Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов

doi: 10.3791/54657 Published: November 30, 2016
* These authors contributed equally

Abstract

У больных с ограниченным числом метастазов в печени и медленных темпов прогрессирования можно успешно лечить с местным лечением приближается к 1,2. Тем не менее, мало известно о гетерогенности метастазов в печени, а также на животных моделях, способных оценить развитие отдельных метастатических колоний необходимы. Здесь мы представляем улучшенную модель метастазов в печени, что обеспечивает возможность количественно визуализировать развитие отдельных опухолевых клонов в печени и оценить их кинетики роста и эффективности колонизации. Мы создали панель моноклональных производных HCT116 раковых клеток человека колоректального стабильно меченных люциферазы и tdTomato и обладающих различными свойствами роста. С селезеночной инъекции с последующим спленэктомии, большинство из этих клонов способны генерировать метастазами в печени, но с различными частотами колонизации и различной скоростью роста. Использование Syste В визуализации in vivoм (ИВИС), можно визуализировать и количественно развитие метастаз с люминесцентными в естественных условиях и исключая виво флуоресцентных изображений. Кроме того, Диффузный Люминесцентные визуализации томография (DLIT) обеспечивает 3D распределение метастазов в печени в естественных условиях. Ex естественных условиях флуоресцентной визуализации добываемых печени обеспечивает количественные измерения отдельных печеночных метастатических колоний, что позволяет для оценки частоты колонизации печени и кинетики роста метастазов. Так как модель аналогична клинически наблюдаемых метастазов в печень, он может служить в качестве механизма для выявления генов, связанных с метастазами печени, а также для тестирования потенциальных абляционные или вспомогательной терапии для лечения болезни печени метастазами.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

У больных с метастазами в печень от первичных колоректального рака (КПР) характеризуются неблагоприятным прогнозом. Уровень 5-летней выживаемости для первичных неметастатическим CRC (этапы I - III) оценивается в 75 - 88% 3,4, в то время как у пациентов с метастазами в печени (стадия IV) имеют 5-летняя выживаемость составляет всего 8 - 12% 5 , 6. Тем не менее, у пациентов с метастазами представляют собой разнородную группу, представляя с различным числом метастазов и рецидивов разное время. Клинические наблюдения показывают , что количество метастазов (которое может быть пропорционально колонизируя способности или частоты колонизации) и размер любого отдельного метастаз (пропорциональной локальной скорости роста) являются независимыми прогностическими факторами 1,7. Другими словами, успех метастатических клонов колонизаторов печени зависит от двух основных свойств: их способность расти и их способность распространять и выживать в микросреде печени.

Дизайниз успешных клинических моделей с возможностью захвата и количественной оценки свойств метастатических клонов может существенно улучшить наше понимание печени метастаз биологии и обеспечить эффективный инструмент для разработки потенциальных терапевтических подходов. Модели экспериментальной метастазов в печени были ранее сообщалось 8,9, но ни один из них предоставил возможность количественно фиксировать и описывать свойства отдельных метастатических клонов , как в естественных условиях и бывших естественных условиях.

Здесь мы представляем новую, современную модель метастаз печени, которая включает генерацию опухолевых клонов с различной эффективностью колонизация печени и ростовые свойства. Мы использовали сочетание двойного мечения раковых клеток с люциферазы и tdTomato флуоресцентного белка с поколением моноклональных клеточных линий, которые имеют внутренние различия в метастатической способности. В этой экспериментальной модели, данные показывают, что развитиеметастазы в печень могут быть описаны в терминах частоты колонизацию и время удвоения (Td), что согласуется с клиническими наблюдениями. Количественный характер этой модели делает его легко оптимизируется для открытия новых лекарств и диагностических целей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры на животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в Университете Чикаго (Протокол № 72213-09) с помощью и осуществляется в стерильных условиях.

1. Подготовка

  1. Сделать 500 мл среды для культуры НСТ116 опухолевых клеток: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина.
  2. Автоклава инструменты, которые будут использоваться для модели инъекции селезенке, в том числе 3 - 4 хирургические полотенца, марля, два маленьких Адсон пикапов, водитель иглы, две пары ножниц, небольшой зажим и 3 microclips, при 251 ° F в течение 20 минут ,
  3. Готовят послеоперационной анестезии для мышей, чтобы вводить подкожно после инъекции селезенке. Развести 2 - 4 мкг бупренорфина в 500 мкл 0,9 физиологического раствора на мышь.
  4. Подготовить аликвот 150 мкг / 150 мкл светляков люциферин для внутрибрюшинные инъекции DurИНГ биолюминесценции анализы. Хранить при температуре -20 ° C и защищать от света.

2. Генерация люциферазы / tdTomato-меченых моноклональных клеточных линий 10,11

  1. Оттепель и поддерживать НСТ116 человека клеток колоректального рака и 293FT эмбриональные клетки почки человека в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Поддерживать в культуре на уровне 5% CO 2 и 37 ° С.
  2. Продукция высокого титра лентивирус.
    1. На D 1, пластина 10 - 12 х 10 6 293FT клеток между прохождением 3 и 10 в 15 см чашки для культивирования клеток в 18 мл полной DMEM (cDMEM) с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% заменимых аминокислот , Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
    2. На D 2, трансфекции клеток с использованием следующего раствора для трансфекции:
      1. Для каждого блюда, используйте следующее: ДНК-смесь 37,5 мкг лентивирусов вектора pFUG вставленной с люциферазы (Luc2) и tdTomatoстроит 11 (подарок от доктора Джеффри Грин в Университете Чикаго), 25 мкг pCMVΔ8.74 и 12,5 мкг pMD2.G ресуспендировали в общей сложности 1,062 мкл стерильной H 2 O. Добавьте 188 мкл 2 М CaCl 2.
      2. Добавить 1 250 мкл 2x Hepes-буферном солевом растворе (HBS, 50 мМ Hepes, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, и 180 мМ NaCl, рН 7,12) к раствору ДНК / CaCl 2, капля за один раз, в то время как мыльные пузыри через раствор пипеткой.
      3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем добавляют 15,5 мл RT cDMEM и хлорохин, чтобы получить конечную концентрацию 25 мкМ.
    3. Аспирируйте СМИ в каждом блюде из 293FT клеток и заменить раствором трансфекции. Добавить 16 мл трансфекционную раствора медленно, как нанесенное клетки легко смещать.
    4. На D 3, после того, как 8 - 16 ч, удалить раствор Трансфекция и промыть клетки один раз с Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (ДЗФР), опять такинг осторожность, чтобы не сместить клетки. Заменить носитель с 18 мл свежего cDMEM с 10 мМ Hepes.
      Примечание: Медленно перемещайте блюда, аспирация решение трансфекции, а также добавить носитель через боковую стенку пластин так, чтобы не вытеснить клетки.
    5. На D 4, в 48 ч с момента трансфекции, собирают материал из блюд, медленно аспирационных с пипеткой, чтобы не вытеснить клетки. Центрифуга собранные средства массовой информации при 300 мкг в течение 5 мин для осаждения большой остатков клеток.
    6. Фильтр вирусный супернатант использованием 0,45 мкм с низким содержанием белка связывающего Фильтровальная колба и центрифугу с использованием SW-28 ротор в течение 2 ч при 50000 х г и 4 ° С. Слейте супернатант сразу после того, как центрифугирование отделок и высушить внутреннюю часть трубы с стеклоочистителей.
    7. Ресуспендируют вирусный осадок в 50 мкл Сниженная сыворотки среды (RSM) с 1% FBS. Аликвоты можно хранить при температуре -80 ° С для последующего использования (вирусный штамм).
  3. Трансдукции лентивирусовэс в HCT116 клеток и создать группу tdTomato-положительных клонов.
    1. Пластина клеток НСТ116 при плотности 1 х 10 5 в 24 - луночные планшеты 1 г до вирусной инфекции.
    2. Развести 40 мкл ресуспендированной вируса (от 2.2.7) в 4 мл RSM (разведение 1: 100) с 1% пенициллина / стрептомицина и 8 мкг / мл полибрена (CRSM).
    3. В день инфекции, мыть клетки один раз с ДЗФР, а затем добавляют 250 мкл разбавленного вируса из стадии 2.3.2 в каждую лунку. Выдержите в течение 4 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2, а затем добавляют 1 мл cDMEM в каждую лунку; инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 48 - 72 ч.
    4. Ресуспендируют клеток в 1 мл 0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА, а затем добавляют 1 мл cDMEM для нейтрализации трипсина. Передача клетки микроцентрифужных трубки и гранулы при 300 мкг в течение 4 мин. Вымойте гранул 3 раза в 1 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) плюс 2% FBS.
    5. Ресуспендируют осадок со стадии 2.3.4с FACS буфером (2% FBCS и 2 мМ ЭДТА в PBS) в одной клеточной суспензии на 1 × 10 6 клеток / мл.
    6. Отсортируйте tdTomato-положительных НСТ116 клеток с использованием клеток сортировщик, стробирования для PE-позитивных клеток (возбуждение / излучения: 556/585 нм). Grow собранные клетки в 10-см чашку на 5% CO 2 и 37 ° C для создания родительских tdTomato-позитивных клеток НСТ116 (Рис . 1А)
    7. Ресуспендируют родительских tdTomato-положительных клеток НСТ116 из 2.3.6 с 8 мл 0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА в течение 3 - 5 мин, а затем добавляют 8 мл cDMEM для нейтрализации трипсина.
      1. Передача клеток в 50 мл трубки и гранулы при 300 мкг в течение 4 мин. Удалить супернатант и разбавить родительских tdTomato-положительных клеток НСТ116 до 1 клетки на 200 мкл в cDMEM (Рисунок 1В).
    8. Пластинчатый одну ячейку (200 мкл разведения) на лунку в 96-луночный планшет при 5% CO 2 и 37 ° С (рис 1C).
    9. Grow отдельных моноклональных антител в колбах при 5% CO 2 и 37 ° С. (Рисунок 1D).

3. Калибровка интенсивности флуоресцентного сигнала как функция Количество сотовых

  1. Пластинчатый трансфектированных клеток НСТ116, теперь упоминается как НСТ116-L2T, при плотности 0, 10 3, 2 х 10 4, 3 х 10 5, 5 х 10 4, 7 х 10 4, 9 х 10 4, и 10 5 клеток / лунку в 96 - луночные планшеты при трехкратном повторе для каждой плотности.
  2. Через 5 часов инкубации, количественно tdTomato флуоресцентные интенсивности с использованием ИВИС 10.
    1. Нажмите на иконку образа программного обеспечения на рабочем столе, чтобы запустить программное обеспечение. Нажмите на кнопку "Initialize" для инициализации системы формирования изображения. После инициализации отделки (которая занимает около нескольких минут), выберите "флуоресцентной", "4 второго" времени экспозиции, "Medium" биннинга, "2" F / стоп, "535" Фильтр возбуждения,и "580" эмиссионный фильтр.
    2. Поместите 96-луночный планшет на станции формирования изображения и нажмите на кнопку "Приобретать", чтобы начать визуализацию. После того как изображение приобретается, нажмите кнопку "ROI Tools" в палитре инструментов и выберите 12 х 8 с помощью значка щели.
    3. Создание 12 х 8 прорезями, чтобы покрыть площадь сигнала на изображении 96-луночного планшета и выберите вкладку измерений. Заметим , окно с таблицей измерений ROI с единицами фотонов в сек на стерадиан на квадратный сантиметр (фотонов / с / ср / см 2).
  3. Построить диаграмму рассеяния с аргументом (ось X), равное количеству клеток и функции (ось Y), представляющего интенсивность сигнала. Расчет кривых регрессии с использованием программного обеспечения для анализа данных для расчета количества ячеек , соответствующих единицах интенсивности флуоресценции (рис 2) 10.

4. Модель животных печени метастазами

  1. После того, как НСТ116-L2T клетки достигают 70- 80% конфлюэнтности, подготовить их примерно 1 ч до инъекции селезенке. Диссоциируют клеток с использованием 0,05% трипсина в 0,53 мМ ЭДТА в течение 3 - 5 мин, а затем нейтрализуют их с равным количеством cDMEM. Убедитесь в том, чтобы тщательно пипеткой, чтобы избежать образования комков.
  2. Граф клеток с автоматическим счетчиком клеток.
  3. Ресуспендируют клеток в 1X ДЗФР до концентрации 1,2 - 2 х 10 6 клеток / 100 мкл. Убедитесь в том, чтобы пипеткой и ресуспендирования клетки тщательно, чтобы избежать образования комков.
  4. Хранить клетки на льду до инъекции, время от времени ресуспендирования их в трубе.
  5. Перед обезболиванием мышей, обеспечивают предоперационной анестетик и болюс жидкости путем подкожной инъекционное 500 мкл бупренорфина смеси, описанной в пункте 1.3. Администрирование ту же дозу дополнительного бупренорфин смеси два раза в день, пока признаки боли (снижение подвижности, сгорбившись роста, неспособность жениха, вокализации когда обработано) не решены.
  6. Обезболить от 6 до 8 недель-Старый самка бестимусных голых мышей с 2% изофлуран в кислороде в анестезии камере. Убедитесь, что мыши полностью под наркозом, зажимая хвост. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Передача каждого наркозом мышь к отдельному конусообразной для инъекции селезенке. До начала надреза, каждая мышь должна быть покрыта стерильной хирургической простыне.
  7. Определить селезенку как фиолетовой области видно снаружи через кожу на левом фланге голых мышей. Использование микродиссекции ножницами, сделать 8 мм левый фланг надрез на коже непосредственно над селезенкой.
    1. Затем поднимите на брюшной стенке и сделайте небольшой надрез. Обеспечить возможность поступления воздуха в брюшную полость так, что внутренние органы отодвигаться от места надреза. Увеличить брюшной стенки надрез до примерно 5 мм.
    2. Выставляют селезенку, осторожно применяя давление вокруг разреза с помощью ватного тампона. При необходимости, панкреатический жир может быть мягко человекipulated, чтобы помочь с воздействием таким образом, чтобы не повредить селезенку.
  8. Медленно вводят по 100 мкл клеток с использованием 1 мл шприц с иглой 27 G в кончик открытой селезенки. Вводят медленно, в течение периода, по меньшей мере, 30 - 60 с, чтобы избежать опухолей экстра-печени.
  9. Поместите microclip на селезенке перед извлечением иглы в конце инъекции, чтобы предотвратить утечку закачиваемой суспензии клеток.
  10. Оставьте microclip на месте в течение 5 мин.
  11. 5 мин послеинжекционной, выполнить спленэктомии с использованием ручных прижиганием устройство для гемостаза. Рассеките селезеночной рубчик, начиная с передней стороны. При вскрытии крупных сосудов, предварительно коагулировать проксимальной стороны сосудов с прилегающей жировой ткани, используя прижигание, чтобы избежать чрезмерного кровотечения.
    Примечание: Методы гемостаза: коагулировать кровоточащий непосредственно с прижиганием, оказать давление на кровоточащий в течение 3 - 5 мин, или шовный-лигировать кровоточащий с 5-0 шелковым галстуком. Закройте фланговую надрез каждой мыши в два слоя. Во- первых, закрыть брюшной стенки с 5-0 рассасывающиеся плетеным швом (например, викрил) в одной горизонтальной строчкой. Затем закройте кожу с помощью 4-0 невсасывающихся мононити швом (например, проленовой), опять же с одной горизонтальной строчкой.
  12. Очистите все инструменты путем распыления 70% изопропиловый спирт для поддержания стерильных условий между каждой процедурой.
    Примечание: Убедитесь, что животные нагреваются, пока они просыпаются от наркоза. Контроль всех мышей после операции, пока они не станут амбулаторного и вернуться к нормальной деятельности. Как правило, время восстановления составляет приблизительно 3 - 5 мин. Не оставляйте животных без присмотра, пока они не восстановили достаточное сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока он не полностью восстановилась.

5. В Vivo Биолюминесцентный обработки изображений

  1. Выполните визуализацию наЕженедельно для измерения и количественной оценки изменений в биолюминесценции с течением времени.
  2. Место мышей в камере анестезии и обезболить их с 2% изофлуран в кислороде. Убедитесь, что мыши полностью под наркозом, зажимая хвосты. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Далее, внутрибрюшинно вводят каждую мышь с 150 мкл заранее подготовленные светлячка люциферин с шага 1.4.
  4. Поместите мышам в ИВИС с индивидуальными носовых конусов введение изофлуран. Поместите мышей в положении лежа на спине с распорками между ними, чтобы свести к минимуму сигнала на соседних мышей. Не более пяти мышей могут быть отображены в одно время.
  5. Измерение и анализ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ интенсив- 3 мин после инъекции люциферин.
    1. После инициализации ИВИС, как описано в пункте 3.2.1, выберите "люминесцентного", "1 секунда" время выдержки и биннинга "Medium".
    2. Нажмите на кнопку "Приобретать", чтобы начать Imaginг. Убедитесь в том, чтобы выполнить каждую визуализацию при постоянной времени (3 мин) после инъекции люциферин.
    3. После того как изображение приобретается, появится окно изображения и палитры инструментов. Нажмите "ROI Tools" и выберите "1", "2", "3", "4", или "5" от значком в виде круга, что соответствует количеству мышей изображаемых.
    4. Для того, чтобы определить области интереса (трансформирования), обведите область сигнала сигнала люминесцентного в брюшной полости мыши, а затем нажмите кнопку "измерения" на ROI в качестве произвольной единицы лучистой эффективности ((фотонов / с / см 2 / стерадиан) / (мкВт / см 2)). Убедитесь в том, чтобы иметь дополнительный ROI круг фона.
  6. В четыре недели после инъекции и до принесения в жертву животных, выполнять Diffuse Люминесцентные визуализации томографии (DLIT) с использованием ИВИС для оценки опухолевой нагрузки и распределения с использованием реального времени 3D-реконструкция биолюминесценции интенсивности отдельных опухолевых колоний. Обезболить мышей и вводят люциферин, как описано в пункте 5.2.4. DLIT выполняется на одной мыши в то время.
  7. После инициализации ИВИС, как описано в пункте 3.2.1, выберите "Мастер обработки изображений", "биолюминесценции", и нажмите кнопку "Далее". Выберите "DLIT" и нажмите кнопку "Далее". Выберите "Светлячок" зондов и нажмите кнопку "Далее". Выберите "мышь" сюжетное изображение, "Авто" параметров экспозиции, "C-13 см" поле зрения ", и 0,5 см" при условии высоту, и нажмите кнопку "Далее". Нажмите на кнопку "Acquire", чтобы начать визуализацию.
  8. После того как изображение приобретается, выберите вкладку "DLIT 3D реконструкция" и "Анализ" Вкладка и нажмите кнопку "Реконструировать" для создания 3D-реконструкции изображения.
  9. Нажмите "Инструменты" и "3D-анимации". Выберите «Spin КНО по оси Y." в окне 3D-анимации. Нажмите кнопку "Запись" и "Сохранить" в файл формата .mov.

6. Ex Vivo флуоресцентная томография

  1. Жертвоприношение мышей путем смещения шейных позвонков в то время как под наркозом, или в соответствии с ведомственным руководящим принципам в 4 - 6 недель после селезенке инъекций.
  2. Заготавливают печень. Сделайте горизонтальный разрез слева на правый фланг. Схватив мечевидного отростка с пикапа, рассекают серповидной, печеночной вены и нижней полой вены.
    1. Рассеките правый гепаторенальный связки, гепатодуоденальной связки, а левый гепаторенальный связки, следя за тем, чтобы не повредить хвостатого мочку во время рассечения гепатодуоденальной связки. После сбора печени, удаления желчного пузыря, так как это будет отображать аутофлюоресценция. Обратите внимание на каких-либо дополнительных опухолей экстра-печени, присутствующих.
  3. Обратите внимание на цифры и размеров опухолей печени присутствует макроскопически, и поместите заготовленные печенки в ДЗФР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли макроскопически видны невооруженным глазомв виде белых опухолей (для репрезентативного примера, смотри рисунок 4).
  4. До размещения на листе изображения, возьмите каждую печень и осторожно удалить лишнюю жидкость путем промокания на бумажное полотенце.
  5. Измерьте флуоресцентные интенсивности от каждой колонии опухоли с использованием ИВИС.
    1. Выберите "Флуорецсенция", "4 секунды" время экспозиции, "Medium" биннинга, "2" F / остановка "535" фильтра возбуждения, и "580" эмиссионный фильтр. Нажмите на кнопку "Acquire", чтобы начать визуализацию.
    2. После получения изображения, найдите окно изображения и палитры инструментов. Нажмите кнопку "ROI Tools" и выберите "1" значком в виде круга. Для определения трансформирования, обведите область сигнала отдельных опухолевых колоний на изображении, а затем нажмите кнопку "измерения" на ROI в качестве произвольной единицы лучистой эффективности ((фотонов / с / см 2 / стерадиан) / (мкВт / см 2) ). Убедитесь в том, чтобы иметь дополнительный ROI круг фона.
    3. Вычислить общий объем опухоли, если предположить, что это будет сфера. Объем опухоли = 4 х π хт 3/3 (г = радиус). Рассчитать долю опухолевых колониеобразующих клеток (Fc), как количество опухолей в печени, деленное на число клеток splenically впрыскиваемого.
    4. Подсчитайте общее число клеток на колонию (= X) от линейной аппроксимации с шага 3.3. Подсчитать количество клеточных делений (= Y), а Y = Log 2 X и Td , как Td (день) = 28 / Y.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Целью этого эксперимента было создать последовательную и легко воспроизводимый животной модели с потенциалом для последовательной количественной оценки метастатической опухолевой в естественных условиях и для оценки частоты колонизирующего и кинетики роста развития метастазов в печени. На рисунках 2-6, легендами, предоставляются из нашей предыдущей публикации под лицензией Creative Commons CC-BY 10.

Генерация двойных меченных опухолевых клеток моноклональных антител

Во-первых, панель люминесцентными и флуоресцентно меченых моноклональных клеточных линий был сгенерирован с различными метастатических способностями. После успешной трансфекции люминесцентными (Luc2) и флуоресцентные (tdTomato) белков в раковых клетках родительских НСТ116 колоректального, 16 двойных меченных моноклональных антител были получены путем разбавления родительского HCT116-L2T клетки к 1 клеток / 200 мкл в 96 - луночные планшеты (рис 1) 10. В пробирке флуоресценции и люминесценции НСТ116-L2T затем количественно , используя все большее количество клеток для оценки количества опухолевых клеток из в естественных условиях и экс визуализации in vivo опухоли печени (рисунок 2) 10.

Метастазы Развитие клонами с дифференциалом печени Колонизация

Далее, чтобы произвести метастазы в печени, 16 предварительно сгенерированные индивидуальных клонов НСТ116-L2T были intrasplenically вводили мышам; спленэктомия Затем был проведен. Развитие метастазов в печени контролировали еженедельно в естественных условиях биолюминесценции визуализации, а затем экс естественных условиях флуоресцентной визуализации после умерщвления мышей. Из 16 моноклональных антител, генерируемых мы отобрали клоны обозначенные как P1, P2, O1, O2, из-за их гifferent наблюдается колонизация и роста возможностей в печени. Клоны O1 и O2 имели меньшую нагрузку опухоли, представляющие "oligometastatic" клоны, и потенциально обобщал фенотип ограниченного метастазами. Клоны P1 и P2, имели большую опухолевую нагрузку, представляя широкое распространение, которое также называют polymetastatic болезни. Биолюминесценции была выше в P1 и P2 мышей (6,7 × 10 6 ± 4,7 × 10 6 и 3,6 × 10 6 ± 2,5 × 10 6 фотонов / с / см 2 / стерадиан) по сравнению с мышами O1 и O2 (2,0 × 10 5 ± 1,3 × 10 5 и 1,7 × 10 5 ± 9,1 × 10 4 фотонов / с / см 2 / стерадиан) через 3 недели после инъекции селезенке (Фигура 3А, Б) 10. Количественное экс виво флуоресценции печени через 4 недели после инъекции селезенка показали , что P1 и P2 печенки имели более высокие fluoresинтенсивность цент по сравнению с O1 и O2 (рис печенью 3C). Распределение опухолей в естественных условиях бывших флуоресцентных изображений согласуются с макроскопических выводами (рис 3C, D) 10.

Колонизация и кинетика роста отдельных клонов

Количество и размеры опухолей визуализированных макроскопически подсчитывали и измеряли в каждой отдельной печени. Кроме того, экс естественных условиях флуоресцентного изображения было сделано на каждой отдельной колонии опухоли для каждого моноклона (рисунок 4) 10. Общее количество опухолей у Р1 была выше, по сравнению с Р2, O1, O2, в то время как размер опухоли был в Р2 больше , чем в P1, O1, O2 (р <0,001; рис 5А, В) 10. Тем не менее, общий объем опухоли в печени в Р1 и Р2 было больше по сравнению с O1 и O2 (5С) - 5 ± 1,1 × 10 - 5, 6,0 × 10 - 6 ± 2,3 × 10 - 6 в Р1 и О1, соответственно, р <0,001; рис 5D) 10. Хотя Р2 имели подобную способность колонизировать печень как клоны O1 и O2, размер опухолей, генерируемых была больше, чем другие клоны. Общее число клеток на опухоль колонии, делегатом, а количество клеточных делений может быть вычислена на основе этих данных с помощью калибровки ранее генработки от корреляции между интенсивностью флуоресценции и количества клеток (фиг.2 и 5Е - G) 10. P1, который произвел много небольших опухолей в печени, как видно макроскопического визуального осмотра, имел больший Fc, хотя она имела Td, аналогичную O1 и O2 (р <0,05). P2, который генерируется ограниченное число макроскопических крупных опухолей, была подобная Fc, но более короткий Td по сравнению с O1 и O2 (р <0,05). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что Fc и Td являются двумя ключевыми параметрами, способствующими метастатического потенциала.

Распределение 3D метастатических опухолей в печени была продемонстрирована DLIT (рисунок 6) 10. С помощью этого метода визуализации, можно контролировать пространственно-временной динамическое поведение метастазов обнаружения и измерения биолюминесценции отдельных печеночных метастатические колонии.

Данные, полученные анализировали с использованием стандартного программного обеспечения для анализа данных, а также столбики ошибок были продемонстрированы как среднее ± стандартное отклонение. Коэффициенты корреляции Пирсона были использованы для оценки связи между параметрами. Значения Р были оценены с использованием т-тесты 2-Стьюдента, с р <0,05 считается статистически значимым.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Генерация панели моноклональных антител меченых клеток НСТ116 (A) Рост клеток родительского HCT116 , меченные люциферазы и tdTomato. (В) Развести клеток НСТ116 родительскими по отношению к 1 клетку / 200 мкл. (С) Тарелка 200 мкл разведения в 96 - луночный планшет. (D) Grow monocloNES из каждой лунки в 96-луночный планшет. (E) Вводят моноклональных антител intrasplenically в мышей , чтобы произвести метастазы в печень. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: Оценка числа клеток флуоресцентным интенсивностях (А) Люминесцентное изображение различного количества клеток утроенный в 96 - луночный планшет.. (В) Соотношение между количеством клеток и люминесценции (R = 0,99, p <0,0001). Шкалы представляет собой люминесцентный интенсивности (фотонов / с / см 2 / стерадиан). (C) флуоресцентное изображение различного количества клеток утроенный в 96 - луночный планшет. Интенсивности мывновь приобретены лучистого КПД с 535 нм возбуждения и излучения в 580 нм. (D) Соотношение между количеством клеток и флуоресценции (R = 0,99, p <0,0001). Шкалы представляет собой интенсивность флуоресценции в произвольном блоке лучистой эффективности ((фотонов / с / см 2 / стерадиан) / (мкВт / см 2)). Печатается с разрешения 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: биолюминесценции и Е х Vivo флуоресценция печени в отобранных клонов (A) Представитель биолюминесцентного изображения.. Шкалы представляет собой люминесцентный Intensity (фотонов / с / см 2 / стерадиан). (B) Биолюминесценция измеряется еженедельно от 1 - 3 недели в P1 и P2, и 1 - 4 недели в O1 и O2. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. (C) представитель экс естественных условиях флуоресцентные изображения печени. Интенсивности были приобретены в качестве лучистого КПД при 535 нм возбуждения и излучения в 580 нм. Шкалы представляет интенсивность флуоресценции в произвольной единицы лучистого эффективности ((фотонов / с / см 2 / стерадиан) / (мкВт / см 2)). (D) макроскопические изображения печени (стрелки указывают на маленькие белые опухоли). P1 и P2: polymetastatic клоны, O1 и O2: oligometastatic клоны. Печатается с разрешения 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рис . 4: Количественная флуоресцентных интенсивностях Индивидуальной печени Колонии Изображения на левой стороне представлены типичные макроскопические данные и изображения справа являются флуоресцентные интенсивности в каждом клоне. Флуоресцентные интенсивности были приобретены лучистого КПД при 535 нм возбуждения и излучения в 580 нм. P1 и P2: polymetastatic клоны, O1 и O2: oligometastatic клоны. Печатается с разрешения 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рис . 5: Количественная оценка колонизировать способности и кинетика роста ( (В) макроскопический размер индивидуальных опухолей, (С) , вычисленный общий объем опухоли в печени, (D) , колонизацию доля опухолевых колониеобразующих клеток (Fc), (Е) общее количество клеток в колонии, (F) , время удвоения (Td), и (G) , количество клеточных делений каждого клона. P1 и P2: polymetastatic клоны, O1 и O2: oligometastatic клоны. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для всех фигурных панелей, в которых были показаны столбики ошибок. Печатается с разрешения 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Quantificatiна биолюминесценции индивидуальных колоний опухолевыми с использованием Diffuse Люминесцентные визуализации томография (DLIT). (A) 3D вид сверху. Шкалы представляет интенсивность флуоресценции в произвольном блоке лучистой эффективности. (B) Корональные части. (C) Саггитальная раздел. (D) трансаксиальной раздел. (Е) Макроскопические изображение печени. (F) Экс естественных флуоресцентное изображение печени. Печатается с разрешения 10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Животная модель представлена ​​в нынешнем докладе, основывается на двух основных подходов. Во- первых, с тем чтобы обеспечить возможность наблюдать метастатических клонов с различными наклонностей колонизировать и размножаться в печени, была создана группа из сильно неоднородных линий моноклональных клеток, а не установленной клеточной линии 12,13 нефракционированного рака. Моноклональное подход к развитию метастаз оправдано недавними геномных данных 14 и был успешно применен ранее для моделирования метастатического процесса 10,15,16. Во- вторых, дважды мечение клеточной линии родительского люциферазой и tdTomato маркеров была включена для того , чтобы обеспечить повышенную анализ метастатического роста как в естественных условиях и бывших естественных условиях. Люминесцентный и флуоресцентным позволяет детально анатомического обследования и потенциальной квантификации как количества метастатических опухолей (рассматриваемой как частота или эффективности colonizatio печенип) и размер любой отдельной колонии. Последние могут быть легко преобразованы в фактическое количество клеток с помощью простой процедуры калибровки , описанной в стадии 2 , и на фиг 2 10 и 4 10. Используя эти данные, можно оценить Td для каждого метастатического узла в печени и оценить кинетики роста метастазов в печень для каждого начального моноклона закачиваемой (рисунок 5) 10.

Три различных ободочной и прямой кишки с метастазами фенотипы наблюдались в этой экспериментальной системе, обозначенной как P1, P2, и O1 / O2. Эти метастатического фенотипа отличались при сравнении данных частоты колонизации и местных темпов роста для каждого метастатическим клона. Первый метастатический фенотип, Р1, продемонстрировал повышенную способность колонизировать печени, но относительно низкий уровень локального роста, что соответствует многих мелких метастатических опухолей по всей печени. Второй метастатического фенотипа, P2, имелболее низкая частота колонизации, но значительно более высокую скорость локального роста, что приводит к относительно небольшому числу больших вторичных опухолей. И, наконец, третий метастатического фенотипа, O1 и O2, продемонстрировал как низкую частоту колонизации и медленных локальных темпов роста. Этот третий метастатический фенотип может рассматриваться как представление клинических oligometastatic заболевания печени (рис 3 10 и 5 10). Кроме того, анализ экспрессии генов сравнения этих клонов 10 выявлены существенные различия в характере экспрессии. Например, при сравнении с P1 O1 и O2 клонов, были 756 дифференцированно выраженных генов, в том числе подмножество генов, участвующих в воспалительной реакции и передачи сигналов интерферона. Это исследование, а также другие, которые вовлечены эти гены в играет ключевую роль в росте опухоли и выживаемость 21, 22. Кроме того, при сравнении P2 к O1 и O2, были 461 дифференцированно ExpresseD генов, с подмножеством участием генов важных для клеточного роста и пролиферации, опосредованной через ERK1 сигнализации / 2.

Разнообразие метастатических фенотипов, полученных с помощью этой экспериментальной модели согласуется с наблюдаемым клиническим представлениям метастатическим гетерогенности. Например, было показано , что размер метастазов в печени (параметр , связанный с потенциалом роста) и их количество (параметр , связанный с возможностью колонизация) являются независимыми факторами риска отдаленными метастазами 1. С повышенной потенциалом роста или способности колонизации, свойства, наблюдаемые в P1 и P2 согласуются с этими данными. Кроме того, недавние наблюдения пациентов с стереотаксической тела радиотерапии (SBRT) или с хирургически удаленных метастазов в легких указывают как на количество опухолей и скорость прогрессирования в качестве ключевых факторов , определяющих общее и незараженных исходов 17,18. Таким образом, колонизация и роста способности, кажется,является одним из наиболее важных факторов при определении развития метастатических клонов в отдаленных местах 19,20. Экспериментальные модели, основанные на этих свойствах метастатических клонов, могут предоставить полезные инструменты для понимания механизмов развития метастазов, а также предоставить средства для тестирования новых методов лечения для лечения заболеваний печени метастазами.

В то время как ортотопическая модель способна производить спонтанные метастазы является идеальным, остается недостаток легко воспроизводимые и последовательных спонтанных моделей. В то время как модели , использующие intracecal имплантации или инъекции были описаны, они продемонстрировали различные скорости поглощения и метастаз формирования 23-26. Другие методы использовали внематочной имплантации подхода внутриселезеночное или внутрипортальной инъекции для создания метастазов в печени. В то время как общая методика инъекции такой же, модель, представленная здесь, обеспечивает чувствительный подход к Understanding механизмы развития метастаз, начиная со стадии циркулирующих опухолевых клеток (КТК). Чувствительность и воспроизводимость нашего подхода определяется двойной маркировки клеточных линий, чтобы позволить и биолюминесцентном и флуоресцентных изображений, чтобы проследить динамику метастатического процесса. Благодаря способности, чтобы количественно оценить метастатического нагрузку с люминесцентными и флуоресцентных данных, можно систематически измерять и отслеживать кинетики роста метастазов в течение долгого времени. Хотя альтернативные подходы, такие как изображения ультразвука на основе, которые были использованы, эти методы являются гораздо более зависит от пользователя, с потенциально увеличена межпользовательских изменчивостью 27. Кроме того, путем создания панели моноклональных клеточных линий, мы способны обеспечить воспроизводимые и различных метастатических фенотипы с целью лучшей модели изменчивости метастазами видели в клинических условиях.

В то время как освоение этой экспериментальной методики,в частности внутриселезеночное инъекции для естественных условиях мышиной модели в (смотрите шаг 4), есть несколько важных шагов , которые могут потребовать модификации. Следует отметить, что выполняя селезеночной инъекции является наиболее важной частью модели, как неадекватный инъекция селезенки может привести к плохим результатам. Утечка клеток в процессе инъекции, или утечки вызванных ненадлежащим размещением microclip, может привести к снижению количества метастазов в печени и / или значительное количество опухолей экстра-печени или перитонеального carcinomatoses. Кроме того, важно, чтобы впрыснуть раковые клетки медленно, по крайней мере, до тех пор, как описано в протоколе, с тем чтобы избежать увеличение внутриселезеночный давления, что может привести к экстравазации клеток в соседние ткани и рост опухоли печени очень вокруг пня селезенке рассечения.

И наконец, на этапе 4.3, существует диапазон ячеек для заданных селезеночной инъекций (1,2 - 2 × 10 6 </ SUP> клетки). Целью данного диапазона является учет индивидуальных операторов этой техники. Это может занять некоторое время, чтобы откалибровать оптимальное число клеток инъекционные. Если слишком мало клетки инъецируют, метастазы в печень, не может развиваться последовательно, и если слишком много клетки инъецируют, воротной вены закупорка может произойти, что приводит к ранней смерти животного. Это может быть целесообразно, чтобы сначала попробовать несколько различных концентраций опухолевых клеток при запуске этой модели, чтобы найти оптимальное количество.

Один ловушкой представленной модели является то , что она основана на ксенотрансплантата подходе и эксплуатирует иммунодефицитных голых мышей. Одним из альтернативных методов предложен является генерирование аналогичной панели моноклональных производных мышиной ободочной линии клеток МС38, двойной меткой с люциферазы и tdTomato или EGFP белков. Эти клоны затем могут быть использованы в сингенных животных моделях для того, чтобы захватить взаимодействий развивающихся метастазов в печень с принимающей IMMUпе системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джеффри Л. Грин (Университет Чикаго) для плазмиды Luc2-tdTomato и линии клеток НСТ116, г-н Ани Соланки (Animal Resource Center) для управления мышей, и д-р Лара Leoni за помощь с DLIT. Количественными флуоресцентных и люминесцентных интенсивностей были выполнены в Комплексном мелких животных Imaging Research Resource в Университете Чикаго в IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Эта работа была поддержана Вирджинии и DK Людвиг фонд исследований рака, легких Cancer Research Foundation (КЗоТ), Фонд рака простаты (PCF) и онкологический центр поддержки Грант (P30CA014599). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Caliper Life Sciences 124262 In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software Caliper Life Sciences 128165 Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine Vetamac VAD-MGX Inhalation anesthesia machine
DMEM Gibco 11965-118 Cell culture reagents
DPBS Gibco 14190250 Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) Invitrogen 15140163 Cell culture reagents
HBSS ThermoFisher 24020117 Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL) Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. 12496-0757-5 Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System Braintree Scientific GEM 5917 Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length Roboz Surgical Instrument RS-5426 Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt Goldbio Technology LUCK-1G Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450102 Automatic cell counter
JMP10 software  SAS Institute Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter BD Biocsiences Cell sorter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230, (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241, (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263, (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46, (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62, (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96, (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210, (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122, (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5, (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8, (2), e55714 (2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197, (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4, (6), e5821 (2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28, (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7, (12), e50141 (2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6, (12), e28650 (2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22, (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24, (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18, (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5, (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170, (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
Расширенный животной модели колоректального метастазами в печени: Визуализация методы и свойства метастатических клонов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).More

Oshima, G., Stack, M. E., Wightman, S. C., Bryan, D., Poli, E., Xue, L., Skowron, K. B., Uppal, A., Pitroda, S. P., Huang, X., Posner, M. C., Hellman, S., Weichselbaum, R. R., Khodarev, N. N. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. J. Vis. Exp. (117), e54657, doi:10.3791/54657 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter