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Cancer Research

जिगर में कोलोरेक्टल मेटास्टेसिस के उन्नत पशु मॉडल: इमेजिंग तकनीक और metastatic क्लोन का गुण

Published: November 30, 2016 doi: 10.3791/54657
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 2, 2, 2
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago
* These authors contributed equally

Abstract

यकृत मेटास्टेसिस और प्रगति की धीमी दर की एक सीमित संख्या के साथ मरीजों को सफलतापूर्वक स्थानीय उपचार के साथ इलाज किया जा सकता 1,2 दृष्टिकोण। हालांकि, छोटे जिगर metastases की विविधता के बारे में जाना जाता है, और पशु व्यक्ति मेटास्टेटिक कालोनियों के विकास का मूल्यांकन करने में सक्षम मॉडल की जरूरत है। यहाँ, हम यकृत मेटास्टेसिस कि मात्रात्मक जिगर में अलग-अलग ट्यूमर क्लोन के विकास के लिए कल्पना और उनके विकास कैनेटीक्स और उपनिवेशवाद दक्षता अनुमान करने की क्षमता प्रदान करता है के एक उन्नत मॉडल प्रस्तुत करते हैं। हम HCT116 मानव कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं को स्थिरतापूर्वक luciferase और tdTomato और विभिन्न विकास गुण रखने के साथ लेबल की मोनोक्लोनल डेरिवेटिव के एक पैनल उत्पन्न। एक splenectomy के बाद एक प्लीहा इंजेक्शन के साथ, इन क्लोन के बहुमत यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने में सक्षम है, लेकिन उपनिवेशवाद के विभिन्न आवृत्तियों और अलग-अलग विकास दर के साथ कर रहे हैं। Vivo इमेजिंग Syste का प्रयोगमीटर (IVIS), यह कल्पना और इन विवो luminescent और पूर्व vivo फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ मेटास्टेसिस विकास यों के लिए संभव है। इसके अलावा, फैलाना Luminescent इमेजिंग टोमोग्राफी (DLIT) जिगर उपनिवेशवाद की आवृत्ति के मूल्यांकन और विकास कैनेटीक्स के लिए अनुमति देता है, विवो में जिगर metastases के एक 3 डी वितरण प्रदान करता है। पूर्व vivo काटा यकृत के फ्लोरोसेंट इमेजिंग व्यक्ति यकृत मेटास्टेटिक कालोनियों के मात्रात्मक मापन प्रदान करता है मेटास्टेसिस की। चूंकि मॉडल चिकित्सकीय मनाया जिगर metastases के समान है, यह यकृत मेटास्टेसिस के साथ जुड़े जीन का पता लगाने के लिए और जिगर मेटास्टेटिक रोग के लिए संभावित पंचमी विभक्ति या सहायक उपचार के परीक्षण के लिए एक साधन के रूप में सेवा कर सकते हैं।

Introduction

प्राथमिक कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) से यकृत मेटास्टेसिस के साथ मरीजों को एक गरीब पूर्वानुमान की विशेषता है। प्राथमिक nonmetastatic सीआरसी के लिए 5 साल की जीवित रहने की दर (चरणों मैं - तृतीय) - 88% 3,4 जबकि यकृत मेटास्टेसिस (चतुर्थ चरण) के साथ रोगियों को केवल 8 के एक 5 साल की जीवित रहने की दर है - के रूप में 75 का अनुमान है 12% 5 , 6। हालांकि, मेटास्टेटिक रोगियों को एक विषम समूह का प्रतिनिधित्व करते, मेटास्टेसिस और विभिन्न पुनरावृत्ति बार के विभिन्न संख्या के साथ पेश किया। नैदानिक टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि मेटास्टेसिस की संख्या और किसी एक मेटास्टेसिस (स्थानीय विकास दर के लिए आनुपातिक) के आकार (जो बस्तियां क्षमता या उपनिवेशवाद की आवृत्ति के लिए आनुपातिक हो सकता है) स्वतंत्र शकुन कारकों 1,7 हैं। उनकी विकसित करने के लिए और उनके प्रसार और जिगर microenvironment में जीवित रहने की क्षमता की क्षमता: दूसरे शब्दों में, जिगर बस्तियां मेटास्टेटिक क्लोन की सफलता के दो प्रमुख गुणों पर निर्भर करता है।

परिरूपकब्जा करने और मेटास्टेटिक क्लोन के गुणों को बढ़ाता काफी जिगर मेटास्टेसिस जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ में सुधार और क्षमता चिकित्सकीय दृष्टिकोण के डिजाइन के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान कर सकते हैं की क्षमता के साथ के सफल नैदानिक ​​मॉडल। प्रयोगात्मक जिगर मेटास्टेसिस के मॉडल पहले से 8,9 सूचना दी गई है, लेकिन न तो उनमें से मात्रात्मक कब्जा है और दोनों विवो और पूर्व vivo में अलग-अलग मेटास्टेटिक क्लोन के गुणों का वर्णन करने की क्षमता प्रदान की है।

यहाँ, हम जिगर मेटास्टेसिस कि विभिन्न जिगर बसाना क्षमता और विकास के गुणों के साथ ट्यूमर क्लोन की पीढ़ी भी शामिल है के लिए एक नया, उन्नत मॉडल प्रस्तुत करते हैं। हम luciferase और मोनोक्लोनल सेल लाइनों मेटास्टेटिक क्षमता में आंतरिक मतभेद है की पीढ़ी के साथ tdTomato फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ कैंसर कोशिकाओं के दोहरे लेबलिंग का एक संयोजन कार्यरत हैं। इस प्रयोगात्मक मॉडल में, आंकड़ों से संकेत मिलता है कि विकास कीजिगर metastases बसाना आवृत्ति की शर्तें और दुगनी समय (टीडी) है, जो नैदानिक ​​टिप्पणियों के साथ संगत है में वर्णित किया जा सकता है। इस मॉडल की मात्रात्मक प्रकृति यह आसानी से दवाओं की खोज और नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए ग्रहणीय बनाता है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं शिकागो विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल # 72213-09) में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है और बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया।

1. तैयारी

  1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक: HCT116 ट्यूमर कोशिकाओं की संस्कृति के लिए माध्यम की 500 एमएल बनाओ।
  2. 20 मिनट के लिए 251 डिग्री फेरनहाइट पर, 4 शल्य तौलिए, धुंध, दो छोटे Adson ले जाना, एक सुई ड्राइवर, कैंची के दो जोड़े, एक छोटे से दबाना, और 3 microclips - आटोक्लेव उपकरणों 3 सहित तिल्ली इंजेक्शन मॉडल, के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. , चूहों के लिए पश्चात संज्ञाहरण तैयार तिल्ली इंजेक्शन के बाद subcutaneously प्रशासित किया जाना है। 0.9 माउस प्रति सामान्य नमक के 500 μL में buprenorphine के 4 माइक्रोग्राम - पतला 2।
  4. 150 माइक्रोग्राम / 150 जुगनू luciferin के μL की aliquots intraperitoneal इंजेक्शन के लिए तैयार durbioluminescence assays हैैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और प्रकाश से बचाने के लिए।

2. Luciferase / tdTomato लेबल मोनोक्लोनल सेल लाइन्स 10,11 की पीढ़ी

  1. पिघलना और HCT116 मानव कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं और 10% FBS, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ DMEM में 293FT मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं को बनाए रखें। 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति में बनाए रखें।
  2. एक उच्च अनुमापांक lentivirus उत्पादन।
    1. 12 x 10 6 293FT पूरा DMEM के 18 एमएल (cDMEM) में पारित होने के 3 और 10 से 15 सेमी सेल संस्कृति बर्तन में के बीच 10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ कोशिकाओं, और 1% अनावश्यक अमीनो एसिड - डी 1, थाली 10 पर । 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
    2. डी 2 पर, निम्न अभिकर्मक समाधान का उपयोग कोशिकाओं transfect:
      1. प्रत्येक पकवान के लिए, निम्न का उपयोग करें: pFUG lentiviral वेक्टर के 37.5 माइक्रोग्राम luciferase (Luc2) और tdTomato के साथ डाला की एक डीएनए मिश्रण11 (शिकागो विश्वविद्यालय में डॉ जेफ्री ग्रीन की ओर से उपहार), pCMVΔ8.74 का 25 माइक्रोग्राम, और 12.5 माइक्रोग्राम pMD2.G की बाँझ एच 2 ओ के 1062 μL के कुल में resuspended constructs 2 एम 2 CaCl के 188 μL जोड़ें।
      2. जोड़े 1,250 2x Hepes बफर खारा (एचबीएस, 50 मिमी HEPES, 1.5 मिमी ना 2 HPO 4, और 180 मिमी NaCl, पीएच 7.12) डीएनए / 2 CaCl समाधान करने के लिए, एक समय में एक बूंद की μL, जबकि के माध्यम से बुलबुले उड़ाने एक विंदुक के साथ समाधान।
      3. 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं, और फिर 25 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए आरटी cDMEM और क्लोरोक्वीन की 15.5 एमएल जोड़ने।
    3. 293FT कोशिकाओं में से प्रत्येक थाली में मीडिया Aspirate और अभिकर्मक समाधान के साथ बदलें। , अभिकर्मक समाधान धीरे-धीरे 16 एमएल जोड़ें के रूप में चढ़ाया कोशिकाओं को आसानी से बेदखल।
    4. डी 3 पर, के बाद 8 - 16 h, अभिकर्मक समाधान फिर taki हटाने और Dulbecco फास्फेट बफर खारा (DPBS) के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें,एनजी कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए नहीं परवाह है। 10 मिमी HEPES के साथ नए सिरे cDMEM के 18 एमएल के साथ मीडिया बदलें।
      नोट: धीरे धीरे, बर्तन ले जाने के लिए अभिकर्मक समाधान निकालना है, और इतनी के रूप में कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए नहीं प्लेटों के sidewall के माध्यम से मीडिया जोड़ें।
    5. डी 4 पर, अभिकर्मक के समय से 48 घंटे में एक विंदुक के साथ धीरे-धीरे श्वास के रूप में तो कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए नहीं द्वारा व्यंजन से मीडिया इकट्ठा। अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 300 XG पर एकत्र मीडिया बड़े सेल मलबे वेग।
    6. का उपयोग कर वायरल सतह पर तैरनेवाला फिल्टर एक 0.45 माइक्रोन कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर कुप्पी और सेंट्रीफ्यूज 50,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक दप-28 रोटर का उपयोग कर। centrifugation समाप्त होने के बाद तुरंत सतह पर तैरनेवाला छानना और वाइपर के साथ ट्यूब के अंदर सूखी।
    7. 1% FBS के साथ कम सीरम मध्यम (RSM) के 50 μL में वायरल गोली Resuspend। Aliquots भविष्य के उपयोग (वायरल शेयर) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. lentivirus transduceHCT116 कोशिकाओं में और तों tdTomato पॉजिटिव क्लोन के एक पैनल उत्पन्न करते हैं।
    1. वायरल संक्रमण से पहले का 1 एक्स 10 24 5 में अच्छी तरह प्लेटें 1 डी घनत्व पर HCT116 कोशिकाओं थाली।
    2. 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 8 माइक्रोग्राम / एमएल polybrene के साथ: (100 कमजोर पड़ने 1) (cRSM) RSM के 4 एमएल में resuspended वायरस के 40 μL (2.2.7) से पतला।
    3. संक्रमण के दिन, DPBS के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें, और फिर अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कदम 2.3.2 से पतला वायरस के 250 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे और 5% सीओ 2 के लिए सेते हैं, और उसके बाद प्रत्येक अच्छी तरह से cDMEM के 1 एमएल जोड़ने; 72 एच - 48 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
    4. 0.05% trypsin के 1 एमएल और 0.53 मिमी EDTA के साथ कोशिकाओं resuspend, और फिर trypsin बेअसर करने के लिए cDMEM के 1 एमएल जोड़ें। 4 मिनट के लिए 300 XG पर एक microcentrifuge ट्यूब और गोली कोशिकाओं स्थानांतरण। हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) प्लस 2% FBS के 1 एमएल में गोली 3x धो लें।
    5. कदम 2.3.4 से गोली Resuspend1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल FACS बफर (2% FBCS और पीबीएस में 2 मिमी EDTA) एक एकल कक्ष निलंबन में साथ।
    6. क्रमबद्ध tdTomato पॉजिटिव HCT116 कोशिकाओं, एक सेल सॉर्टर का उपयोग कर पीई पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए gating (उत्तेजना / उत्सर्जन: 556/585 एनएम)। 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 10 सेमी डिश में एकत्र कोशिकाओं को विकसित पैतृक tdTomato पॉजिटिव HCT116 कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) उत्पन्न करने के लिए।
    7. 0.05% trypsin के 8 एमएल और 3 के लिए 0.53 मिमी EDTA के साथ 2.3.6 से माता पिता का tdTomato पॉजिटिव HCT116 कोशिकाओं Resuspend - 5 मिनट, और फिर trypsin बेअसर करने के लिए 8 cDMEM एमएल जोड़ें।
      1. 4 मिनट के लिए 300 XG पर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब और गोली कोशिकाओं स्थानांतरण। तैरनेवाला निकालें और cDMEM (चित्रा 1 बी) में 200 μL प्रति 1 सेल करने के लिए माता पिता का tdTomato पॉजिटिव HCT116 कोशिकाओं को कमजोर।
    8. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 सी) में एक 96 अच्छी तरह से थाली में एक एकल कोशिका (कमजोर पड़ने के 200 μL) अच्छी तरह से प्रति प्लेट।
    9. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर बोतल में अलग-अलग monoclones आगे बढ़ें। (चित्रा -1)।

सेल नंबर के एक समारोह के रूप में फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता 3. कैलिब्रेशन

  1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं HCT116, अब के रूप HCT116-L2T करने के लिए भेजा थाली, 0 के घनत्व पर, 10 3, 2 एक्स 10 4, 3 एक्स 10 5, 5 एक्स 10 4, 7 एक्स 10 4, 9 10 x 4, और 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्रत्येक में घनत्व के लिए triplicates में 96 अच्छी तरह प्लेटें।
  2. ऊष्मायन के 5 घंटे के बाद, tdTomato फ्लोरोसेंट तीव्रता IVIS 10 का उपयोग यों।
    1. डेस्कटॉप पर छवि सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करें सॉफ्टवेयर शुरू करने के लिए। इमेजिंग प्रणाली प्रारंभ करने के लिए "इनिशियलाइज़" बटन पर क्लिक करें। प्रारंभ के खत्म (जो कुछ मिनट के बारे में लेता है) के बाद, चुनें "प्रतिदीप्ति", "4 दूसरी" जोखिम समय, "मध्यम" binning, "2" एफ / बंद करो, "535" उत्तेजना फिल्टर,और "580" उत्सर्जन फिल्टर।
    2. इमेजिंग स्टेशन पर 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और इमेजिंग शुरू करने के लिए "अधिग्रहण" पर क्लिक करें। बाद छवि हासिल कर ली है, "रॉय उपकरण" पर क्लिक करें उपकरण पट्टी में और 12 x 8 भट्ठा आइकन से चुनें।
    3. 12 x 8 slits 96 अच्छी तरह से थाली की छवि पर संकेत के क्षेत्र को कवर किया और माप टैब पर क्लिक करने के लिए बनाएँ। प्रति वर्ग सेमी प्रति फोटॉनों steradian प्रति की इकाइयों के साथ रॉय माप की एक मेज के साथ एक खिड़की का निरीक्षण करें (फोटॉनों / एस / एस आर / 2 सेमी)।
  3. तर्क (एक्स अक्ष) के साथ एक scatterplot कोशिकाओं की संख्या और समारोह (y अक्ष) संकेत तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए बराबर का निर्माण। (चित्रा 2) 10 एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग फ्लोरोसेंट तीव्रता की इकाई के लिए इसी कोशिकाओं की राशि की गणना करने के लिए प्रतिगमन घटता गणना।

4. जिगर metastases के पशु मॉडल

  1. एक बार जब HCT116-L2T कोशिकाओं 70 तक पहुंच- 80% confluency, उन्हें तिल्ली इंजेक्शन के लिए लगभग 1 घंटे के लिए पहले तैयार करते हैं। 3 के लिए 0.53 मिमी EDTA में 0.05% trypsin का उपयोग कोशिकाओं को अलग कर देना - 5 मिनट, और फिर उन्हें cDMEM के बराबर राशि के साथ बेअसर। अच्छी तरह से करने के लिए पिपेट clumping से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
  2. एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना।
  3. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 100 μL - 1.2 की एकाग्रता के लिए 1x DPBS में कोशिकाओं Resuspend। पिपेट और clumping से बचने के लिए अच्छी तरह से कोशिकाओं resuspend के लिए सुनिश्चित करें।
  4. , इंजेक्शन जब तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें कभी कभी उन्हें ट्यूब में resuspending।
  5. चूहों anesthetizing करने से पहले, एक preoperative संवेदनाहारी और subcutaneously द्वारा तरल पदार्थ सांस buprenorphine मिश्रण 1.3 चरण में वर्णित के 500 μL इंजेक्शन लगाने प्रदान करते हैं। अतिरिक्त buprenorphine मिश्रण का एक ही खुराक एक दिन में दो बार प्रशासन जब तक दर्द (कम गतिशीलता, hunched कद, दूल्हे के लिए विफलता, वोकलिज़ेशन जब संभाला) के लक्षण को हल है।
  6. असंवेदनता 6 से 8 सप्ताहएक संज्ञाहरण कक्ष में ऑक्सीजन में 2% isoflurane साथ -पुरातन महिला athymic नग्न चूहों। पुष्टि करें कि चूहों पूंछ pinching द्वारा संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से कर रहे हैं। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें। तिल्ली इंजेक्शन के लिए एक व्यक्ति के नाक शंकु के लिए प्रत्येक anesthetized माउस स्थानांतरण। चीरा के लिए पहले, प्रत्येक माउस के एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  7. नग्न चूहों के बाईं ओर पर त्वचा के माध्यम से बाहर से देखा एक बैंगनी क्षेत्र के रूप में तिल्ली को पहचानें। microdissection कैंची का प्रयोग, बस तिल्ली ऊपर त्वचा पर एक 8 मिमी बायीं ओर चीरा बनाते हैं।
    1. अगले, पेट की दीवार पर ऊपर उठा और एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। उदर गुहा में हवा की अनुमति है, ताकि आंतरिक अंगों चीरा साइट से दूर ले जाते हैं। लगभग 5 मिमी के लिए पेट की दीवार चीरा विस्तार।
    2. धीरे एक कपास झाड़ू से चीरा आसपास के दबाव को लागू करने से तिल्ली बेनकाब। यदि आवश्यक हो, अग्नाशय वसा धीरे आदमी हो सकता हैइतनी के रूप में तिल्ली घायल नहीं जोखिम के साथ मदद करने के लिए ipulated।
  8. धीरे-धीरे सामने आ तिल्ली की नोक में एक 27 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कोशिकाओं के 100 μL इंजेक्षन। कम से कम 30 की अवधि में, धीरे धीरे इंजेक्षन - 60 एस, अतिरिक्त जिगर ट्यूमर से बचने के लिए।
  9. तिल्ली पर एक microclip इंजेक्शन के अंत में सुई को हटाने इंजेक्शन सेल निलंबन के रिसाव को रोकने के लिए करने से पहले रखें।
  10. 5 मिनट के लिए जगह में microclip छोड़ दें।
  11. 5 मिनट postinjection, रक्तस्तम्भन के लिए एक हाथ से आयोजित दाग़ना डिवाइस का उपयोग कर एक splenectomy प्रदर्शन करते हैं। प्लीहा नाभिका काटना, पूर्वकाल की ओर से शुरू। जब बड़े जहाजों विदारक, आसन्न वसा ऊतकों के साथ जहाजों के समीपस्थ ओर पूर्व जमना, दाग़ना का उपयोग कर अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए।
    नोट: रक्तस्तम्भन के लिए तरीके:, दाग़ना के साथ सीधे खून बह बिंदु जमना 3 के लिए खून बह रहा है बात करने के लिए दबाव लागू - 5 मिनट, या सिवनी-ligate 5-0 रेशम टाई के साथ खून बह बिंदु। दो परतों में प्रत्येक माउस के पार्श्व चीरा बंद करें। सबसे पहले, एक एकल क्षैतिज सिलाई में 5-0 absorbable लट सीवन (जैसे, vicryl) के साथ पेट की दीवार को बंद करें। इसके बाद, त्वचा 4-0 nonabsorbable monofilament सीवन (जैसे, Prolene) का उपयोग कर, फिर एक एकल क्षैतिज सिलाई के साथ बंद हुआ।
  12. 70% isopropanol छिड़काव हर प्रक्रिया के बीच बाँझ स्थिति बनाए रखने के द्वारा सभी उपकरणों को साफ करें।
    नोट: सुनिश्चित करें जानवरों गरम कर रहे हैं, जबकि वे संज्ञाहरण से जाग कर। सभी चूहों पर नजर रखने के बाद operatively जब तक वे चल बनने के लिए और सामान्य गतिविधि के लिए वापसी। 5 मिनट - आमतौर पर, वसूली समय लगभग 3 है। जानवरों की पहुंच से बाहर छोड़ जब तक वे पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। एक जानवर जब तक यह पूरी तरह से ठीक हो गया है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है।

5. vivo bioluminescent इमेजिंग में

  1. पर इमेजिंग प्रदर्शनएक साप्ताहिक आधार मापने के लिए और समय के साथ bioluminescence में परिवर्तन यों की।
  2. एक संज्ञाहरण कक्ष में चूहों प्लेस और उन्हें ऑक्सीजन में 2% isoflurane साथ anesthetize। पुष्टि करें कि चूहों की पूंछ pinching द्वारा संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से कर रहे हैं। जबकि संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
  3. अगले, intraperitoneally कदम 1.4 से जुगनू luciferin preprepared के 150 μL के साथ प्रत्येक माउस इंजेक्षन।
  4. व्यक्तिगत नाक शंकु isoflurane के प्रशासन के साथ एक IVIS में चूहों रखें। आसन्न चूहों को कम से कम करने के संकेत के बीच में spacers के साथ लापरवाह स्थिति में चूहों रखें। पांच चूहों की एक अधिकतम एक समय में imaged किया जा सकता है।
  5. उपाय और bioluminescent तीव्रता का विश्लेषण luciferin इंजेक्शन के बाद 3 मिनट।
    1. कदम 3.2.1 में वर्णित के रूप में IVIS आरंभ करने के बाद, "Luminescent", "1 सेकंड" जोखिम समय, और "मध्यम" binning का चयन करें।
    2. कल्पना शुरू करने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करेंजी। luciferin इंजेक्शन के बाद एक लगातार समय (3 मिनट) पर प्रत्येक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें।
    3. बाद छवि हासिल कर ली है, एक छवि खिड़की और उपकरण पट्टी दिखाई देगा। क्लिक करें "रॉय उपकरण" और "1", "2", "3", "4" या "5" चक्र चिह्न से, imaged चूहों की संख्या के लिए इसी।
    4. ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों को परिभाषित, माउस के उदर गुहा में luminescent संकेत के संकेत क्षेत्रफल वृत्त, और फिर उज्ज्वल दक्षता के एक मनमाना इकाई के रूप में क्लिक करें रॉय के "माप" के लिए ((फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) / (μW / 2 सेमी))। पृष्ठभूमि की एक अतिरिक्त लागत पर लाभ चक्र है सुनिश्चित करें।
  6. चार सप्ताह के बाद इंजेक्शन और पशु बलि से पहले, ट्यूमर बोझ और वितरण व्यक्ति ट्यूमर कालोनियों के bioluminescent तीव्रता के वास्तविक समय 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग का मूल्यांकन करने के IVIS का उपयोग कर फैलाना Luminescent इमेजिंग टोमोग्राफी (DLIT) प्रदर्शन करते हैं। चूहों anesthetize और कदम 5.2.4 में वर्णित है, luciferin इंजेक्षन। DLIT एक समय में एक माउस पर किया जाता है।
  7. IVIS आरंभ करने के बाद, कदम 3.2.1 में वर्णित है, "इमेजिंग विज़ार्ड", "Bioluminescence" का चयन करें, और "अगला" क्लिक करें। "DLIT" का चयन करें और "अगला" क्लिक करें। का चयन करें "जुगनू" जांच और "अगला" क्लिक करें। "माउस" छवि विषय है, "ऑटो" जोखिम पैरामीटर, "C-13 सेमी" देखने के क्षेत्र, और "0.5 सेमी" विषय ऊंचाई का चयन करें, और "अगला" क्लिक करें। इमेजिंग शुरू करने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें।
  8. बाद छवि हासिल कर ली है, "DLIT 3D पुनर्निर्माण" टैब का चयन करें और "विश्लेषण" टैब पर क्लिक करें और "पुनर्निर्माण" 3 डी पुनर्निर्माण छवि को उत्पन्न करने के लिए।
  9. "उपकरण" और "3 डी एनीमेशन" पर क्लिक करें। 3 डी एनीमेशन विंडो में "वाई अक्ष पर स्पिन सीसीडब्ल्यू" का चयन करें। एक .mov स्वरूप फ़ाइल में "रिकार्ड" और "सहेजें" पर क्लिक करें।

6. पूर्व विवो फ्लोरोसेंट इमेजिंग

  1. ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों बलिदान जबकि anesthetized, या 4 में संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार - तिल्ली इंजेक्शन के बाद 6 सप्ताह।
  2. जिगर हार्वेस्ट। सही दिशा बाएं से एक क्षैतिज चीरा। एक पिक के साथ जिफाएडा प्रक्रिया हथियाने, दात्राकार, यकृत नस, और अवर रग Cava काटना।
    1. सही hepatorenal बंधन, hepatoduodenal बंधन, और छोड़ दिया hepatorenal बंध काटना, ख्याल रख रही है, जबकि hepatoduodenal बंध विदारक पूंछवाला लोब को चोट पहुंचाना नहीं। जिगर की कटाई के बाद, पित्ताशय की थैली को हटाने के रूप में इस autofluorescence प्रदर्शित करेगा। किसी भी अतिरिक्त अतिरिक्त जिगर वर्तमान ट्यूमर के नोट करें।
  3. macroscopically वर्तमान संख्या और जिगर ट्यूमर के आकार को ध्यान में रखना, और DPBS में काटा यकृत जगह है।
    नोट: ट्यूमर macroscopically नंगी आंखों से दिखाई दे रहे हैंसफेद ट्यूमर के रूप में (एक प्रतिनिधि उदाहरण के लिए, चित्रा 4 देखें)।
  4. इमेजिंग चादर पर नियुक्ति करने से पहले, प्रत्येक जिगर लेने के लिए और धीरे से एक कागज तौलिया पर सोख्ता द्वारा अतिरिक्त तरल हटा दें।
  5. IVIS का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूमर कॉलोनी से फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने।
    1. "प्रतिदीप्ति", "4 सेकंड" जोखिम समय, "मध्यम" binning, "2" एफ / बंद करो, "535" उत्तेजना फिल्टर, और "580" उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें। इमेजिंग शुरू करने के लिए "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें।
    2. छवि प्राप्त करने के बाद, छवि खिड़की और उपकरण पट्टी लगाने। "रॉय उपकरण" क्लिक करें और चक्र चिह्न से "1" का चयन करें। ROIs छवि पर अलग-अलग ट्यूमर कालोनियों के संकेत क्षेत्र को परिभाषित करने, चक्र, और फिर उज्ज्वल दक्षता के एक मनमाना इकाई के रूप में क्लिक करें रॉय के "माप" ((फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) / (μW / 2 सेमी) )। पृष्ठभूमि की एक अतिरिक्त लागत पर लाभ चक्र है सुनिश्चित करें।
    3. यह एक क्षेत्र होने के लिए संभालने के द्वारा कुल ट्यूमर मात्रा की गणना। ट्यूमर मात्रा = 4 एक्स π XR 3/3 (आर = त्रिज्या)। जिगर की कोशिकाओं की संख्या splenically इंजेक्शन से विभाजित में ट्यूमर की संख्या के रूप में ट्यूमर कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (एफसी) के अंश की गणना।
    4. 3.3 कदम से रैखिक सन्निकटन से कॉलोनी के अनुसार कुल सेल नंबर (= एक्स) की गणना। कोशिका विभाजन (= वाई) की संख्या की गणना वाई = लॉग इन कर के रूप में 2 एक्स और TD टीडी (दिन) = 28 / वाई के रूप में

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Representative Results

इस प्रयोग के लक्ष्य में विवो metastatic ट्यूमर बोझ के धारावाहिक मात्रा का ठहराव के लिए और बस्तियां आवृत्ति और जिगर metastases के विकास के विकास कैनेटीक्स के आकलन के लिए क्षमता के साथ एक सुसंगत और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पशु मॉडल स्थापित करने के लिए किया गया था। 2-6 आंकड़े, किंवदंतियों के साथ, एक क्रिएटिव कॉमन्स CC-BY लाइसेंस 10 के तहत हमारे पिछले प्रकाशन से प्रदान की जाती हैं।

डबल लेबल ट्यूमर कोशिका Monoclones की पीढ़ी

सबसे पहले, luminescent और fluorescently लेबल मोनोक्लोनल सेल लाइनों के एक पैनल के विभिन्न मेटास्टेटिक क्षमताओं के साथ उत्पन्न किया गया था। माता पिता का HCT116 कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में (Luc2) luminescent के सफल अभिकर्मक और फ्लोरोसेंट (tdTomato) प्रोटीन के बाद, 16 डबल लेबल monoclones पैतृक HCT1 गिराए द्वारा उत्पन्न किया गया1 सेल / 96 अच्छी तरह से प्लेट में 200 μL करने के लिए 16-L2T कोशिकाओं (चित्रा 1) 10। इन विट्रो प्रतिदीप्ति और HCT116-L2T की चमक रहा था तो विवो और पूर्व में से ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या में अनुमान लगाने के लिए कोशिकाओं की एक बढ़ती हुई राशि का उपयोग मात्रा विवो जिगर ट्यूमर इमेजिंग (चित्रा 2) 10।

मेटास्टेसिस विकास विभेदक लिवर औपनिवेशीकरण के साथ क्लोन द्वारा

अगले, यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए, 16 पहले से उत्पन्न व्यक्ति HCT116-L2T क्लोन intrasplenically चूहों में इंजेक्शन थे; एक splenectomy तो प्रदर्शन किया गया था। जिगर metastases के विकास के साप्ताहिक में विवो bioluminescent इमेजिंग द्वारा नजर रखी थी, चूहों का त्याग करने के बाद पूर्व vivo फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा पीछा किया। उत्पन्न 16 monoclones से बाहर, हम उनके घ के कारण P1, P2, O1, और O2, के रूप में नामित क्लोन से चयनितifferent जिगर में बसाना और विकास क्षमताओं मनाया। क्लोन O1 और O2 एक छोटे ट्यूमर बोझ था, का प्रतिनिधित्व "oligometastatic" क्लोन, और संभवतः सीमित मेटास्टेटिक रोग का एक लक्षण प्रारूप recapitulating। क्लोन P1 और P2 एक बड़ा ट्यूमर बोझ था, व्यापक प्रचार-प्रसार, जो भी रूप में polymetastatic रोग में जाना जाता है का प्रतिनिधित्व। Bioluminescence P1 और P2 चूहों (6.7 × 10 6 ± 4.7 × 10 6 और 3.6 × 10 6 ± 2.5 × 10 6 फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) O1 और O2 चूहों की तुलना में (2.0 × में अधिक था 10 5 ± 1.3 × 10 5 और 1.7 × 10 5 ± 9.1 × 10 4 फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) तिल्ली इंजेक्शन (चित्रा 3 ए, बी) 10 के बाद 3 सप्ताह। तिल्ली इंजेक्शन के बाद 4 सप्ताह में यकृत के पूर्व vivo प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव दिखा दिया है कि P1 और P2 यकृत उच्च fluores थाप्रतिशत तीव्रता O1 और O2 यकृत (चित्रा -3 सी) के साथ तुलना। पूर्व vivo फ्लोरोसेंट छवियों में ट्यूमर वितरण स्थूल निष्कर्षों (चित्रा -3 सी, डी) 10 के साथ संगत कर रहे थे।

व्यक्तिगत क्लोन का औपनिवेशीकरण और विकास कैनेटीक्स

संख्या और macroscopically कल्पना कर ट्यूमर के आकार में गिना और प्रत्येक व्यक्ति के जिगर में मापा गया। इसके अलावा, पूर्व vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रत्येक monoclone (चित्रा 4) 10 के लिए प्रत्येक व्यक्ति के ट्यूमर कॉलोनी पर किया गया था। P2, O1, और O2 की तुलना में पी 1 में ट्यूमर की कुल संख्या अधिक थी, जबकि ट्यूमर के आकार P1, O1 में से p2 में बड़ा था, और O2 (पी <0.001, चित्रा 5 ए, बी) 10। हालांकि, P1 और P2 में जिगर में कुल ट्यूमर मात्रा बड़ा O1 और O2 की तुलना में था (चित्रा 5C) 5 ± - - 5, 6.0 × 10 - 6 ± 2.3 × 10 - 6 P1 और O1 में, क्रमश: इस प्रकार, P1 एक बढ़ाया जिगर उपनिवेश स्थापित करने की क्षमता है जब अन्य क्लोन (एफसी = 8.2 × 10 की तुलना में था पी <0.001, चित्रा 5 डी) 10। हालांकि P2 एक समान रूप क्लोन O1 और O2 जिगर उपनिवेश स्थापित करने की क्षमता थी, उत्पन्न ट्यूमर के आकार को अन्य क्लोन से बड़ा था। ट्यूमर कॉलोनी, टीडी, और कोशिका विभाजन की संख्या प्रति कोशिकाओं की कुल संख्या पहले से जनरल अंशांकन का उपयोग करके इस डेटा से गणना की जा सकती है(- जी आंकड़े 2 और 5E) 10 फ्लोरोसेंट तीव्रता और कोशिकाओं की संख्या के बीच के संबंध से erated। P1, जो जिगर में कई छोटे ट्यूमर उत्पन्न के रूप में स्थूल दृश्य निरीक्षण के द्वारा देखा, एक बड़े एफसी था, हालांकि यह एक टीडी O1 और O2 (पी <0.05) के लिए इसी तरह की थी। P2, जो स्थूल बड़े ट्यूमर का एक सीमित संख्या में उत्पन्न, एक समान एफसी लेकिन O1 और O2 (पी <0.05) की तुलना में एक छोटा टीडी था। साथ में ले ली, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एफसी और TD metastatic क्षमता के लिए योगदान दे दो प्रमुख मानकों हैं।

जिगर में मेटास्टेटिक ट्यूमर के 3 डी वितरण DLIT (चित्रा 6) 10 द्वारा प्रदर्शन किया गया। इस इमेजिंग तकनीक का उपयोग करना, यह पता लगाने के लिए और व्यक्तिगत यकृत मेटास्टेटिक कालोनियों के bioluminescence की माप द्वारा मेटास्टेसिस के स्थानिक अस्थायी गतिशील व्यवहार पर नजर रखने के लिए संभव है।

डेटा मानक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था उत्पन्न, और त्रुटि सलाखों के मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रदर्शन किया गया। पियर्सन के सहसंबंध गुणांक मापदंडों के बीच संघों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। पी मूल्यों 2 पूंछ छात्र के टी-परीक्षण, एक का उपयोग कर पी <0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना के साथ मूल्यांकन किया गया।

आकृति 1
चित्रा 1:। लेबल HCT116 प्रकोष्ठों के Monoclones के एक पैनल की पीढ़ी (ए) पैतृक HCT116 कोशिकाओं luciferase और tdTomato के साथ लेबल के लिए आगे बढ़ें। (बी) 1 सेल / 200 μL करने के लिए माता पिता का HCT116 कोशिकाओं पतला। (सी) प्लेट एक 96 अच्छी तरह से थाली में कमजोर पड़ने के 200 μL। (डी) monoclo बढ़ो96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से एनईएस। (ई) चूहों में intrasplenically monoclones इंजेक्षन जिगर metastases उत्पन्न करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट तीव्रताओं द्वारा कोशिकाओं की संख्या का आकलन (ए) एक 96 अच्छी तरह से थाली में triplicated कोशिकाओं के विभिन्न संख्या के luminescent छवि।। (बी) कोशिकाओं की संख्या और luminescence (आर = 0.99, पी <0.0001) के बीच संबंध। पैमाने पर पट्टी luminescent तीव्रता (फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) एक 96 अच्छी तरह से थाली में triplicated कोशिकाओं के विभिन्न संख्या के फ्लोरोसेंट छवि। हम तीव्रताएक 535 एनएम उत्तेजना और 580 एनएम उत्सर्जन के साथ उज्ज्वल क्षमता के रूप में प्राप्त कर रहे हैं। (डी) कोशिकाओं की संख्या और प्रतिदीप्ति (आर = 0.99, पी <0.0001) के बीच संबंध। पैमाने पर पट्टी उज्ज्वल दक्षता के एक मनमाना इकाई में फ्लोरोसेंट तीव्रता ((फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) / (μW / 2 सेमी)) का प्रतिनिधित्व करता है। अनुमति के 10 के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Bioluminescence और ई एक्स विवो चुने क्लोन में जिगर की प्रतिदीप्ति (ए) प्रतिनिधि bioluminescent छवियों।। पैमाने पर पट्टी luminescent int का प्रतिनिधित्व करता हैensity (फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian)। P1 और P2 में 3 सप्ताह है, और 1 - - O1 और O2 में 4 सप्ताह (बी) Bioluminescence 1 से साप्ताहिक मापा। डेटा मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे थे। (सी) प्रतिनिधि पूर्व vivo यकृत के फ्लोरोसेंट छवियों। तीव्रता एक 535 एनएम उत्तेजना और 580 एनएम उत्सर्जन के साथ उज्ज्वल क्षमता के रूप में हासिल किया गया। पैमाने पर पट्टी उज्ज्वल दक्षता के एक मनमाना इकाई में फ्लोरोसेंट तीव्रता ((फोटॉनों / एस / 2 सेमी / steradian) / (μW / 2 सेमी)) का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) Macroscopic जिगर छवियों (तीर छोटे सफेद ट्यूमर संकेत मिलता है)। P1 और P2: polymetastatic क्लोन, O1 और O2: oligometastatic क्लोन। अनुमति के 10 के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4:। व्यक्तिगत लिवर कालोनियों के फ्लोरोसेंट तीव्रता के मात्रा बाईं तरफ छवियाँ प्रतिनिधि स्थूल निष्कर्षों और सही पर चित्र हैं प्रत्येक क्लोन में फ्लोरोसेंट तीव्रता हैं। फ्लोरोसेंट तीव्रता एक 535 एनएम उत्तेजना और 580 एनएम उत्सर्जन के साथ उज्ज्वल क्षमता के रूप में हासिल किया गया। P1 और P2: polymetastatic क्लोन, O1 और O2: oligometastatic क्लोन। अनुमति के 10 के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। बस्तियां की क्षमता और विकास कैनेटीक्स के मात्रात्मक आकलन ( (बी) के अलग-अलग ट्यूमर के स्थूल आकार, (सी) की गणना जिगर में कुल ट्यूमर मात्रा (डी) ट्यूमर कॉलोनी बनाने कोशिकाओं की (एफसी बस्तियां अंश), (ई) कुल सेल नंबर कॉलोनी के अनुसार, (एफ) दुगनी होने का समय (टीडी), और (छ) प्रत्येक क्लोन की कोशिका विभाजन की संख्या। P1 और P2: polymetastatic क्लोन, O1 और O2: oligometastatic क्लोन। डेटा सभी आंकड़ा पैनलों में जो त्रुटि सलाखों दिखाया गया के लिए मानक विचलन ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे थे। अनुमति के 10 के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: Quantificatiफैलाना Luminescent इमेजिंग टोमोग्राफी (DLIT)। (ए) 3 डी उपरि दृश्य का उपयोग व्यक्तिगत ट्यूमर कालोनियों के bioluminescence की पर। पैमाने पर पट्टी उज्ज्वल दक्षता के एक मनमाना इकाई में फ्लोरोसेंट तीव्रता का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) कोरोनल अनुभाग। (सी) बाण के अनुभाग। (डी) Transaxial अनुभाग। (ई) जिगर के macroscopic छवि। (एफ) पूर्व vivo जिगर के फ्लोरोसेंट छवि। अनुमति के 10 के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान रिपोर्ट में प्रस्तुत पशु मॉडल दो प्रमुख दृष्टिकोण पर आधारित है। सबसे पहले, क्रम में विभिन्न प्रवृत्तियों के साथ मेटास्टेटिक क्लोन निरीक्षण करने के उपनिवेश और जिगर में पैदा करने की क्षमता सुनिश्चित करने के लिए बेहद विषम मोनोक्लोनल सेल लाइनों के एक पैनल स्थापित किया गया था, बल्कि एक स्थापित unfractionated कैंसर कोशिका लाइन 12,13 से अधिक है। मेटास्टेसिस विकास के लिए मोनोक्लोनल दृष्टिकोण हाल जीनोमिक डेटा 14 से जायज है और सफलतापूर्वक मेटास्टेटिक प्रक्रिया 10,15,16 मॉडल करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया था। दूसरा, luciferase और tdTomato मार्कर द्वारा पैतृक सेल लाइन की डबल लेबलिंग आदेश विवो और पूर्व vivo दोनों मेटास्टेटिक विकास का बढ़ाया विश्लेषण प्रदान करने के लिए शामिल किया गया था। luminescent और फ्लोरोसेंट लेबलिंग एक विस्तृत शारीरिक परीक्षा और दोनों metastatic ट्यूमर की राशि के संभावित मात्रा का ठहराव (आवृत्ति या जिगर colonizatio की प्रभावकारिता के रूप में माना जाता है के लिए अनुमति देता हैएन) और किसी भी व्यक्ति कॉलोनी के आकार। उत्तरार्द्ध आसानी से एक सरल अंशांकन प्रक्रिया चरण 2 में वर्णित का उपयोग कोशिकाओं की एक वास्तविक संख्या के लिए परिवर्तित किया जा सकता है और 2 से 10 और 10 के आंकड़े 4। इस डेटा का उपयोग करना, यह जिगर में प्रत्येक मेटास्टेटिक नोड के लिए TD अनुमान लगाने के लिए और प्रत्येक प्रारंभिक monoclone इंजेक्शन (चित्रा 5) 10 के लिए जिगर metastases के विकास कैनेटीक्स का मूल्यांकन करने के लिए संभव है।

तीन अलग अलग कोलोरेक्टल मेटास्टेटिक phenotypes इस प्रायोगिक प्रणाली, P1, P2, और O1 / O2 के रूप में नामित में मनाया गया। ये मेटास्टेटिक phenotypes मतभेद जब प्रत्येक मेटास्टेटिक क्लोन के लिए बसाना और स्थानीय विकास दर की आवृत्ति के आंकड़ों की तुलना। पहले मेटास्टेटिक phenotype, P1, एक बढ़ाया जिगर लेकिन एक अपेक्षाकृत कम स्थानीय विकास दर उपनिवेश स्थापित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया, जिगर भर में कई छोटे metastatic ट्यूमर के लिए इसी। दूसरी मेटास्टेटिक phenotype, P2, थाउपनिवेशवाद का एक कम आवृत्ति लेकिन एक काफी अधिक स्थानीय विकास दर, बड़े माध्यमिक ट्यूमर की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या में जिसके परिणामस्वरूप। अन्त में, तीसरे मेटास्टेटिक phenotype, O1 और O2, उपनिवेशवाद और धीमी गति से स्थानीय विकास दर के एक कम आवृत्ति दोनों का प्रदर्शन किया। यह तीसरा मेटास्टेटिक phenotype नैदानिक oligometastatic जिगर की बीमारी (आंकड़े 3 10 और 5 से 10) का प्रतिनिधित्व के रूप में माना जा सकता है। इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण इन क्लोन अभिव्यक्ति पैटर्न में 10 की पहचान की महत्वपूर्ण मतभेद की तुलना। उदाहरण के लिए, जब O1 और O2 क्लोन के साथ P1 की तुलना में, वहाँ 756 विभिन्न व्यक्त जीनों भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और इंटरफेरॉन संकेतन में शामिल जीनों के एक सबसेट शामिल थे। इस अध्ययन, साथ ही दूसरों को, ट्यूमर के विकास और अस्तित्व के 21, 22 में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है में इन जीनों फंसा दिया है। इसके अतिरिक्त, जब O1 और O2 के लिए p2 की तुलना में, वहाँ 461 विभिन्न स्पष्ट थेडी जीन, सेलुलर के विकास और प्रसार ERK1 / 2 सिगनल के माध्यम से मध्यस्थता के लिए महत्वपूर्ण जीन से जुड़े एक सबसेट के साथ।

मेटास्टेटिक इस प्रयोगात्मक मॉडल द्वारा उत्पादित phenotypes की विविधता मेटास्टेटिक विविधता के मनाया नैदानिक ​​अभ्यावेदन के साथ संगत है। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि जिगर metastases के आकार (विकास की संभावनाओं से संबंधित एक पैरामीटर) और उनकी संख्या (उपनिवेशवाद की क्षमता से संबंधित एक पैरामीटर) दूर मेटास्टेसिस 1 के लिए स्वतंत्र जोखिम कारक हैं। बढ़ाया विकास क्षमता या उपनिवेशवाद क्षमता के साथ, गुण P1 और P2 में मनाया इन आंकड़ों के साथ संगत कर रहे हैं। इसके अलावा, stereotactic शरीर रेडियो थेरेपी (SBRT) के साथ या शल्य चिकित्सा resected फेफड़ों मेटास्टेसिस के साथ इलाज के रोगियों के हाल ही में टिप्पणियों ट्यूमर की संख्या और कुल मिलाकर का निर्धारण महत्वपूर्ण कारक है और रोग मुक्त परिणामों 17,18 के रूप में प्रगति की दर करने के लिए दोनों इशारा करते हैं। इस प्रकार, उपनिवेशवाद और विकास क्षमताओं के लिए लगता हैदूर साइटों 19,20 पर मेटास्टेटिक क्लोन के विकास को निर्धारित करने में सबसे महत्वपूर्ण कारकों के बीच हो। प्रायोगिक मॉडल है, जो मेटास्टेटिक क्लोन के इन गुणों के आधार पर कर रहे हैं, मेटास्टेसिस विकास के तंत्र को समझने के लिए उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकता है, साथ ही जिगर मेटास्टेटिक रोग के इलाज के लिए नए इलाज के तौर तरीकों का परीक्षण करने के लिए एक साधन प्रदान करते हैं।

जबकि एक ओर्थोटोपिक मॉडल सहज मेटास्टेसिस के उत्पादन में सक्षम आदर्श है, वहाँ आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और लगातार सहज मॉडलों की कमी बनी हुई है। Intracecal आरोपण या इंजेक्शन के उपयोग के मॉडल में वर्णित किया गया है, वे तेज और मेटास्टेसिस गठन 23-26 की चर दर का प्रदर्शन किया। अन्य तरीकों यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए intrasplenic या intraportal इंजेक्शन द्वारा एक अस्थानिक आरोपण दृष्टिकोण का उपयोग किया है। इंजेक्शन के समग्र तकनीक ही है, वहीं मॉडल यहाँ प्रस्तुत अंडर्स करने के लिए एक संवेदनशील दृष्टिकोण प्रदान करता हैमेटास्टेसिस विकास के तंत्र tanding, घूम ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) के स्तर से शुरू। संवेदनशीलता और हमारे दृष्टिकोण के reproducibility सेल लाइनों की डबल लेबलिंग से निर्धारित होता है मेटास्टेटिक प्रक्रिया की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए दोनों bioluminescent और फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए। luminescent और फ्लोरोसेंट डेटा से मेटास्टेटिक बोझ यों करने की क्षमता के कारण, यह योजनाबद्ध तरीके से मापने के लिए और समय के साथ मेटास्टेसिस के विकास कैनेटीक्स ट्रैक करने के लिए संभव है। हालांकि इस तरह के अल्ट्रासाउंड आधारित इमेजिंग के रूप में वैकल्पिक तरीकों, इस्तेमाल किया गया है, इन तौर तरीकों संभावित वृद्धि हुई अंतर उपयोगकर्ता के साथ 27 परिवर्तनशीलता, बहुत अधिक उपयोगकर्ता पर निर्भर कर रहे हैं। इसके अलावा, मोनोक्लोनल सेल लाइनों के एक पैनल उत्पन्न करके, हम मेटास्टेटिक रोग नैदानिक ​​सेटिंग में देखा की परिवर्तनशीलता बेहतर मॉडल के क्रम में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विशिष्ट मेटास्टेटिक phenotypes प्रदान करने में सक्षम हैं।

इस प्रयोगात्मक तकनीक के माहिर, वहींविशेष रूप से इन विवो माउस मॉडल (चरण 4 देखें) के लिए intrasplenic इंजेक्शन, वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। ध्यान से, प्लीहा इंजेक्शन प्रदर्शन के रूप में तिल्ली का एक अपर्याप्त इंजेक्शन गरीब परिणामों में हो सकता है, मॉडल का सबसे महत्वपूर्ण भाग है। इंजेक्शन, या रिसाव microclip की अनुपयुक्त स्थान की वजह से कोशिकाओं के दौरान रिसाव, यकृत मेटास्टेसिस और / या अतिरिक्त जिगर ट्यूमर या पेरिटोनियल carcinomatoses का एक महत्वपूर्ण राशि के एक कम संख्या में हो सकता है। इसके अलावा, यह ट्यूमर कोशिकाओं को धीरे धीरे आदेश intrasplenic के दबाव में वृद्धि हुई है, जो आसन्न ऊतकों को कोशिकाओं के विकास की परिस्त्राव को जन्म दे सकती से बचने के लिए, कम से कम के रूप में लंबे समय के प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में के लिए, इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है तिल्ली विच्छेदन के स्टंप के आसपास अतिरिक्त लिवर ट्यूमर।

अन्त में, 4.3 चरण में, वहाँ प्लीहा इंजेक्शन (1.2 के लिए दिया कोशिकाओं की एक सीमा है - 2 × 10 6 </ Sup> कोशिकाओं)। इस श्रृंखला के प्रयोजन के लिए इस तकनीक का व्यक्तिगत ऑपरेटरों के लिए खाते में करने के लिए है। यह इंजेक्षन करने के लिए कोशिकाओं का एक इष्टतम संख्या जांच करने के लिए समय लग सकता है। भी कुछ कोशिकाओं इंजेक्शन रहे हैं, यकृत मेटास्टेसिस लगातार विकसित नहीं हो सकता, और भी कई कोशिकाओं को इंजेक्ट कर रहे हैं, तो पोर्टल शिरापरक रोड़ा, हो सकता है जानवर के प्रारंभिक निधन के लिए अग्रणी। यह शुरू में ट्यूमर कोशिकाओं के कई अलग अलग सांद्रता की कोशिश करने के लिए जब आदेश इष्टतम संख्या खोजने के लिए इस मॉडल शुरू विवेकपूर्ण हो सकता है।

प्रस्तुत मॉडल में से एक ख़तरा है कि यह एक जेनोग्राफ्ट दृष्टिकोण पर आधारित है और कारनामे है immunodeficient नग्न चूहों है। एक वैकल्पिक तरीका प्रस्तावित murine कोलोरेक्टल सेल लाइन MC38 की मोनोक्लोनल डेरिवेटिव की एक ऐसी ही पैनल की पीढ़ी है, luciferase और tdTomato के साथ डबल लेबल या EGFP प्रोटीन। ये क्लोन तो मेजबान immu के साथ विकसित जिगर metastases की बातचीत पर कब्जा करने के क्रम में syngeneic पशु मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकताne प्रणाली।

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Acknowledgments

हम Luc2-tdTomato प्लाज्मिड और HCT116 सेल लाइन, श्री Ani सोलंकी (पशु संसाधन केंद्र) चूहों के प्रबंधन के लिए, और डॉ लारा लियोनी सहायता के लिए के लिए डॉ जेफ्री एल ग्रीन (शिकागो विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं DLIT के साथ। फ्लोरोसेंट और luminescent तीव्रता के quantifications एक IVIS स्पेक्ट्रम पर शिकागो विश्वविद्यालय (PerkinElmer, Hopkinton, एमए) पर एकीकृत छोटे पशु इमेजिंग अनुसंधान संसाधन में प्रदर्शन किया गया। इस काम के वर्जीनिया और कैंसर अनुसंधान के लिए डीके लुडविग कोष द्वारा समर्थित किया गया था, फेफड़ों के कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (LCRF), प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन (पीसीएफ), और कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (P30CA014599)। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

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References

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Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).

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