduid als polymetastatic ziekte. De bioluminescentie was hoger in de P1 en P2 muizen (6,7 x 10 6 ± 4,7 x 10 6 en 3,6 x 10 6 ± 2,5 x 10 6 fotonen / s / cm 2 / steradiaal) vergeleken met de O1 en O2 muizen (2,0 × 10 5 ± 1,3 x 10 5 en 1,7 x 10 5 ± 9,1 x 10 4 fotonen / s / cm 2 / steradiaal) 3 weken na de injectie milt (figuur 3A, B) 10. De kwantificering van ex vivo fluorescentie van de levers van 4 weken na de injectie milt aangetoond dat P1 en P2 levers hadden hogere FLUOREScent intensiteiten vergeleken met O1 en O2 lever (Figuur 3C). De tumor verdelingen in de ex vivo fluorescerende beelden waren consistent met macroscopische bevindingen (Figuur 3C, D) 10.

Kolonisatie en groei kinetiek van individuele klonen

De aantallen en de grootte van tumoren gevisualiseerd macroscopisch geteld en gemeten in elke afzonderlijke lever. Bovendien werd ex vivo fluorescentie beeldvorming uitgevoerd op iedere afzonderlijke tumor kolonie per monoclone (figuur 4) 10. Het totale aantal tumoren in P1 was hoger in vergelijking met P2, O1 en O2, terwijl de grootte van tumoren groter dan P2 P1, O1 en O2 (p <0,001; Figuur 5A, B) 10. Het totale volume tumor in de lever in P1 en P2 was groter in vergelijking met O1 en O2 (figuur 5C) 10-5 ± 1,1 x 10-5, 6,0 x 10-6 ± 2,3 x 10-6 in P1 en O1 respectievelijk p <0,001; Figuur 5D) 10. Hoewel P2 eenzelfde vermogen om de lever klonen O1 en O2 koloniseren had de grootte van de tumoren gegenereerde was groter dan de andere klonen. Het totale aantal cellen per tumor kolonie, de Td en het aantal celdelingen kan worden berekend uit deze gegevens met de kalibratie reeds generated van de correlatie tussen de fluorescentie-intensiteit en het aantal cellen (figuren 2 en 5E - G) 10. P1, die vele kleine tumoren in de lever gegenereerd, zoals gezien door macroscopisch visueel onderzoek, hadden een grotere Fc, hoewel het een Td vergelijkbaar O1 en O2 (p <0,05) was. P2, die een beperkt aantal macroscopische grote tumoren opgewekt had soortgelijke Fc maar een kortere Td opzichte O1 en O2 (p <0,05). Samengenomen geven deze resultaten aan dat de Fc en Td twee sleutelparameters die bijdragen tot metastatisch potentieel.

De 3D verdeling van metastatische tumoren in de lever werd aangetoond door DLIT (figuur 6) 10. Met deze beeldvormende techniek is het mogelijk om ruimtelijk-temporele dynamisch gedrag van de metastasen door de detectie en meting van de bioluminescentie van individuele hepatische metastatische kolonies controleren.

De gegevens gegenereerd werd geanalyseerd met behulp van standaard software voor gegevensanalyse en foutbalken aangetoond als het gemiddelde ± standaardafwijking. Pearson's correlatie coëfficiënten werden gebruikt om verbanden tussen parameters te evalueren. P-waarden werden bepaald onder toepassing van t-toetsen 2 eenzijdige Student's, met een p <0,05 als statistisch significant.

