Abstract
肝転移および進行の遅い速度の限られた数の患者が正常局所治療で治療することができる1,2に近づきます。しかし、ほとんどは、肝転移の不均一性については知られており、個々の転移性コロニーの発達を評価することが可能な動物モデルが必要です。ここでは、定量的に肝臓内の個々の腫瘍クローンの開発を可視化し、それらの増殖速度と植民地化効率を推定する機能を提供し肝転移の高度なモデルを提示します。我々は安定してルシフェラーゼおよびtdTomatoと異なる成長特性を有するで標識したHCT116ヒト結腸直腸癌細胞のモノクローナル誘導体のパネルを生成しました。脾臓摘出に続いて脾臓注射で、これらのクローンの大部分は肝転移を生成することができますが、植民地化の異なる周波数及び様々な成長率を持ちます。 in vivoイメージングのSysteを使用して、M（IVIS）は、in vivoでの発光を用いて、転移の発達を可視化し、定量化することが可能であり、ex vivoでの蛍光イメージング。また、拡散発光イメージング断層撮影（DLIT）は、in vivoでの肝転移の3D分布を提供しています。収穫肝臓のex vivo蛍光イメージングは、肝臓のコロニー形成の頻度の評価と成長動力学を考慮して、個々の肝転移コロニーの定量的測定を提供します転移の。モデルは、臨床的に観察された肝転移と同様であるので、肝転移に関連する遺伝子を検出するための、肝臓の転移性疾患のための潜在的な切除またはアジュバント治療を試験するための様式としての役割を果たすことができます。
Introduction
原発性結腸直腸癌（CRC）から肝転移を有する患者は予後不良によって特徴づけられます。 12％の5 -肝転移（IV期）の患者は、わずか8の5年生存率を有するが、88％の3,4 -一次非転移性CRCの5年生存率（ステージは、I - III）75と推定されています、6。しかし、転移性の患者は、転移と異なる再発時間の異なる数を呈する、異種の基を表します。臨床観察は、と（地元の成長率に比例する）任意の単一の転移のサイズ（コロニー形成能力や定着の周波数に比例してもよい）、転移の数が独立した予後因子1,7であることを示しています。言い換えれば、肝臓をコロニー形成、転移性クローンの成功は、2つの主要な特性に依存する：増殖能と肝微小環境に普及し、生き残るために能力を。
デザイン転移性クローンの特性を捕捉し、定量化する能力を持つ成功した臨床モデルで大幅に肝転移生物学の我々の理解を改善し、潜在的な治療アプローチの設計のための効果的なツールを提供することができます。実験的肝転移のモデルは、以前に8,9を報告されているが、それらのいずれも定量的に捉えるおよびin vivoおよびex vivo の両方で個々の転移性クローンのプロパティを記述するための機能を提供しました。
ここでは、異なる肝臓のコロニー形成効率と成長特性を有する腫瘍クローンの生成を含んで肝転移の新しい、先進的なモデルを提示します。我々は、転移能力の本質的な相違を有するモノクローナル細胞株の生成でルシフェラーゼおよびtdTomato蛍光タンパク質で癌細胞の二重標識の組み合わせを用います。この実験モデルでは、データは、開発することを示します肝転移は、コロニー形成頻度の条件および臨床観察と一致する倍加時間（TD）で記述することができます。このモデルの定量的性質は、創薬や診断目的のために、それは容易に採用可能になります。
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Protocol
すべての動物の手順は、シカゴ大学（プロトコール＃72213から09）で施設内動物管理使用委員会によって承認され、無菌条件下で行いました。
1.準備
- HCT116腫瘍細胞の培養のための培地500mlを作る：10％ウシ胎児血清（FBS）、100U / mLのペニシリン、及び100mg / mLのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）。
- 20分間251°Fで4手術用タオル、ガーゼ、二つの小さなAdsonピックアップ、針ドライバ二はさみの対、小クランプ、及び3マイクロクリップ、 - 3などの脾臓注射モデルに使用される器具をオートクレーブ。
- 脾臓注射後の皮下に投与されるように、マウスのため術後麻酔を準備します。マウスあたり0.9の生理食塩水500μLにブプレノルフィンの4μgの - 2を希釈します。
- 腹腔内注射durのためにホタルルシフェリンの150μgの/ 150μLのアリコートを準備生物発光アッセイる。 -20℃で保存し、光から保護します。
ルシフェラーゼ/ tdTomato標識モノクローナル細胞株の2世代10,11
- 10％FBS、100 U / mLのペニシリン、及び100mg / mlストレプトマイシンを含むDMEM中でHCT116ヒト結腸直腸癌細胞及び293FTヒト胚腎臓細胞を解凍し、維持します。 5％CO 2、37℃で培養物中に維持します。
- 高力価のレンチウイルスを生成します。
- D 1に、プレート10 -完全DMEMの18ミリリットル（CDMEM）中の15cmの細胞培養皿に継代3と10との間に12×10 6 293FT細胞を、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％非必須アミノ酸と。 37℃で培養し、5％CO 2。
- D 2で、次のトランスフェクション溶液を用いて細胞をトランスフェクション：
- 各皿については、以下を使用します。ルシフェラーゼ（Luc2）とtdTomatoで挿入pFUGレンチウイルスベクターの37.5μgののDNAの混合物を滅菌H 2 Oの1062μLの合計に再懸濁11（シカゴ大学の博士ジェフリー・グリーンからの贈り物）、pCMVΔ8.7425μgの、およびpMD2.Gの12.5μgのを構築2 MのCaCl 2の188μLを追加します。
- 貫通泡を吹き込みながら、DNA /のCaCl 2溶液、当時のドロップに2倍Hepes緩衝生理食塩水（HBS、50mMのHEPES、1.5mMののNa 2 HPO 4、及び180のNaCl、pHは7.12）の1250μLを追加します。ピペットを用いて溶液。
- 室温で20分間インキュベートし、その後、25μMの最終濃度を作るためにRT CDMEMとクロロキンの15.5 mLを加え。
- 293FT細胞の各ディッシュにメディアを吸引し、トランスフェクション溶液と交換してください。播種した細胞を容易に取り除くように、ゆっくりとトランスフェクション溶液の16 mLを加え。
- D 3に、8後 - タキ再び、16時間、トランスフェクション溶液を除去し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1回細胞を洗浄細胞を除去しないように注意してngの。 10mMのヘペス新鮮なCDMEMの18 mLのメディアを交換してください。
注：ゆっくりと、お皿を移動トランスフェクション溶液を吸引し、細胞を除去しないように、プレートの側壁を介してメディアを追加します。 - D 4に、トランスフェクションの時間から48時間で、細胞を除去しないようにピペットでゆっくりと吸引することにより、食器からメディアを収集します。遠心機で5分間、300×gで収集培地は、大きな細胞片を沈殿させました。
- 50,000×gで4℃で2時間、SW-28ローターを使用して、0.45μmの低タンパク質結合フィルターフラスコと遠心分離機を用いてウイルス上清をフィルタリングします。遠心分離が終了した直後に上清を除去し、ワイパーを有する管の内部を乾燥させます。
- 1％FBSで還元血清培地（RSM）の50μL中のウイルスペレットを再懸濁。アリコートは、将来の使用（ウイルスストック）のために-80℃で保存することができます。
- レンチウイルスを形質導入HCT116細胞へのESとtdTomato陽性クローンのパネルを生成します。
- ウイルス感染前に24ウェルプレート1（d）に1×10 5の密度でHCT116細胞をプレート。
- 1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび8 / mlのポリブレンを持つ：（100希釈1）（CRSM）RSM 4mLに（2.2.7から）再懸濁したウイルスの40μLに希釈します。
- 感染の日に、DPBSで細胞を1回洗浄し、その後、各ウェルにステップ2.3.2から希釈したウイルスの250μLを追加します。 37℃で4時間、5％CO 2のためにインキュベートし、各ウェルにCDMEMの1 mLを加え。 72時間- 48、37℃でインキュベートし、5％CO 2。
- 0.05％トリプシンと0.53 mMのEDTAの1 mLで細胞を再懸濁し、その後、トリプシンを中和するためにCDMEMの1 mLを加え。 4分間300×gで遠心チューブとペレットに細胞を移します。ハンクス平衡塩溶液（HBSS）+ 2％FBS 1 mLにペレット3回洗浄します。
- ステップ2.3.4からペレットを再懸濁FACS緩衝液（2％FBCS、PBS中の2mM EDTA）で1×10 6細胞/ mLの単一細胞懸濁液に。
- PE陽性細胞（：585分の556 nmの励起/発光）のためのゲーティング、セルソーターを使用してソートtdTomato陽性HCT116細胞。親tdTomato陽性HCT116細胞（ 図1A）を生成するために、5％CO 2、37℃で10 cmのディッシュ中で回収された細胞を成長させます。
- 3 0.05％トリプシンの8 mLおよび0.53 mMのEDTAで2.3.6から親tdTomato陽性HCT116細胞を再懸濁 - 5分、その後、トリプシンを中和するためにCDMEMの8 mLを加え。
- 4分間300×gで50 mLチューブ、ペレットに細胞を移します。上清を除去し、CDMEM（ 図1B）で200μLあたり1セルに親tdTomato陽性HCT116細胞を希釈します。
- プレート5％CO 2、37℃（ 図1C）で96ウェルプレート中のウェルあたり単一のセル（希釈の200μL）。
- 5％CO 2、37℃でフラスコ内の個々のモノクローンを成長させます。 （ 図1D）。
細胞数の関数としての蛍光シグナル強度の3キャリブレーション
- 、10 3,0の密度で、現在HCT116-L2Tと呼ばれるトランスフェクトされたHCT116細胞を、プレート2×10 4、3×10 5×10 4、7×10 4、×10 4 9、および図10 5細胞/ウェルの各密度のために三重に96ウェルプレート。
- インキュベーションの5時間後、IVIS 10を用いtdTomato蛍光強度を定量化します。
- ソフトウェアを起動するデスクトップ上の画像ソフトウェアのアイコンをクリックしてください。イメージングシステムを初期化するために、「初期化」ボタンをクリックします。 （数分程度かかります）初期設定が完了したら、「蛍光」、「4秒」の露光時間、「中」ビニング、 "2" F /停止を選択し、「535」励起フィルター、そして「580」発光フィルター。
- イメージングステーション上の96ウェルプレートを置き、撮影を開始するには、「取得」をクリックしてください。画像が取得された後、ツールパレットで「ROIツール」をクリックして、スリットアイコンから12×8を選択します。
- 96ウェルプレートの画像上の信号の領域をカバーし、測定]タブをクリックし、12×8のスリットを作成します。 （2光子/秒/ SR / cm）の平方cmあたりのステラジアンあたりのあたりの光子の単位とROIの測定値のテーブルを持つウィンドウを観察します。
- 細胞数とシグナル強度を表す関数（Y軸）に等しい引数（X軸）との散布図を作成します。蛍光強度の単位に対応する細胞の量を計算する（ 図2）10データ解析ソフトウェアを使用して回帰曲線を計算します。
肝転移の4動物モデル
- HCT116-L2T細胞が70に達すると- 80％の密集度は、脾臓注射に約1時間前にそれらを準備します。 3のための0.53 mMのEDTA中で、0.05％トリプシンを用いて細胞を解離 - 5分、その後CDMEMの等しい量でそれらを中和します。凝集を回避するために、徹底的にピペッティングすることを確認します。
- 自動セルカウンターで細胞を数えます。
- 2×10 6細胞/ 100μL - 1.2の濃度になるように1×DPBSで細胞を再懸濁します。ピペットおよび凝集を回避するために、徹底的に細胞を再懸濁することを確認します。
- 時折チューブでそれらを再懸濁し、注射まで氷上で細胞を保管してください。
- マウスを麻酔する前に、ステップ1.3で説明したブプレノルフィン混合物の500μLを皮下注射することにより、術前の麻酔および流体ボーラスを提供します。痛み（不自由、猫背身長、新郎に失敗し、取り扱う発声）の兆候が解決するまで、一日二回の追加ブプレノルフィン混合物の同じ用量を投与。
- 6〜8週間の麻酔麻酔室の酸素中2％イソフルランで-old雌の無胸腺ヌードマウス。マウスは尾をつまんで麻酔下で完全であることを確認します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。脾臓注射のための個々のノーズコーンに各麻酔マウスを転送します。切開の前に、各マウスは、滅菌外科用ドレープで覆われるべきです。
- ヌードマウスの左脇腹の皮膚を介して外部から見た紫色の領域として脾臓を識別します。顕微解剖ハサミを使用して、ちょうど脾臓上の皮膚に8ミリメートル左側腹部切開を行います。
- 次に、腹壁に持ち上げて、小さな切開を行います。内臓が切開部位から離れるように、腹腔内に空気を許可します。約5ミリメートルに腹壁切開を拡大。
- 静かに綿棒で切開部の周りに圧力を加えることによって、脾臓を公開します。必要に応じて、膵臓の脂肪は優しく男することができます脾臓を傷つけないように露出を支援するためにipulated。
- ゆっくりと露出した脾臓の先端に27 G針を1 mLの注射器を用いた細胞の100μLを注入。外肝腫瘍を回避するために、60秒 - 少なくとも30にわたって、ゆっくり注入します。
- 注入された細胞懸濁液の漏洩を防止するために、注入前の最後に針を取り除くに脾臓にマイクロクリップを配置します。
- 5分間の場所でマイクロクリップを残します。
- 5分注入後、止血のために手持ち焼灼装置を使用して脾臓摘出を行います。前方側から、脾門を解剖。大型船を解剖すると、過度の出血を避けるために、焼灼を使用して、隣接した脂肪組織と血管の近位側を事前に凝固。
注：止血のための方法：は、焼灼を直接出血点を凝固3のために出血点に圧力をかける - 5分、または5-0絹のネクタイと出血点を縫合結紮。 2層に各マウスの側腹部切開を閉じます。まず、単一横ステッチで5-0吸収性編組縫合糸（ 例えば、VICRYL）で腹壁を閉じます。次に、単一横ステッチで再び、4-0非吸収性モノフィラメント縫合糸（ 例えば、プロレン）を用いて皮膚を閉じます。 - すべての手順の間に無菌状態を維持するために、70％のイソプロパノールを噴霧することにより、すべての楽器をきれいにしてください。
注：彼らは麻酔から目覚めながら動物を温めていることを確認します。彼らは歩けるようになると、通常の活動に戻るまで、手術後、全てのマウスを監視します。 5分 - 典型的には、回復時間は約3です。彼らは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻してきたまでは無人の動物を放置しないでください。それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
インビボでの生物発光イメージング5.
- 上で撮影を行います時間をかけて生物発光の変化を測定し、定量化する週単位。
- 麻酔チャンバー内にマウスを置き、酸素中2％イソフルランでそれらを麻酔。マウスは尾をつまんで麻酔下で完全であることを確認します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
- 次に、腹腔内にステップ1.4からホタルルシフェリンprepreparedの150μLで各マウスを注入します。
- イソフルランを投与し、個々のノーズコーンとIVISにマウスを置きます。隣接するマウスに信号を最小化するための間にスペーサーを有する仰臥位でマウスを置きます。 5匹のマウスの最大値は、一度に画像化することができます。
- 測定し、生物発光強度をルシフェリン注射後3分を分析します。
- ステップ3.2.1で説明したようにIVISを初期化した後、「発光」、「1秒」の露光時間、および「中」ビニングを選択します。
- イマジンを開始するには、「取得」ボタンをクリックしてくださいグラム。ルシフェリン注射後に一貫性のある時間（3分）で各撮像を実行することを確認します。
- 画像が取得された後、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。 「ROIツール」をクリックして選択し、 "1"、 "2"、 "3"、 "4"、または "5"サークルアイコンから、撮像されたマウスの数に対応します。
- 、インタレスト（関心領域）の領域を定義するマウスの腹腔内での発光信号の信号領域を一周してから、放射効率の任意の単位としてROIの「測定」をクリックします（（光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）/（μW/ cm 2）で）。背景の追加のROIの円を持っていることを確認してください。
- 4週間目に、注射後と前の動物の犠牲に、個々の腫瘍コロニーの生物発光強度のリアルタイム3D再構成を使用して、腫瘍負荷および分布を評価するためにIVISを用いて、拡散発光イメージング断層撮影法（DLIT）を行います。
- ステップ3.2.1で説明したようにIVISを初期化した後、「イメージングウィザード」、「生物発光」を選択し、「次へ」をクリックします。 「DLIT」を選択し、「次へ」をクリックします。 「ホタル」プローブを選択し、「次へ」をクリックします。 「マウス」の画像の件名、「自動」露光パラメータ、ビューの「C-13センチメートル」フィールド、および「0.5センチメートル「対象の高さを選択し、「次へ」をクリックします。撮影を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。
- 画像が取得された後、「DLIT 3D再構築」タブを選択し、「分析」タブと3D再構成画像を生成するために、「再構築」をクリックします。
- 「ツール」をクリックし、「3Dアニメーション」。 3Dアニメーションウィンドウで、「Y軸上のスピンCCW」を選択します。 MOV形式のファイルに「レコード」と「保存」をクリックしてください。
6. 生体外蛍光イメージング
- 脾臓注射後6週間 - 麻酔、または4での機関のガイドラインに従ってながら頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
- 肝臓を収穫。右脇腹に左から水平方向の切開を行います。ピックアップで剣状突起をつかん、鎌状、肝静脈、および下大静脈を解剖。
- 肝十二指腸間膜を切開しながら、尾状葉を傷つけないように注意しながら、右肝腎靭帯、肝十二指腸間膜、及び左肝腎靭帯を解剖。これは自家蛍光を表示するように肝臓を採取した後、胆嚢を削除します。存在する任意の追加の余分な肝腫瘍をメモします。
- 現在肉眼番号と肝腫瘍の大きさに注意してください、そしてDPBSで収穫された肝臓を配置します。
注：腫瘍は肉眼で肉眼で見えます白腫瘍として（代表例えば、 図4を参照してください）。 - 画像用シート上に配置する前に、各肝臓を取り出し、ペーパータオルでブロッティングにより、過剰な液体を除去します。
- IVISを用いて、各腫瘍コロニーからの蛍光強度を測定します。
- 「蛍光」、「4秒」の露光時間、「中」ビニング、 "2" F /ストップ、「535」励起フィルター、および「580」発光フィルターを選択します。撮影を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。
- 画像を取得した後、画像ウィンドウとツールパレットを探します。 「ROIツール」をクリックして、丸いアイコンから「1」を選択します。 、関心領域を定義する画像上の個々の腫瘍コロニーの信号領域を一周してから、放射効率の任意単位（（光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）/（μW/ cm 2）を通り、ROIの「測定」をクリックします）。背景の追加のROIの円を持っていることを確認してください。
- それは球体であると仮定することにより、総腫瘍体積を計算します。腫瘍の体積= 4×πXR 3月3日 （R =半径）。 splenically注入された細胞の数で割った肝臓内の腫瘍の数のような腫瘍コロニー形成細胞（FC）の割合を計算します。
- ステップ3.3から線形近似からコロニー当たりの総細胞数（= X）を計算します。 Yとしての細胞分裂（= Y）の数を計算する= Tdを（日）= 28 / Yとして2 XおよびTDを記録
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Representative Results
この実験の目的は、in vivoでの転移性腫瘍負荷のシリアル定量化のためと肝転移を開発するのコロニー形成頻度と成長速度の推定のための潜在的と一致し、容易に再現可能な動物モデルを確立することであった。、2-6フィギュア伝説で、クリエイティブ・コモンズのCC-BYライセンスの10の下で私たちの以前の出版物から提供されています。
二重標識された腫瘍細胞の単クローンの生成
まず、発光および蛍光標識されたモノクローナル細胞株のパネルは、異なる転移能力を用いて生成しました。親HCT116結腸直腸癌細胞で成功した発光のトランスフェクション（Luc2）と蛍光（tdTomato）タンパク質に続いて、16二重標識モノクローンは、親HCT1を希釈することによって生成されました1細胞/ 96ウェルプレート中の200μLの16 L2T細胞（ 図1）10。 インビトロ蛍光およびHCT116-L2Tの発光次いで、 インビボおよびエクスビボ での腫瘍細胞の数を推定するために、細胞の増加量を用いて定量しました。肝腫瘍イメージング（ 図2）10 を 体内 。
差動肝植民地化を有するクローンによって転移開発
次に、肝転移を生成するために、16以前に生成された個々のHCT116-L2Tクローンを脾臓内マウスに注射しました。脾臓摘出を実施しました。肝転移の発達、マウスを犠牲にした後にex vivoでの蛍光イメージングに続いて、毎週のin vivo生物発光イメージングによってモニターしました。生成された16単クローンのうち、我々は、それらのDに、P1、P2、O1、及びO2として指定されたクローンを選択しましたifferentは、肝臓におけるコロニー形成および成長能力を観察しました。クローンO1とO2は「oligometastatic」のクローンを表す、より小さな腫瘍負荷を有しており、潜在的に制限された転移性疾患の表現型を反復します。クローンP1およびP2はまた、polymetastatic疾患と呼ばれる広範囲の普及を表す、より大きな腫瘍負荷を持っていました。生物発光は、P1とP2マウス（6.7×10 6±4.7×10 6及び3.6×10 6±2.5×10 6光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）O1とO2マウスと比較して、（2.0×で高かったです10 5±1.3×10 5〜1.7×10 5±9.1×10 4光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）脾臓注射（ 図3A、B）10 3週間後。脾臓注射後4週間での肝臓のex vivo蛍光の定量化は、P1とP2の肝臓がより高い蛍光物質を有していたことを実証しましたO1とO2の肝臓（ 図3C）と比較セント強度。 ex vivoでの蛍光画像での腫瘍分布が肉眼所見（ 図3C、D）10と一致していました。
個々のクローンのコロニー形成と成長カイネティクス
巨視的に可視化腫瘍の数と大きさは、個々の肝臓で計数して測定しました。また、ex vivoでの蛍光イメージングは、各モノクローン（ 図4）10については、それぞれの腫瘍コロニーで行われました。 10; P2、O1及びO2、腫瘍の大きさがP1よりもP2で大きかったが、O1及びO2（ 図5A、B、P <0.001）と比較して、P1における腫瘍の合計数は、より高かったです。 O1とO2と比較しただし、P1及びP2における肝臓中の総腫瘍体積が大きかった（ 図5C）
肝臓における転移性腫瘍の3次元分布をDLIT（ 図6）10によって実証されました。このイメージング技術を使用して、個々の肝転移コロニーの生物発光を検出および測定することによって転移の空間時間的動的挙動を監視することができます。
データは、標準的なデータ分析ソフトウェアを用いて分析した生成され、エラーバーは平均値±標準偏差として示されました。ピアソンの相関係数は、パラメータ間の関連を評価した。P値は、統計的に有意であると考えられてp <0.05で、2-両側スチューデントt検定を用いて評価しました。
図1： 標識HCT116細胞の単クローンのパネルの生成 （A）ルシフェラーゼおよびtdTomatoで標識された親HCT116細胞を成長させます。 （B）1細胞/ 200μLに親HCT116細胞を希釈します。 （C）プレート96ウェルプレート中の希釈の200μL。 （D）monocloグロウ96ウェルプレートの各ウェルからファミコン。 （E）、肝転移を生成するために、脾臓内マウスにモノクローンを注入します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 蛍光強度による細胞の数の推定 （A）を96ウェルプレートに三重細胞の異なる数の発光画像。 （B）細胞の数及び発光（R = 0.99、p <0.0001）との間の相関。スケールバーは発光強度（光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）を表します。 （C）96ウェルプレートに三重セルの異なる数の蛍光画像。私たちの強度再535 nm励起および580 nmの発光に放射効率として取得。 （D）細胞数および蛍光（R = 0.99、p <0.0001）との間の相関。スケールバーは放射効率の任意単位（（光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）/（μW/ cm 2）を）内の蛍光強度を示しています。許可10を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3： 選択されたクローンにおける肝臓の 生物発光とE のxのインビボ 蛍光 （A）の代表的な生物発光画像。スケールバーは、発光int型を表し、ensity（光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）。 P1とP2で3週間、および1 - - O1とO2の4週間（B）生物発光は、1から毎週測定しました。データは、平均±標準偏差として表しました。 （C）代表ex vivoでの肝臓の蛍光画像。強度は、535 nm励起および580 nmの発光に放射効率として取得されました。スケールバーは放射効率の任意単位（（光子/秒/ cm 2で/ステラジアン）/（μW/ cm 2）を）内の蛍光強度を示しています。 （D）巨視的肝画像（矢印は小さな白い腫瘍を示しています）。 P1およびP2：polymetastaticクローン、O1とO2：oligometastaticクローン。許可10を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 個々の肝コロニーの蛍光強度の定量化左の画像は代表的な肉眼所見と右の画像であり、各クローン中の蛍光強度です。蛍光強度は、535 nmの励起および580nmの発光と放射効率として取得されました。 P1およびP2：polymetastaticクローン、O1とO2：oligometastaticクローン。許可10を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： コロニー形成能力と成長動力学の定量評価 （
図6：Quantificati拡散発光イメージング断層撮影（DLIT）。（A）は、3Dオーバーヘッドビューを使用して、個々の腫瘍コロニーの生物発光の上。スケールバーは放射効率の任意の単位での蛍光強度を表します。 （B）の冠状断面。 （C）矢状断面。 （D）横断セクション。 （E）は、肝臓の肉眼像。 （F）は、肝臓のex vivo蛍光画像。許可10を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在のレポートに表示される動物モデルは、二つの主要なアプローチに基づいています。まず、コロニーを形成し、肝臓で増殖するために、異なる傾向と転移性クローンを観察する能力を確保するために、非常に不均一なモノクローナル細胞株のパネルは、むしろ確立未分画の癌細胞株12,13よりも、設立されました。転移の開発に対するモノクローナルアプローチは、最近のゲノム・データ14によって正当化され、正常に転移プロセスの10,15,16をモデル化するために以前に使用されました。第二に、ルシフェラーゼおよびtdTomatoマーカーによって親細胞株の二重標識は、 インビボおよびエキソビボの両方の転移性増殖の増強分析を提供するために設立されました。発光および蛍光標識は、詳細な解剖学的検査および（肝臓colonizatioの周波数または有効性として考え転移性腫瘍の量の両方の潜在的な定量を可能にしますn）と、任意の個々のコロニーの大きさ。後者は、容易に工程2に記載の単純な較正手順を使用して細胞の実際の数に変換され、2 10 4 10を 図ことができます。このデータを使用して、肝臓の各転移ノードに対してTdとを推定し、注入された各初期モノクローン（ 図5）10のための肝転移の増殖速度を評価することができます。
三つの異なる結腸直腸の転移性表現型はP1、P2、及びO1 / O2として指定、この実験系で観察されました。各転移性クローンについてコロニー形成およびローカル成長率の周波数のデータを比較した場合、これらの転移性の表現型が異なっていました。最初の転移性表現型、P1は、肝臓全体に多くの小さな転移性腫瘍に対応し、肝臓が、比較的低いローカル成長率にコロニーを形成する能力の増強を示しました。第二の転移表現型、P2、持っていました植民地化の低い周波数が、大きな二次性腫瘍の比較的少数の結果、有意に高い局所的成長率、。最後に、第三の転移性表現型、O1とO2は、コロニー形成および遅いローカル成長率の低周波数の両方を実証しました。この第三の転移性の表現型は、臨床oligometastatic肝疾患（ 図3〜10及び5〜10）の表現と考えることができます。加えて、これらのクローン10を比較遺伝子発現解析は、発現パターンにおいて有意差を同定しました。 O1とO2クローンとP1を比較した場合たとえば、炎症反応およびインターフェロンシグナル伝達に関与する遺伝子のサブセットを含む、756示差的に発現する遺伝子がありました。この研究だけでなく、他のものは、腫瘍の増殖および生存21、22において重要な役割を再生するには、これらの遺伝子を示唆されている。O1とO2にP2を比較するときに加えて、461示差expresseがありましたERK1 / 2シグナル伝達を介して媒介細胞の成長および増殖に重要な遺伝子を含むサブセットとD遺伝子。
この実験モデルによって生成され、転移性表現型の多様性は、転移性の異質性の観察された臨床的表現と一致しています。例えば、肝転移の大きさ（成長性に関するパラメータ）とその数（コロニー形成能に関連するパラメータ）が遠隔転移1の独立した危険因子であることが示されています。強化された成長の可能性またはコロニー形成能力により、P1およびP2で観察された特性は、これらのデータと一致しています。また、定位ボディラジオ-治療（SBRT）または外科的に切除肺転移で治療された患者の最近の観察は、腫瘍の数と全体的な決定の重要な要因と無病成果17,18として進行の速度の両方を指します。したがって、コロニー形成および成長能力がいるように見えます遠隔部位19,20での転移性クローンの開発を決定する上で最も重要な要素の一つです。転移性クローンのこれらの特性に基づいて実験的なモデルは、転移の発生のメカニズムを理解するための有用なツールを提供し、ならびに肝臓転移性疾患の治癒のための新しい治療法を試験するための手段を提供することができます。
自発的な転移を生成することができる同所性モデルは理想的ですが、簡単に再現可能で一貫性の自発的なモデルの不足が残っています。 intracecal注入または注射を利用するモデルが記載されているが、それらは、取り込みおよび転移形成23-26の可変速度を示しました。他の方法は、肝転移を生成するために、脾臓内または門脈内注入による異所性移植のアプローチを利用しています。注射の全体的な手法は同じであるが、ここで紹介するモデルはアンダーに敏感なアプローチを提供します循環腫瘍細胞（CTC）の段階から、転移の発生のメカニズムをtanding。我々のアプローチの感度および再現性は、転移プロセスのダイナミクスを追跡するために、生物発光および蛍光イメージングの両方を可能にするために、細胞株の二重標識することによって決定されます。発光と蛍光データからの転移性負荷を定量化する能力のために、系統的測定し、経時的に転移の成長速度を追跡することが可能です。超音波ベースのイメージングなどの代替的なアプローチが、使用されてきたが、これらのモダリティは、潜在的に増加し、ユーザ間のばらつき27と、はるかにユーザ依存です。加えて、モノクローナル細胞株のパネルを生成することによって、我々は、より良い臨床設定において見られる転移性疾患の変動をモデル化するために、再現性と異なる転移性の表現型を提供することができます。
この実験技術を習得しながら、in vivoでのマウスモデルのための具体的脾臓内注射（ステップ4を参照）、修正が必要な場合があり、いくつかの重要なステップがあります。注目すべきは、脾臓の注入を行うことが脾臓の不十分な注射は悪い結果をもたらすことができるように、モデルの最も重要な部分です。マイクロクリップの不適切な配置によって引き起こされる注射、または漏洩時の細胞の漏れは、肝転移および/または外肝腫瘍または腹膜carcinomatoses、かなりの量の低い数字になることがあります。また、隣接する組織への細胞との増殖の血管外漏出につながる可能性が脾臓圧力の増加を回避するために、少なくとも限り、プロトコルに記載されるようにするために、ゆっくりと腫瘍細胞を注入することが重要です脾臓解剖の切り株の周りに余分な肝臓腫瘍。
最後に、ステップ4.3で、脾臓注射のために与えられたセルの範囲（1.2がある- 2×10 6の</ SUP>細胞）。この範囲の目的は、この技術の個々の演算子を考慮するためです。これは、注入する細胞の最適な数を較正するために時間がかかる場合があります。あまりにも少数の細胞が注入されている場合は、肝転移は一貫して開発しないことがあり、あまりにも多くの細胞が注入されている場合、門脈閉塞が発生する可能性があり、動物の早期死亡につながります。最適な数を見つけるためにこのモデルを開始するとき、最初に腫瘍細胞のいくつかの異なる濃度を試してするのが賢明かもしれません。
提示モデルの1つの落とし穴は、それが異種移植アプローチに基づいていることであり、免疫不全ヌードマウスを利用している。1つの代替方法を提案ルシフェラーゼおよびtdTomatoで二重標識、ネズミの結腸直腸細胞株MC38のモノクローナル誘導体の同様のパネルの生成でありますまたはEGFPタンパク質。これらのクローンは、ホストIMMUで肝転移を発症の相互作用を捕捉するために、同系の動物モデルにおいて使用することができますneのシステム。
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Acknowledgments
我々はLuc2-tdTomatoプラスミドおよびHCT116細胞株、支援のための氏アニSolanki（動物資源センター）マウス管理のための、および博士ララレオニ博士ジェフリーL.グリーン（シカゴ大学）を感謝したいと思いますDLITと。蛍光および発光強度の定量化は、IVISスペクトラム上のシカゴ大学（パーキンエルマー、ホプキントン、MA）に統合された小動物イメージング研究リソースで行いました。この作品は、がん研究のためのバージニアとDKルートヴィヒ・ファンド、肺癌研究財団（LCRF）、前立腺癌基金（PCF）、およびがんセンターサポート助成金（P30CA014599）によってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In Vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3 mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
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