Abstract
Patienten mit einer begrenzten Anzahl von Lebermetastasen und langsam Progressionsraten können erfolgreich mit lokalen Behandlungsansätze 1,2 behandelt werden. Es ist jedoch wenig über die Heterogenität der Lebermetastasen bekannt und Tiermodellen der Lage, die Entwicklung individueller metastatischen Kolonien Auswertung benötigt. Hier präsentieren wir eine erweiterte Modell von Lebermetastasen, die die Fähigkeit bietet, um quantitativ die Entwicklung individueller Tumor Klone in der Leber zu visualisieren und deren Wachstumskinetik und Kolonisierung Effizienz abzuschätzen. Wir erzeugten eine Reihe von monoklonalen Derivate von HCT116 menschlichen Zellen Darmkrebs stabil markiert mit Luciferase und tdTomato und unterschiedliche Wachstumseigenschaften besitzen. Mit einer splenic Injektion durch eine Splenektomie gefolgt sind die meisten dieser Klone können Lebermetastasen zu erzeugen, aber mit unterschiedlichen Frequenzen der Kolonisierung und unterschiedlichen Wachstumsraten. Unter Verwendung der In Vivo Imaging System (IVIS) ist es möglich , die Entwicklung mit Metastasierung in vivo lumineszente und ex vivo Fluoreszenzabbildung sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Zusätzlich stellt Diffuse Leucht Imaging Tomography (DLIT) eine 3D - Verteilung von Lebermetastasen in vivo. Ex - vivo - Fluoreszenz - Bildgebung des geernteten Lebern quantitative Messungen einzelner hepatischen metastatischen Kolonien liefert, so dass für die Auswertung der Häufigkeit der Leber Kolonisierung und die Wachstumskinetik von Metastasen. Da das Modell zu klinisch beobachtet Lebermetastasen ähnlich ist, kann es als eine Modalität dienen Genen assoziiert mit Lebermetastasierung und zur Prüfung Potential ablative oder adjuvanten Behandlung von Leber-Metastasen nachzuweisen.
Introduction
Patienten mit Lebermetastasen von primären Darmkrebs (CRC) durch eine schlechte Prognose gekennzeichnet. Die 5-Jahres - Überlebensrate für die primäre nonmetastatic CRC (Phasen I - III) - 88% 3,4, während Patienten mit Lebermetastasen (Stadium IV) haben eine 5-Jahres - Überlebensrate von nur 8 - als 75 auf 12% geschätzt 5 , 6. Patienten mit metastasiertem stellen jedoch eine heterogene Gruppe, mit einer unterschiedlichen Anzahl von Metastasen und verschiedenen Wiederholungszeiten präsentiert. Klinische Beobachtungen zeigen , dass die Anzahl der Metastasen (die Fähigkeit zur Besiedelung oder Häufigkeit der Kolonisierung proportional sein kann) und die Größe einer einzelnen Metastasierung (proportional zum lokalen Wachstumsrate) sind unabhängige prognostische Faktoren 1,7. Mit anderen Worten hängt der Erfolg von metastasierendem Klone die Leber Kolonisierung auf zwei Haupteigenschaften: ihre Fähigkeit, in der Leber-Mikroumgebung zu wachsen und ihre Fähigkeit, zu verbreiten und zu überleben.
Das Designvon erfolgreichen klinischen Modelle mit der Fähigkeit zur Erfassung und die Eigenschaften von metastasierendem Klone Quantifizierung drastisch unser Verständnis von Lebermetastasen Biologie und bieten ein effektives Werkzeug für die Gestaltung von potentiellen therapeutischen Ansätze zu verbessern. Modellen experimenteller Lebermetastasen wurden 8,9 bereits berichtet, aber keiner von ihnen die Fähigkeit bereitgestellt Eigenschaften einzelner Klone metastatic quantitativ zu erfassen und zu beschreiben , sowohl in vivo als auch ex vivo.
Hier präsentieren wir eine neue, erweiterte Modell von Lebermetastasen, die die Erzeugung von Tumor-Klone mit verschiedenen Leber Kolonisation Effizienzen und Wachstumseigenschaften umfasst. Wir verwendeten eine Kombination von Doppel-Markierung von Krebszellen mit Luciferase und tdTomato fluoreszierendes Protein mit der Erzeugung von monoklonalen Zelllinien, die intrinsische Unterschiede in metastatischen Kapazität. In diesem experimentellen Modell zeigen die Daten, dass die Entwicklung vonLebermetastasen kann in Bezug auf die Frequenz und Kolonisierung Verdopplungszeit (Td) beschrieben, die mit klinischen Beobachtungen konsistent ist. Die quantitative Natur dieses Modells macht es für die Wirkstoffforschung und diagnostische Zwecke leicht einnehmbaren.
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Protocol
Alle Tierverfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Chicago (Protokoll # 72213-09) und durchgeführt unter sterilen Bedingungen genehmigt.
1. Vorbereitungen
- Machen 500 ml Medium für die Kultur von Tumorzellen HCT116: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin.
- Autoklaven die Instrumente für die Milz Injektion Modell verwendet werden, einschließlich der 3-4 chirurgische Handtücher, Gaze, zwei kleine Adson Pickups, eine Nadel-Treiber, zwei Paare von Schere, eine kleine Klammer und 3 microclips, bei 251 ° C für 20 min .
- Vorbereitung postoperativen Anästhesie für die Mäuse subkutan nach der Milz Injektion verabreicht werden. Verdünnte 2 bis 4 & mgr; g von Buprenorphin in 500 & mgr; l von 0,9 normaler Kochsalzlösung pro Maus.
- Bereiten Sie Teilmengen von 150 ug / 150 ul von Glühwürmchen-Luciferin für die intraperitoneale Injektionen during die Biolumineszenz-Assays. Lagerung bei -20 ° C und vor Licht schützen.
2. Erzeugung von Luciferase / tdTomato-markierten monoklonalen Zellinien 10,11
- Auftau und HCT116 menschlichen Darmkrebszellen und 293FT humanen embryonalen Nierenzellen in DMEM mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin aufrechtzuerhalten. Pflegen in Kultur bei 5% CO 2 und 37 ° C.
- Produzieren einen hohen Titer Lentiviren.
- Auf D 1, Platte 10 bis 12 x 10 6 293FT Zellen zwischen dem Kanal 3 und 10 in 15 cm Zellkulturschalen in 18 ml komplettem DMEM (cDMEM) mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% nicht - essentielle Aminosäuren . Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Auf D 2, die Zellen unter Verwendung der folgenden Transfektion Lösung transfizieren:
- Für jedes Gericht, verwenden Sie die folgende: eine DNA-Mischung von 37,5 ug pFUG lentiviralen Vektor mit der Luciferase eingesetzt (Luc2) und tdTomatoKonstrukte 11 (an der University of Chicago , ein Geschenk von Dr. Geoffrey Greene), 25 ug pCMVΔ8.74 und 12,5 ug pMD2.G in insgesamt 1062 ul sterilem H 2 O resuspendiert Hinzufügen 188 & mgr; l 2 M CaCl 2.
- Hinzufügen 1.250 & mgr; l 2x Hepes-gepufferter Saline (HBS, der 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4 und 180 mM NaCl, pH 7,12) an die DNA / CaCl & sub2 ; -Lösung, ein Tropfen zu einer Zeit, während Blasen Blasen durch die Lösung mit einer Pipette.
- bei RT inkubieren 20 min und dann 15.5 ml RT cDMEM hinzufügen und Chloroquin in einer Endkonzentration von 25 uM zu machen.
- Absaugen Medien in jeder Schale von 293FT Zellen und mit der Transfektion Lösung ersetzen. In 16 ml der Transfektion Lösung langsam, da die plattierten Zellen leicht entfernen.
- Am D 3 nach 8 bis 16 h, die Transfektionslösung entfernen und die Zellen einmal mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) waschen, nochmals Taking kümmern sich nicht um die Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie die Medien mit 18 ml frischem cDMEM mit 10 mM Hepes.
HINWEIS: Langsam Gerichte bewegen, die Transfektion Lösung absaugen und die Medien durch die Seitenwand der Platten hinzufügen, um nicht die Zellen zu entfernen. - Auf D 4 bei 48 h von dem Zeitpunkt der Transfektion, sammeln das Medium aus den Schalen von langsam mit einer Pipette angesaugt, um nicht um die Zellen zu entfernen. Zentrifuge die gesammelten Medien bei 300 xg für 5 min die große Zelltrümmer zu präzipitieren.
- Filtriere den viralen Überstand ein 0,45 um Niederproteinbindungs Saugflasche und Zentrifuge unter Verwendung eines SW-28-Rotor für 2 h bei 50.000 xg und 4 ° C verwendet wird. Den Überstand umfüllen unmittelbar nach der Zentrifugation beendet und trocknen Sie die Innenseite des Rohres mit Wischern.
- Resuspendieren der viralen Pellet in 50 & mgr; l Reduzierte Serum Medium (RSM) mit 1% FBS. Aliquots können für die zukünftige Verwendung (Virusstamm) bei -80 ° C gelagert werden.
- Transduzieren die Lentivirenes in den HCT116 Zellen und eine Gruppe von tdTomato-positive Klone erzeugen.
- Platte die HCT116 - Zellen in einer Dichte von 1 x 10 5 in 24 - Well - Platten 1 d vor der Virusinfektion.
- Verdünne 40 & mgr; l der resuspendierten Virus (aus 2.2.7) in 4 ml RSM (1: 100 Verdünnung) mit 1% Penicillin / Streptomycin und 8 ug / ml Polybren (CRSM).
- Am Tag der Infektion, waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, und dann wurden 250 & mgr; l des verdünnten Virus von Schritt hinzufügen 2.3.2 zu jeder Vertiefung. Inkubieren für 4 h bei 37 ° C und 5% CO 2 und dann 1 mL cDMEM in jede Vertiefung; 72 h - bei 37 ° C und 5% CO 2 für 48 inkubieren.
- Resuspendieren der Zellen mit 1 ml 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA, und füge dann 1 ml cDMEM um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet bei 300 g für 4 min. Waschen Sie das Pellet 3x in 1 ml Balanced Salt Solution (HBSS) plus 2% FBS "Hanks.
- Das Pellet aus Schritt 2.3.4mit FACS Puffer (2% FBCs und 2 mM EDTA in PBS) in eine Einzelzellsuspension mit 1 x 10 6 Zellen / mL.
- Sortieren Sie die tdTomato-positive HCT116 Zellen einen Zellsortierer verwenden, Gating für PE-positive Zellen (Anregung / Emission: 556/585 nm). Wachsen die gesammelten Zellen in einer 10-cm - Schale in 5% CO 2 und 37 ° C parentalen tdTomato-positive HCT116 - Zellen (1A) zu erzeugen.
- Resuspendieren der elterlichen tdTomato-positive HCT116 Zellen aus 2.3.6 mit 8 ml 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA 3 - 5 min, und dann 8 ml cDMEM fügen Sie das Trypsin zu neutralisieren.
- Übertragung der Zellen auf eine 50 ml-Röhrchen und Pellets bei 300 × g für 4 min. Entfernen Sie den Überstand und verdünnen die elterliche tdTomato-positive HCT116 Zellen auf 1 Zelle pro 200 ul in cDMEM (1B).
- Platte , die eine einzelne Zelle (200 & mgr; l der Verdünnung) pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen bei 5% CO 2 und 37 ° C (Abbildung 1C).
- Wachsen einzelnen Monoklone in Flaschen mit 5% CO 2 und 37 ° C. (1D).
3. Kalibrierung von Fluoreszenzsignalintensität als Funktion der Anzahl von Zellen
- Platte die HCT116 - Zellen transfiziert, jetzt bezeichnet als HCT116-L2T, bei einer Dichte von 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4 und 10 5 Zellen / Well in 96 - Well - Platten in dreifacher Ausführung für jede Dichte.
- Nach 5 h Inkubation quantifizieren die tdTomato Fluoreszenzintensitäten IVIS unter Verwendung von 10.
- Klicken Sie auf das Bild Software-Symbol auf dem Desktop, um die Software zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Initialisieren" das Abbildungssystem zu initialisieren. Nach der Initialisierung beendet (die über wenige Minuten dauert), wählen Sie "Fluoreszenz", "4 Sekunden" Belichtungszeit "Medium" Binning "2" F / Stop, "535" Anregungsfilter,und "580" Emissionsfilter.
- Legen Sie die 96-Well-Platte auf der Abbildungsstation und klicken Sie auf "Acquire" Imaging zu starten. Nachdem das Bild aufgenommen wird, klicken Sie auf "ROI-Tools" in der Werkzeugpalette und 12 x 8 aus dem Schlitz Symbol.
- Erstellen Sie 12 x 8 Schlitze den Bereich des Signals auf das Bild der 96-Well-Platte und klicken Sie auf die Registerkarte Messungen zu decken. Beachten Sie ein Fenster mit einer Tabelle von ROI - Messungen mit Einheiten der Photonen pro s pro Steradiant pro Quadratzentimeter (Photonen / s / sr / cm 2).
- Konstrukt ein Streudiagramm mit dem Argument (X-Achse) gleich der Anzahl der Zellen und die Funktion (Y-Achse), die Signalintensität. Berechnen Regressionskurven eine Datenanalyse - Software unter Verwendung der Menge von Zellen zu berechnen , auf die Einheit der Fluoreszenzintensität entspricht (Abbildung 2) 10.
4. Tiermodell von Lebermetastasen
- Sobald die HCT116-L2T Zellen erreichen 70- 80% Konfluenz, bereiten sie ca. 1 h vor der Milz Injektion. Dissoziieren die Zellen 0,05% Trypsin in 0,53 mM EDTA unter Verwendung von 3 bis 5 min und dann neutralisiert sie mit einer gleichen Menge von cDMEM. Achten Sie darauf, gründlich zu pipettieren Verklumpungen zu vermeiden.
- Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler.
- Resuspendieren der Zellen in 1x DPBS auf eine Konzentration von 1,2 bis 2 x 10 6 Zellen / 100 & mgr; l. Achten Sie darauf, um die Zellen zu pipettieren und resuspendieren gründlich Verklumpungen zu vermeiden.
- Halten Sie die Zellen auf Eis bis zur Injektion, gelegentlich sie in der Röhre Resuspendieren.
- Bevor die Mäuse betäubt, liefern eine präoperativen anästhetische und Flüssigkeits Bolus durch subkutane Injektion von 500 & mgr; l des Buprenorphin Mischung in Schritt 1.3 beschrieben. Verabreichen Sie die gleiche Dosis von zusätzlichen Buprenorphin Mischung zweimal täglich, bis Anzeichen von Schmerzen (eingeschränkter Mobilität, gebeugte Gestalt, das Versagen der Bräutigam, Stimmgebung bei der Handhabung) gelöst haben.
- Anästhesieren 6- bis 8-Wochen--old weibliche athymische Nacktmäuse mit 2% Isofluran in Sauerstoff in einer Anästhesie Kammer. Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Einklemmen des Schwanzes vollständig unter Narkose sind. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Übertragen Sie jede narkotisierten Maus auf einen einzelnen Bugnase für die Milz Injektion. Vor dem Einschnitt sollte jede Maus mit einem sterilen Operationstuch bedeckt sein.
- Identifizieren Sie die Milz als einen violetten Bereich von außen durch die Haut auf der linken Flanke der Nacktmäuse gesehen. Mit microdissection Schere, machen eine 8 mm linke Flanke Einschnitt auf der Haut gerade über der Milz.
- Dann heben Sie auf der Bauchdecke und einen kleinen Schnitt machen. Damit Luft in die Bauchhöhle, so daß die inneren Organe von der Inzisionsstelle bewegen. Vergrößern Sie die Bauchdecke Schnitt auf etwa 5 mm.
- Setzen Sie die Milz vorsichtig mit einem Wattestäbchen Druck um den Einschnitt Anwendung. Bei Bedarf kann das Pankreas Fett Mann sanftipulated mit der Exposition zu helfen, um nicht die Milz zu verletzen.
- injizieren langsam 100 & mgr; l Zellen mit einer 1 ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel in die Spitze des freiliegenden Milz verwendet. Injizieren Sie langsam, über einen Zeitraum von mindestens 30 - 60 s, extraLeberTumoren zu vermeiden.
- Legen Sie eine Mikroclip auf der Milz vor der Nadel am Ende der Injektion Entfernen Leckage des injizierten Zellsuspension zu verhindern.
- Lassen Sie den Mikroclip an Ort und Stelle für 5 min.
- 5 min Nacheinspritzung, führen Sie eine Splenektomie eine Hand Kauterisierungsvorrichtung zur Hämostase verwendet wird. Präparieren Sie die Milzhilus, von der vorderen Seite zu starten. Wenn große Gefäße Sezieren, pre-Koagulieren der proximalen Seite der Gefäße mit angrenzenden Fettgewebe, cautery Verwendung starke Blutungen zu vermeiden.
HINWEIS: Methoden zur Hämostase: gerinnen die blutende Stelle direkt mit Kauter, für 3 Druck auf die blutende Stelle bewerben - 5 min oder Naht-abzubinden die blutende Stelle mit einem 5-0 Seidenkrawatte. Schließen Sie den Flankenschnitt jeder Maus in zwei Schichten. Zuerst schließen Sie die Bauchdecke mit einem 5-0 resorbierbaren geflochtenen Naht (zB Vicryl) in einer einzigen horizontalen Stich. Als nächstes schließen Sie die Haut ein 4-0 nicht resorbierbaren Monofilamentnahtmaterial (zB Prolene), wiederum mit einer einzigen horizontalen Stich. - Reinigen Sie alle Instrumente, die von 70% Isopropanol Sprühen sterilen Bedingungen zwischen jedem Verfahren zu halten.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tiere erwärmt werden, während sie aus der Narkose erwachen. Überwachen Sie alle Mäuse postoperativ, bis sie die ambulante werden und wieder in den normalen Aktivität. Typischerweise ist die Wiederherstellungszeit ca. 3 - 5 min. Lassen Sie keine Tiere unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt hat.
5. In vivo - Biolumineszenz - Bildgebung
- Führen Sie Abbildung aufwöchentlich wechselnde in Biolumineszenz im Laufe der Zeit zu messen und zu quantifizieren.
- Platzieren Mäuse in einer Anästhesiekammer und anästhesieren sie mit 2% Isofluran in Sauerstoff. Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Kneifen die Schwänze vollständig unter Narkose sind. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Als nächstes intraperitoneal jeder Maus mit 150 ul der vorgefertigtes injizieren Glühwürmchen-Luciferin aus Schritt 1.4.
- Legen Sie die Mäuse in einem IVIS mit einzelnen Bugspitze Isofluran verabreicht wird. Legen Sie die Mäuse in der Rückenlage mit Abstandshalter zwischen das Signal an benachbarten Mäuse zu minimieren. Maximal fünf Mäuse können auf einmal abgebildet werden.
- Messen und Biolumineszenz-Intensitäten 3 min nach dem Luciferin Injektion zu analysieren.
- Nach dem IVIS initialisiert, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben, wählen Sie "Leuchtende", "1 Sekunde" Belichtungszeit, und "Medium" Binning.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" imagin zu startenG. Stellen Sie sicher, jeder Abbildungs bei einer konsistenten Zeit (3 min) nach dem Luciferin Einspritzung durchzuführen.
- Nachdem das Bild aufgenommen wird, wird ein Bildfenster und Werkzeugpalette angezeigt werden. Klicken Sie auf "ROI-Tools" und wählen Sie "1", "2", "3", "4" oder "5" aus dem Kreis-Symbol, entsprechend der Anzahl der Mäuse abgebildet.
- Um Regions of Interest (ROIs), umrunden den Signalbereich des Leuchtsignals in der Bauchhöhle der Maus zu definieren, und klicken Sie dann auf "Messungen" der ROI als eine beliebige Einheit der Strahlungswirkungsgrad ((Photonen / s / cm 2 / Steradiant) / (& mgr; W / cm 2)). Achten Sie darauf, einen zusätzlichen ROI Kreis Hintergrund zu haben.
- Verwendung von Echtzeit-3D-Rekonstruktion von Biolumineszenz-Intensitäten einzelner Tumorkolonien Nach vier Wochen nach der Injektion und vor dem Tieropfer, führen Diffuse Lumineszenzlampen Imaging-Tomographie (DLIT) IVIS mit der Tumorbelastung und Verteilung zu bewerten.
- Nach dem IVIS Initialisierung, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben, wählen Sie "Imaging-Assistent", "Biolumineszenz", und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "DLIT" und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Firefly" Sonden und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Maus" Bild Thema "Auto" Belichtungsparameter, "C-13 cm" Sichtfeld, und "0,5 cm" subject Höhe, und klicken Sie auf "Weiter". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" Imaging zu starten.
- Nachdem das Bild aufgenommen wird, wählen Sie die "DLIT 3D-Rekonstruktion" Tab und die "Analyse" und klicken Sie "Rekonstruieren", um die 3D-Rekonstruktion Bild zu erzeugen.
- Klicken Sie auf "Extras" und "3D-Animation". Wählen Sie "Spin CCW auf der Y-Achse" in der 3D-Animationsfenster. Klicken Sie auf "Record" und "Speichern" in eine .mov-Format-Datei.
6. Ex - vivo - Fluoreszenz - Bildgebung
- Opfern, um die Mäuse durch Genickbruch während betäubt, oder gemäß gültiger Richtlinien bei 4 - 6 Wochen nach den Injektionen Milz.
- Ernten Sie die Leber. Machen Sie einen horizontalen Schnitt von links nach rechts flankieren. Ergreifung des Xiphoidbasis mit einem Pickup, sezieren die falciform, die Lebervene und die untere Hohlvene.
- Präparieren Sie die richtige hepatorenal Band, das Ligamentum hepatoduodenale, und die linke hepatorenal Band, dabei nicht den Lobus caudatus zu verletzen, während das Ligamentum hepatoduodenale sezieren. Nach der Leber Ernte, entfernen Sie die Gallenblase, da dies Autofluoreszenz wird angezeigt. Notieren Sie alle zusätzlichen extraLeberTumoren vorhanden.
- Beachten Sie die Anzahl und Größe von Lebertumoren vorhanden makroskopisch, und legen Sie die geernteten Lebern in DPBS.
HINWEIS: Die Tumore sind makroskopisch sichtbar für das bloße Augeals weiße Tumore (für ein repräsentatives Beispiel, siehe Abbildung 4). - Vor der Platzierung auf dem Abbildungsblatt, nehmen Sie jede Leber und sanft überschüssige Flüssigkeit entfernen, indem Sie auf einem Papiertuch abtupfen.
- Messen Sie die Fluoreszenzintensitäten von jedem Tumor Kolonie des IVIS verwendet wird.
- Wählen Sie "Fluoreszenz", "4 Sekunden" Belichtungszeit "Medium" Binning "2" F / Stop, "535" Anregungsfilter und "580" Emissionsfilter. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" Imaging zu starten.
- Nachdem das Bild zu erwerben, das Bildfenster und Werkzeugpalette finden. Klicken Sie auf "ROI-Tools" und wählen Sie "1" aus dem Kreis-Symbol. So definieren ROIs, umrunden den Signalbereich der einzelnen Tumorkolonien auf das Bild, und klicken Sie dann auf "Messungen" der ROI als eine beliebige Einheit der Strahlungswirkungsgrad ((Photonen / s / cm 2 / Steradiant) / (& mgr; W / cm 2) ). Achten Sie darauf, einen zusätzlichen ROI Kreis Hintergrund zu haben.
- Berechnen Sie die gesamte Tumorvolumen durch die Annahme, es eine Kugel sein. Das Tumorvolumen = 4 x π xr 3/3 (r = Radius). Berechnen des Anteils der Tumorkoloniebildenden Zellen (Fc), wenn die Anzahl von Tumoren in der Leber durch die Anzahl von Zellen unterteilt splenically injiziert.
- Berechnen Sie die Gesamtzellzahl pro Kolonie (= X) aus der linearen Näherung aus Schritt 3.3. Berechnen Sie die Anzahl der Zellteilungen (= Y) als Y = 2 X anmelden und die Td als Td (Tag) = 28 / Y.
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Representative Results
Das Ziel dieses Experiments war es, eine kohärente und leicht reproduzierbare Tiermodell mit dem Potential für die serielle Quantifizierung des in vivo metastatischen Tumorlast und für die Abschätzung der Frequenz und Kolonisierung Wachstumskinetik der Entwicklung von Lebermetastasen herzustellen. Figuren 2-6, mit Legenden sind aus unserer früheren Veröffentlichung unter einer Creative Commons CC-BY - Lizenz 10 zur Verfügung gestellt.
Die Erzeugung von doppelt markierten Tumorzellmonoklone
Zunächst wird eine Gruppe von Leucht und fluoreszenz monoklonalen Zelllinien markiert wurde mit verschiedenen metastatischen Fähigkeiten erzeugt. Nach der erfolgreichen Transfektion von lumineszenten (Luc2) und Fluoreszenz (tdTomato) Proteine, die in Eltern HCT116 Darmkrebszellen, 16 doppelt markierten Monoklone wurden erzeugt, indem die elterliche HCT1 Verdünnung16-L2T Zellen auf 1 Zelle / 200 & mgr; l in 96 - Well - Platten (Abbildung 1) . 10 In vitro Fluoreszenz und Lumineszenz von HCT116-L2T wurde dann eine zunehmende Menge an Zellen quantifiziert , die Anzahl der Tumorzellen zu schätzen , von in vivo und ex vivo Lebertumordarstellung (Figur 2) 10.
Metastasierung Entwicklung durch Klone mit Differential Leber Colonization
Als nächstes Lebermetastasen, die 16 zuvor erzeugten einzelnen HCT116-L2T Klone wurden Milz in Mäuse injiziert zu erzeugen; eine Splenektomie wurde dann durchgeführt. Die Entwicklung von Lebermetastasen wurde durch Bildgebung wöchentlich in vivo Biolumineszenz überwacht, gefolgt von Ex - vivo - Fluoreszenz - Bildgebung , nachdem sie die Mäuse zu opfern. Von den 16 Monoklone erzeugt, wählten wir Klone als P1 bezeichnet, P2, O1 und O2, die aufgrund ihrer different beobachtet Kolonisierung und Wachstumsfähigkeiten in der Leber. Klone O1 und O2 hatte eine geringere Tumorlast, was "oligometastatic" Klonen und möglicherweise einen Phänotyp mit begrenzten Metastasen rekapituliert. Klone P1 und P2 hatte eine größere Tumorbelastung, was weite Verbreitung, die auch als polymetastatic Krankheit bezeichnet wird. Die Biolumineszenz war höher in der P1 und P2 Mäusen (6,7 × 10 6 ± 4,7 × 10 6 und 3,6 x 10 6 ± 2,5 × 10 6 Photonen / s / cm 2 / Steradiant) im Vergleich mit dem O1 und O2 - Mäusen (2,0 · 10 5 ± 1,3 × 10 5 und 1,7 x 10 5 ± 9.1 × 10 4 Photonen / s / cm 2 / Steradiant) 3 Wochen nach der Injektion Milz (3A, B) 10. Die Quantifizierung der ex vivo - Fluoreszenz der Lebern bei 4 Wochen nach der Injektion der Milz zeigte , dass P1 und P2 Lebern höher fluores hattencent Intensitäten verglichen mit O1 und O2 Lebern (3C). Die Tumorverteilungen in den ex - vivo - Fluoreszenzbilder wurden im Einklang mit makroskopischen Befunden (3C, D) 10.
Kolonisation und Wachstumskinetik einzelner Klone
Die Zahlen und Größen visualisiert Tumoren wurden makroskopisch gezählt und in jedem einzelnen Leber gemessen. Zusätzlich ex vivo Fluoreszenzbildgebung wurde für jede Monoklons auf jedem einzelnen Tumorkoloniegeführt (Abbildung 4) 10. Die Gesamtzahl der Tumore in P1 höher war im Vergleich zu P2, O1 und O2, während die Größe der Tumoren größer in P2 war als in P1, O1 und O2 (p <0,001; 5A, B) 10. Jedoch war die Gesamttumorvolumen in der Leber in P1 und P2 größer als im Vergleich zu O1 und O2 (5C)
Die 3D - Verteilung von metastatischen Tumoren in der Leber wurde durch DLIT (Abbildung 6) 10 gezeigt. Unter Verwendung dieser Abbildungstechnik ist es möglich, räumlich-zeitliche dynamische Verhalten der Metastasen durch den Nachweis und die Messung der Biolumineszenz der einzelnen Leber metastatischen Kolonien zu überwachen.
Die erzeugten Daten wurde Standard-Datenanalyse-Software analysiert, und die Fehlerbalken wurden als der Mittelwert ± Standardabweichung gezeigt. Pearson-Korrelationskoeffizienten wurden verwendet Assoziationen zwischen Parametern auszuwerten. P - Werte wurden 2-tailed Student-t-Tests bewertet Verwendung mit einem p <0,05 als statistisch signifikant.
Abb . 1: Erzeugung eines Panels von Monoklone von Beschriftete HCT116 Zellen (A) wachsen elterliche HCT116 mit Luciferase und tdTomato markierten Zellen. (B) verdünnen elterliche HCT116 Zellen auf 1 Zelle / 200 & mgr; l. (C) Platte 200 ul der Verdünnung in eine 96 - Well - Platte. (D) monoclo wachsennes aus jeder Vertiefung in der 96-Well-Platte. (E) Injizieren Monoklone Milz in Mäuse Lebermetastasen zu erzeugen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Schätzung der Anzahl der Zellen , die durch Fluoreszenzintensitäten (A) Das Leuchtbild von einer unterschiedlichen Anzahl von in einer 96 - Well - Platte verdreifachten Zellen.. (B) Die Korrelation zwischen der Anzahl der Zellen und die Lumineszenz (R = 0,99, p <0,0001). Der Maßstab repräsentiert Lumineszenzintensität (Photonen / s / cm 2 / Steradiant). (C) Das Fluoreszenzbild von einer unterschiedlichen Anzahl von in einer 96 - Well - Platte verdreifachten Zellen. Intensities wirwieder als Strahlungswirkungsgrade mit einer 535 nm Anregung und 580 nm Emission erworben. (D) Die Korrelation zwischen der Anzahl der Zellen und die Fluoreszenz (R = 0,99, p <0,0001). Der Maßstab stellt die Fluoreszenzintensität in einer beliebigen Einheit der Strahlungswirkungsgrad ((Photonen / s / cm 2 / Steradiant) / (& mgr; W / cm 2)). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Biolumineszenz und E x Vivo Fluoreszenz der Leber in ausgewählten Klonen (A) Repräsentative Biolumineszenz - Bilder.. Der Maßstab repräsentiert Leucht intichte (Photonen / s / cm 2 / Steradiant). (B) Biolumineszenz gemessen wöchentlich von 1 bis 3 Wochen P1 und P2, und 1 bis 4 Wochen im O1 und O2. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (C) Repräsentative ex vivo Fluoreszenzbilder von Lebern. Intensities wurden als Strahlungswirkungsgrade mit einer 535 nm Anregung und 580 nm Emission erworben. Der Maßstab repräsentiert Fluoreszenzintensität in einer beliebigen Einheit der Strahlungswirkungsgrad ((Photonen / s / cm 2 / Steradiant) / (& mgr; W / cm 2)). (D) Makroskopische Leber Bilder (Pfeile zeigen kleine weiße Tumoren). P1 und P2: polymetastatic Klone, O1 und O2: oligometastatic Klone. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb . 4: Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten einzelner Leber Kolonien Bilder auf der linken Seite sind repräsentative makroskopischen Befunde und Bilder auf der rechten Seite sind Fluoreszenzintensitäten in jedem Klon. Die Fluoreszenzintensitäten wurden als Strahlungswirkungsgrade mit einer 535 nm Anregung und 580 nm Emission erworben. P1 und P2: polymetastatic Klone, O1 und O2: oligometastatic Klone. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5:. Quantitative Abschätzung der Fähigkeit zur Besiedelung und Wachstums Kinetics (
Abbildung 6: Quantificatiauf der Biolumineszenz einzelner Tumorkolonien mit Diffuse Lumineszenzlampen Imaging - Tomographie (DLIT). (A) 3D - Draufsicht. Der Maßstab repräsentiert Fluoreszenzintensität in einer beliebigen Einheit von Strahlungseffizienz. (B) Frontalschnitt. (C) Sagittalschnitt. (D) Transaxiales Abschnitt. (E) makroskopische Bild der Leber. (F) Ex vivo Fluoreszenzbild der Leber. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 10. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Tiermodell im aktuellen Bericht dargestellt basiert auf zwei Hauptansätze. Erstens, um die Fähigkeit zu beobachten metastatic Klone mit unterschiedlichen Neigungen zu gewährleisten zu kolonisieren und in der Leber, eine Gruppe von sehr heterogenen monoklonalen Zelllinien wurde festgestellt, anstatt einer etablierten unfraktioniertem Krebszelllinie 12,13 vermehren. Der monoklonale Ansatz Entwicklung zur Metastasierung wird durch die jüngsten genomischen Daten 14 gerechtfertigt und wurde erfolgreich vorher zu modellieren das metastatische Prozess 10,15,16 verwendet. Zweitens Doppelmarkierung der Elternzelllinie durch Luciferase und tdTomato Marker wurde eingeführt , um eine verbesserte Analyse der metastatischen Wachstums , um sowohl in vivo und ex vivo. Das lumineszente und Fluoreszenzmarkierung ermöglicht eine detaillierte anatomische Untersuchung und Quantifizierung Potential sowohl der Menge der metastatischen Tumoren (betrachtet, wenn die Frequenz oder die Wirksamkeit von Leber colonization) und die Größe einer einzelnen Kolonie. Diese kann leicht auf eine tatsächliche Anzahl von Zellen umgewandelt werden , um eine einfache Kalibrierungsprozedur in Schritt 2 beschriebenen , und die Figuren 2 und 10 4 10. Mit Hilfe dieser Daten ist es möglich , die Td für jeden metastatischen Knoten in der Leber zu schätzen und die Wachstumskinetik von Lebermetastasen für jede Anfangs Monoklons injiziert (Figur 5) 10 zu bewerten.
Drei verschiedene colorectal metastatischen Phänotypen wurden in diesem Versuchssystem, bezeichnet als P1, P2 und O1 / O2 beobachtet. Diese metastatischen Phänotypen unterschieden, wenn für jeden metastatischen Klon die Daten der Häufigkeit der Besiedlung und lokalen Wachstumsraten zu vergleichen. Der erste metastatischen Phänotyp, P1, zeigten eine verbesserte Fähigkeit, die Leber, aber eine relativ geringe lokale Wachstumsrate, entsprechend viele kleine Metastasen in der gesamten Leber zu kolonisieren. Der zweite metastatischen Phänotyp, P2, hatteeine niedrigere Frequenz der Kolonisierung aber eine wesentlich höhere lokale Wachstumsrate, in einer relativ kleinen Anzahl von großen sekundären Tumoren führt. Schließlich ist der dritte metastatischen Phänotyps, O1 und O2, zeigten sowohl eine niedrige Frequenz der Kolonisierung und langsamen Geschwindigkeiten lokale Wachstum. Dieser dritte metastatischen Phänotyp kann als Darstellung der klinischen oligometastatic Lebererkrankung (Figuren 3 und 10 5 10) betrachtet werden. Darüber hinaus Vergleich der Genexpressionsanalyse dieser Klone 10 identifizierten signifikanten Unterschiede in der Expressionsmuster. Wenn beispielsweise P1 mit O1 und O2 Klonen verglichen, waren 756 differentiell exprimierten Gene, einschließlich einer Untergruppe von Genen in Entzündungsreaktionen und Interferon Signalgebung beteiligt. Diese Studie, wie auch andere, sind diese Gene in spielen Schlüsselrollen in das Tumorwachstum und das Überleben 21, 22 gebracht. Zusätzlich wird , wenn P2 zu O1 und O2 zu vergleichen, da differentiell expresse 461 warend Genen, mit einer Teilmenge Gene kritisch für das Zellwachstum und die Proliferation durch ERK1 / 2-Signalisierung vermittelt beteiligt sind.
Die Vielfalt der metastatischen dieses Versuchsmodell erzeugt Phänotypen ist konsistent mit den beobachteten klinischen Darstellungen von metastatischen Heterogenität. Beispielsweise wurde gezeigt , dass die Größe der Lebermetastasen (ein Parameter Wachstumspotential bezogen) und ihre Zahl (ein Parameter Besiedlungsfähigkeit bezogen) sind unabhängige Risikofaktoren für Fernmetastasen 1. Mit verbesserten Wachstumspotenzial oder Besiedlungsfähigkeit beobachteten die Eigenschaften in P1 und P2 sind im Einklang mit diesen Daten. Darüber hinaus deuten die jüngsten Beobachtungen von Patienten , die mit Stereotaktische Körperradiotherapie (SBRT) oder mit chirurgisch entfernten Lungenmetastasen sowohl auf die Anzahl von Tumoren und die Progressionsrate als Schlüsselfaktoren Gesamt - und krankheitsfreie Ergebnisse zu bestimmen 17,18. Somit scheinen Fähigkeiten Kolonisierung und WachstumGehören Sie zu den wichtigsten Faktoren bei der Entwicklung von metastasierendem Klone an entfernten Stellen 19,20 bestimmen. Experimentelle Modelle, die auf diesen Eigenschaften von metastasierendem Klone basieren, liefern können nützliche Werkzeuge für das Verständnis der Mechanismen der Metastasierung Entwicklung, sowie ein Mittel zur Erprobung neuer Behandlungsmethoden für die Heilung der Leber Metastasen.
Während ein orthotopen Modell in der Lage spontane Metastasen erzeugen ideal ist, bleibt ein Mangel an leicht reproduzierbare und konsistente spontane Modelle. Während Modelle intracecal Implantation oder Injektionen unter Verwendung beschrieben wurden, zeigten sie variable Raten der Aufnahme und der Metastasenbildung 23-26. Andere Verfahren haben eine Eileiter Implantation Ansatz von intralienale oder intra Injektion zu erzeugen Lebermetastasen eingesetzt. Während die Gesamtinjektionstechnik ist die gleiche, präsentiert das Modell liefert hier eine behutsame Understanding die Mechanismen der Metastasierung Entwicklung, von der Phase der zirkulierenden Tumorzellen beginnen (CTC). Sensitivität und Reproduzierbarkeit unseres Ansatzes wird durch die Doppelmarkierung der Zelllinien bestimmt sowohl für Biolumineszenz und Fluoreszenz-Bildgebung zu ermöglichen, die Dynamik des metastatischen Prozess zu verfolgen. Aufgrund der Fähigkeit, den metastatischen Belastung aus dem Lumineszenz- und Fluoreszenzdaten zu quantifizieren, ist es möglich, die Wachstumskinetik von Metastasen über die Zeit systematisch zu messen und zu verfolgen. Obwohl alternative Ansätze, wie beispielsweise ultraschallbasierten Bildgebung verwendet wurden, sind diese Modalitäten viel benutzerabhängig, mit möglicherweise erhöhter inter Benutzer 27 Variabilität. Zusätzlich kann durch eine Reihe von monoklonalen Zelllinien zu erzeugen, sind wir reproduzierbar und verschiedene metastatische Phänotypen um besseres Modell der Variabilität von Metastasen in der klinischen Einstellung gesehen bieten können.
Während dieses experimentelle Technik zu meistern,speziell die intralienale Injektion für die in - vivo - Mausmodell (siehe Schritt 4), gibt es ein paar wichtige Schritte , die Änderung erfordern. Bemerkenswert ist die splenic Injektions Durchführung der wichtigste Teil des Modells, wie eine unzureichende Injektion der Milz in schlechten Ergebnissen führen kann. Austreten von Zellen während der Injektion oder durch die unsachgemäße Platzierung des Mikroclip verursachte Leckage kann in einer geringeren Anzahl von Lebermetastasen und / oder eine erhebliche Menge an extraLeberTumoren oder peritoneal Karzinomastosen führen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Tumorzellen langsam für mindestens so lange, wie in dem Protokoll beschrieben ist, zu injizieren, um eine Erhöhung der intralienale Druck zu vermeiden, der Extravasation der Zellen zu benachbarten Gewebe und dem Wachstum führen können von Extra-Lebertumoren um den Stumpf der Milz Dissektion.
Schließlich gibt es in Schritt 4.3, eine Reihe von für die splenic Injektion Zellen (1,2 bis 2 x 10 6 </ Sup> Zellen). Der Zweck dieses Bereichs ist für einzelne Betreiber dieser Technik zu berücksichtigen. Es kann einige Zeit dauern eine optimale Anzahl von Zellen zu kalibrieren zu injizieren. Wenn zu wenige Zellen injiziert werden, Lebermetastasen entwickeln, möglicherweise nicht, und wenn zu viele Zellen injiziert werden, Pfortader Okklusion auftreten können, zu dem frühen Tod des Tieres führt. Es kann sinnvoll sein, zunächst mehrere verschiedene Konzentrationen von Tumorzellen zu versuchen, wenn dieses Modell, um ausgehend die optimale Anzahl zu finden.
Eine pitfall des präsentierten Modells ist , dass es auf einem Xenotransplantat - Ansatz basiert und nutzt immundefizienten Nacktmäusen. Eine alternative Methode die Erzeugung eines ähnlichen Paneels monoklonaler Derivate der murine kolorektale Zellinie MC38 vorgeschlagen, doppelt markiert mit Luciferase und tdTomato oder EGFP Proteine. Diese Klone können dann in syngene Tiermodellen verwendet werden, um die Interaktionen zu entwickeln Lebermetastasen mit dem Host immu einzufangenne-System.
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Acknowledgments
Wir möchten Dr. Geoffrey L. Greene (University of Chicago) für das Luc2-tdTomato Plasmid und der HCT116-Zelllinie, Herr Ani Solanki (Tier Resource Center) für die Mäuse-Management, und Dr. Lara Leoni für die Unterstützung danken, mit dem DLIT. Quantifizierungen von fluoreszierenden und lumineszenten Intensitäten wurden im Integrierten Kleintier Imaging Research Ressourcen an der Universität von Chicago auf einem IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA) durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Virginia und DK Ludwig Fonds für Krebsforschung unterstützt wurde, die Lung Cancer Research Foundation (LCRF), die Prostate Cancer Foundation (PCF) und die Cancer Center Support Grant (P30CA014599). Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zu veröffentlichen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In Vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3 mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
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