Figuur 1
Figuur 1:. Ontwikkeling van een panel van Monoclones van gelabelde HCT116 cellen (A) Kweek ouderlijke HCT116 cellen gelabeld met luciferase en tdTomato. (B) Verdun ouderlijke HCT 116 cellen tot 1 cel / 200 pi. (C) Plaat 200 pi van de oplossing in een 96 wells plaat. (D) Grow monoclones uit elk putje in de plaat met 96 putjes. (E) Spuit monoclones intrasplenically in muizen aan leveruitzaaiingen te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: De verlichte beeld van verschillende aantallen cellen verdrievoudigd in een plaat met 96 Schatting van het aantal cellen door Fluorescentie intensiteiten (A).. (B) De relatie tussen het aantal cellen en de luminescentie (R = 0,99, p <0,0001). De schaal balk geeft luminescentie-intensiteit (fotonen / s / cm2 / steradiaal). (C) De fluorescerende beeld van verschillende aantallen cellen verdrievoudigd in een plaat met 96. intensiteiten weopnieuw verworven als stralend efficiëntie met een 535 nm excitatie en 580 nm emissie. (D) De relatie tussen het aantal cellen en de fluorescentie (R = 0,99, p <0,0001). De schaalbalk geeft de fluorescentie-intensiteit in een willekeurige eenheid stralende efficiëntie ((fotonen / s / cm 2 / steradiaal) / (uW / cm 2)). Overgenomen met toestemming 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: bioluminescentie en E x Vivo Fluorescentie van de lever in geselecteerde klonen (A) Vertegenwoordiger lichtgevende beelden.. De schaal bar vertegenwoordigt lichtgevende intensity (fotonen / s / cm 2 / steradiaal). (B) bioluminescentie wekelijks gemeten 1-3 weken in P1 en P2, en 1-4 weken in O1 en O2. De gegevens werden weergegeven als het gemiddelde ± standaardafwijking. (C) Vertegenwoordiger ex vivo fluorescerende beelden van levers. Intensiteiten werden verworven als stralend efficiëntie met een 535 nm excitatie en 580 nm emissie. De schaalbalk staat voor fluorescentie-intensiteit op willekeurige eenheid stralende efficiëntie ((fotonen / s / cm 2 / steradiaal) / (uW / cm 2)). (D) Macroscopische lever beelden (pijlen geven kleine witte tumoren). P1 en P2: polymetastatic klonen, O1 en O2: oligometastatic klonen. Overgenomen met toestemming 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.


Figuur 4:. Kwantificering van TL-intensiteiten van de individuele lever Kolonies Beelden aan de linkerzijde zijn representatief macroscopische bevindingen en afbeeldingen aan de rechterkant zijn fluorescerende intensiteiten in elke kloon. De fluorescerende intensiteiten werden verworven als stralend efficiëntie met een 535 nm excitatie en 580 nm emissie. P1 en P2: polymetastatic klonen, O1 en O2: oligometastatic klonen. Overgenomen met toestemming 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5:. Kwantitatieve schatting koloniseren vermogen en groei Kinetics ( (B) macroscopische grootte van individuele tumoren, (C) berekende totale tumor in de lever, (D) koloniserende fractie tumor kolonievormende cellen (Fc), (E) totaal celaantal per kolonie, (F) verdubbelingstijd (Td), en (G) aantal celdelingen van elke kloon. P1 en P2: polymetastatic klonen, O1 en O2: oligometastatic klonen. De gegevens werden weergegeven als het gemiddelde ± standaardafwijking voor figuur panelen waarin foutbalken werden getoond. Overgenomen met toestemming 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Quantificatiop bioluminescentie van de individuele Tumor Colonies behulp Diffuse Lichtende Imaging Tomography (DLIT). (A) 3D-bovenaanzicht. De schaal balk geeft fluorescentie-intensiteit in een willekeurige eenheid van stralende efficiëntie. (B) coronale sectie. (C) Sagittal sectie. (D) transaxiaal sectie. (E) Macroscopisch beeld van de lever. (F) Ex vivo fluorescerende beeld van de lever. Overgenomen met toestemming 10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het dier model voorgesteld in het huidige rapport is gebaseerd op twee belangrijke benaderingen. Ten eerste, om het vermogen om metastatische klonen met verschillende neigingen waarnemen te koloniseren en prolifereren in de lever te waarborgen, een panel van zeer heterogene monoklonale cellijnen werd vastgesteld ipv een vastgestelde ongefractioneerde kankercellijn 12,13. De monoklonale benadering van metastase ontwikkeling wordt gerechtvaardigd door de recente genomische data 14 en werd met succes eerder gebruikt om het metastatische proces 10,15,16 modelleren. Ten tweede, double-labeling van de ouderlijke cellijn door luciferase en tdTomato markers werd opgenomen met het oog op verbeterde analyse van metastatische groei, zowel in vivo en ex vivo. De luminescerende en fluorescerende labeling maakt een gedetailleerd anatomisch onderzoek en potentiële kwantificering van zowel de hoeveelheid metastatische tumoren (beschouwd als de frequentie of werkzaamheid van lever colonization) en de grootte van elke afzonderlijke kolonie. Deze kan eenvoudig worden omgezet naar een effectief aantal cellen met een eenvoudige ijkprocedure in stap 2 beschreven en figuren 2 10 en 4 10. Met deze gegevens is het mogelijk de Td schatten elke metastatische knooppunt in de lever en de groeikinetiek van levermetastasen van elke eerste monoclone geïnjecteerd (Figuur 5) 10 evalueren.

Drie verschillende metastatische colorectale fenotypes waargenomen in dit experimentele systeem, aangeduid als P1, P2 en O1 / O2. Deze uitgezaaide fenotypes verschilden bij het vergelijken van de gegevens van de frequentie van de kolonisatie en lokale groeicijfers voor elke metastatische kloon. De eerste metastatische fenotype, P1, toonde een verhoogd vermogen om de lever maar een relatief lage lokale groeisnelheid koloniseren, overeenkomend met vele kleine metastatische tumoren gehele lever. De tweede metastatische fenotype, P2, hadeen lagere frequentie van kolonisatie, maar een significant hogere lokale groei, wat resulteert in een betrekkelijk klein aantal grote uitzaaiingen. Ten slotte is de derde metastatische fenotype, O1 en O2, toonde zowel een lage frequentie van kolonisatie en trage lokale groeicijfers. Deze derde metastatische fenotype kan worden beschouwd als een representatie van klinische oligometastatic leverziekte (figuren 3 en 10 5 10). Bovendien genexpressie analyse waarbij deze klonen 10 geïdentificeerd significante verschillen in expressiepatronen. Bijvoorbeeld, bij het vergelijken met P1 O1 en O2 klonen waren er 756 differentieel tot expressie gebrachte genen, bestaande uit een reeks genen die betrokken zijn bij inflammatoire reacties en interferon signalering. Deze studie, evenals anderen, zijn deze genen die spelen belangrijke rollen in tumorgroei en overleving 21, 22. Bovendien, bij het vergelijken P2 O1 en O2, waren er 461 differentieel expressed genen, met een deel met genen essentieel voor celgroei en proliferatie gemedieerd door ERK1 / 2 signalering.

De diversiteit van metastatische fenotypen geproduceerd door deze experimentele model is consistent met de waargenomen klinische representaties van metastatische heterogeniteit. Zo is aangetoond dat de grootte van levermetastasen (een parameter gerelateerd aan groeipotentieel) en hun nummers (een parameter gerelateerd aan kolonisatievermogen) onafhankelijke risicofactoren voor metastasen 1. Met verbeterde groeipotentieel of kolonisatievermogen, de eigenschappen waargenomen in P1 en P2 komen overeen met deze gegevens. Bovendien, recente waarnemingen van de patiënten behandeld met stereotactische radiotherapie (SBRT) of chirurgisch weggesneden longmetastasen wijzen zowel het aantal tumoren en de progressie als belangrijke factoren algehele en ziektevrije uitkomsten 17,18. Aldus kolonisatie en groei en lijken deeen van de meest kritische factoren voor de ontwikkeling van metastatische klonen op afgelegen plaatsen 19,20. Experimentele modellen, die zijn gebaseerd op deze eigenschappen van metastatische klonen kan bruikbare hulpmiddelen voor het begrijpen van de mechanismen van metastase ontwikkeling, alsook een middel voor het testen van nieuwe behandelingsmogelijkheden voor de behandeling van lever metastasen.

Terwijl een orthotope model kan produceren spontane metastasen ideaal, blijft er een gebrek aan gemakkelijk reproduceerbaar en consistent spontane modellen. Terwijl de modellen gebruik te maken van intracecal implantatie of injecties zijn beschreven, ze toonden variabele tarieven van de opname en metastase vorming van 23-26. Andere methoden hebben een buitenbaarmoederlijke implantatie aanpak van de milt of intraportale injectie gebruikt om levermetastasen te genereren. Hoewel de algemene techniek van injectie is hetzelfde, de hier gepresenteerde model verschaft een gevoelige benadering understanding de mechanismen van metastase ontwikkeling vanaf het stadium van circulerende tumorcellen (CTC). Gevoeligheid en reproduceerbaarheid van onze aanpak wordt bepaald door een dubbele labeling van cellijnen om zowel bioluminescente en fluorescerende beeldvorming om de dynamiek van het metastatische proces te volgen. Door de mogelijkheid om de metastatische belasting van de luminescerende en fluorescerende gegevens te kwantificeren, is het mogelijk systematisch meten en volgen de groeikinetiek metastasen tijd. Hoewel alternatieve benaderingen, zoals ultrageluid gebaseerde beeldvorming, zijn gebruikt, deze modaliteiten zijn veel gebruikersafhankelijke, met mogelijk grote inter-user variabiliteit 27. Bovendien, door het genereren van een panel van monoklonale cellijnen kunnen wij reproduceerbaar en afzonderlijke uitgezaaide fenotypen verschaffen om beter model de variabiliteit van metastatische ziekte waargenomen in de klinische setting.

Hoewel het beheersen van deze experimentele techniek,bijzonder de milt injectie voor de in vivo muismodel (zie stap 4), zijn er enkele kritische stappen die wijziging nodig. We merken uitvoeren van de milt injectie is het belangrijkste deel van het model, als een ontoereikende injectie van de milt kan leiden tot slechte resultaten. Lekkage van cellen tijdens de injectie of lekkage veroorzaakt door de onjuiste plaatsing van de microclip, kan leiden tot een vermindering van levermetastasen en / of een aanzienlijke hoeveelheid extra levertumoren of peritoneale carcinomatoses. Daarnaast is het belangrijk om de tumorcellen langzaam injecteren, ten minste zolang beschreven in het protocol, teneinde een toename van de milt druk, wat kan leiden tot extravasatie van de cellen naar aangrenzende weefsels en de groei van voorkomen extra-levertumoren rond de stomp van de milt dissectie.

Tenslotte in stap 4,3, is er een celbereik gegeven de milt injectie (1,2-2 x 10 6 </ Sup> cellen). Het doel van deze serie is rekening te houden met individuele gebruikers deze techniek. Het kan enige tijd duren om een ​​optimale aantal cellen te injecteren kalibreren. Als er te weinig cellen worden geïnjecteerd, kan levermetastasen niet consequent ontwikkelen, en als er te veel cellen worden geïnjecteerd, kunnen portale veneuze occlusie optreden, waardoor de vroege dood van het dier. Kan het verstandig om eerst om verschillende concentraties van tumorcellen bij het starten van het model om het optimale aantal te vinden.

Een valkuil van het gepresenteerde model is dat het is gebaseerd op een xenograft benadering en exploiteert immunodeficiënte naakt muizen. Eén voorgestelde alternatieve methode is het genereren van eenzelfde groep monoklonale derivaten van het muizen colorectale cellijn MC38, dubbel gemerkt met luciferase en tdTomato of EGFP eiwitten. Deze klonen kunnen vervolgens worden gebruikt in syngene diermodellen om de interacties ontwikkelen levermetastasen vangen met de gastheer IMMUne systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

We willen graag bedanken Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) voor de Luc2-tdTomato plasmide en de HCT116 cellijn, Mr. Ani Solanki (Animal Resource Center) voor de muizen management, en Dr. Lara Leoni voor de hulp de DLIT. Kwantificering van fluorescente en lichtgevende intensiteiten werden uitgevoerd in de Integrated Small Animal Imaging Research Resource aan de Universiteit van Chicago op een IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Dit werk werd ondersteund door de Virginia en DK Ludwig Fonds voor Kankeronderzoek, de Lung Cancer Research Foundation (LCRF), de Prostate Cancer Foundation (PCF), en het Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA014599). De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, gegevensverzameling en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230, (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241, (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263, (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46, (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62, (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96, (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210, (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122, (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5, (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8, (2), e55714 (2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197, (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4, (6), e5821 (2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28, (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7, (12), e50141 (2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6, (12), e28650 (2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22, (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24, (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18, (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5, (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170, (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
Geavanceerde diermodel van colorectale metastase in de lever: Imaging technieken en eigenschappen van gemetastaseerde Clones
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter