Abstract
Patienter med ett begränsat antal levermetastaser och låga hastigheter av progression kan behandlas framgångsrikt med lokal behandling närmar sig 1,2. Men lite är känt om heterogenitet levermetastaser, och djurmodeller kan utvärdera utvecklingen av enskilda metastatiska kolonier behövs. Här presenterar vi en avancerad modell av levermetastaser som ger möjlighet att kvantitativt visualisera utvecklingen av enskilda tumör kloner i levern och uppskatta deras tillväxt kinetik och kolonisering effektivitet. Vi genererade en panel av monoklonala derivat av HCT116 humana kolorektala cancerceller stabilt märkta med luciferas och tdTomato och som har olika tillväxtegenskaper. Med en mjälten injektion följt av en splenektomi, de flesta av dessa kloner kan generera levermetastaser, men med olika frekvenser av kolonisering och varierande tillväxttakter. Med användning av in vivo imaging System (IVIS), är det möjligt att visualisera och kvantifiera metastaser utveckling med in vivo självlysande och ex vivo fluorescerande avbildning. Dessutom Diffus Luminescent Imaging Tomography (DLIT) tillhandahåller en 3D-fördelning av levermetastaser in vivo. Ex vivo fluorescerande avbildning av skördade levrar ger kvantitativa mätningar av individuella levermetastatiska kolonier, vilket möjliggör utvärdering av frekvensen av lever kolonisering och tillväxt kinetik av metastaser. Eftersom modellen liknar kliniskt observerade levermetastaser, kan det fungera som en modalitet för att detektera gener associerade med levermetastaser och för att testa potentiella ablativ eller adjuvant behandling för lever metastaserad sjukdom.
Introduction
Patienter med levermetastaser från primära kolorektala cancer (CRC) kännetecknas av en dålig prognos. 5-års överlevnad för primära icke-metastaserad CRC (stadier I - III) uppskattas till 75-88% 3,4, medan patienter med levermetastaser (stadium IV) har en 5-års överlevnad på endast 8-12% 5 , 6. Men patienter med metastaserande representerar en heterogen grupp, uppvisar olika antal metastaser och olika återkommande gånger. Kliniska observationer tyder på att antalet metastaser (som kan vara proportionell mot koloniseringsförmåga eller frekvensen av kolonisering) och storleken på varje enskild metastas (proportionell mot den lokala tillväxten) är oberoende prognostiska faktorer 1,7. Med andra ord, framgång metastaserande kloner kolonisera levern beror på två viktiga egenskaper: deras förmåga att växa och deras förmåga att sprida och överleva i levern mikromiljö.
Designenframgångsrika kliniska modeller med förmåga att fånga och kvantifiera egenskaperna hos metastaserande kloner kan drastiskt förbättra vår förståelse av levermetastaser biologi och ge ett effektivt verktyg för utformningen av potentiella terapeutiska metoder. Modeller av experimentell levermetastaser har tidigare rapporterats 8,9, men ingen av dem gav förmågan att kvantitativt fånga och beskriva egenskaper hos enskilda metastaserande kloner både in vivo och ex vivo.
Här presenterar vi en ny, avancerad modell av levermetastaser som inkluderar generering av tumör kloner med olika lever kolonisering effektivitet och tillväxtegenskaper. Vi använde en kombination av dubbel-märkning av cancerceller med luciferas och tdTomato fluorescerande protein med genereringen av monoklonala cellinjer som har inneboende skillnader i metastatisk kapacitet. I denna experimentella modell, visar data att utvecklingen avlevermetastaser kan beskrivas i termer av kolonisering frekvens och dubbleringstid (Td), vilket överensstämmer med kliniska observationer. Den kvantitativa naturen hos denna modell gör det lätt att adoptable för läkemedelsutveckling och diagnostiska ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Chicago (protokoll # 72.213-09) och utförs under sterila förhållanden.
1. Förberedelser
- Göra 500 ml medium för odling av HCT116 tumörceller: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin.
- Autoklavera instrumenten som ska användas för mjälten injektions modellen, bland annat 3 - 4 kirurgiska handdukar, gasbinda, två små Adson pickups, en nål förare, två saxar, en liten klämma, och 3 microclips, vid 251 ° C under 20 minuter .
- Förbered postoperativ anestesi för mössen, som skall administreras subkutant efter mjälten injektion. Späd 2-4 pg av buprenorfin i 500 mikroliter av 0,9 normal saltlösning per mus.
- Förbered alikvoter av 150 mikrogram / 150 mikroliter av eldflugeluciferin för intraperitoneala injektioner during mareld analyser. Förvara vid -20 ° C och skyddas mot ljus.
2. Framställning av luciferas / tdTomato-märkta monoklonala cellinjer 10,11
- Tö och upprätthålla HCT116 humana kolorektala cancerceller och 293FT humana embryonala njurceller i DMEM med 10% FBS, 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin. Upprätthålla i kultur vid 5% CO2 och 37 ° C.
- Producera en hög titer lentivirus.
- På D 1 platta 10 - 12 x 10 6 293FT celler mellan passage 3 och 10 i 15 cm cellodlingsskålar i 18 ml fullständigt DMEM (cDMEM) med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 1% icke-essentiella aminosyror . Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- På D2, transfektera cellerna med hjälp av följande transfektion lösning:
- För varje maträtt, använd följande: en DNA-blandning av 37,5 mikrogram av pFUG lentivirusvektor införas med luciferas (Luc2) och tdTomatokonstruerar 11 (en gåva från Dr. Geoffrey Greene vid University of Chicago), 25 pg pCMVΔ8.74 och 12,5 mikrogram av pMD2.G återsuspenderades i totalt 1062 mikroliter sterilt H2O Lägga 188 mikroliter av 2 M CaCl2.
- Lägga 1250 mikroliter av 2x Hepes-buffrad saltlösning (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na 2 HPO 4, och 180 mM NaCl, pH 7,12) till DNA / CaCl2-lösning, en droppe i taget, medan blåsa bubblor genom den lösning med en pipett.
- Inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter, och sedan lägga till 15,5 ml av RT cDMEM och klorokin att göra en slutlig koncentration av 25 | iM.
- Aspirera media i varje skål av 293FT celler och ersätta med transfektion lösning. Lägg 16 ml transfektion lösningen långsamt, eftersom de strukna cellerna lätt rubba.
- På D 3, efter 8-16 h, avlägsna transfektion lösningen och tvätta cellerna en gång med Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS), återigen taking noga med att inte rubba cellerna. Byt ut media med 18 ml av färsk cDMEM med 10 mM Hepes.
OBS: Flytta sakta rätter, aspirera transfektion lösning, och lägga till media genom sidoväggen av plattor för att inte rubba cellerna. - På D 4, på 48 timmar från tidpunkten för transfektion, samla in media från skålarna genom att aspirera långsamt med en pipett för att inte rubba cellerna. Centrifugera de uppsamlade medier med 300 xg under 5 minuter för att fälla ut den stora cellrester.
- Filtrera den virala supernatanten med användning av ett 0,45 | j, m med låg proteinbindande filterkolv och centrifugera med användning av en SW-28-rotor under 2 timmar vid 50.000 xg och 4 ° C. Dekantera supernatanten omedelbart efter centrifuger finish och torka insidan av röret med torkarblad.
- Suspendera virus pelleten i 50 mikroliter av minskade serum Medium (RSM) med 1% FBS. Portioner kan förvaras vid -80 ° C för framtida användning (viral lager).
- Transducera lentiviruses in i HCT116-celler och generera en panel av tdTomato-positiva kloner.
- PLÅT HCT116-celler vid en densitet av 1 x 10 5 i 24 brunnars plattor en d före virusinfektion.
- Späd 40 mikroliter av återsuspenderad virus (från 2.2.7) i 4 ml av RSM (1: 100 spädning) med 1% penicillin / streptomycin och 8 ^ g / ml polybren (CRSM).
- På dagen för infektion, tvätta cellerna en gång med DPBS, och sedan lägga till 250 mikroliter utspätt virus från steg 2.3.2 till varje brunn. Inkubera under 4 h vid 37 ° C och 5% CO2, och sedan lägga till en ml cDMEM till varje brunn; inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 48-72 h.
- Resuspendera cellerna med 1 ml 0,05% trypsin och 0,53 mM EDTA, och sedan tillsätt 1 ml cDMEM att neutralisera trypsin. Överföra celler till ett mikrocentrifugrör och pellet vid 300 xg under 4 minuter. Tvätta pelleten 3x i 1 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) plus 2% FBS.
- Suspendera pelleten från steg 2.3.4med FACS-buffert (2% FBCS och 2 mM EDTA i PBS) till en enda cellsuspension vid 1 x 10 6 celler / ml.
- Sortera tdTomato-positiva HCT116 celler med användning av en cellsorterare, grind för PE-positiva celler (excitation / emission: 556/585 nm). Odla de uppsamlade cellerna i en 10-cm skål vid 5% CO2 och 37 ° C för att alstra föräldra tdTomato positiva HCT116-celler (Figur 1A).
- Resuspendera föräldra tdTomato-positiva HCT116 celler från 2.3.6 med 8 ml 0,05% trypsin och 0,53 mM EDTA under 3-5 minuter, och tillsätt sedan 8 ml cDMEM att neutralisera trypsin.
- Överföra cellerna till ett 50 ml rör och pellet vid 300 xg under 4 minuter. Avlägsna supernatanten och späd de paren tdTomato positiva HCT116-celler till en cell per 200 mikroliter i cDMEM (Figur 1B).
- Plätera en enda cell (200 mikroliter av utspädning) per brunn i en 96-brunnars platta vid 5% CO2 och 37 ° C (Figur 1C).
- Växa enskilda monoclones i kolvar vid 5% CO2 och 37 ° C. (Figur 1D).
3. Kalibrering av fluorescerande signal intensitet som en funktion av cellantal
- Plätera de transfekterade HCT116-celler, nu benämnda HCT116-L2T, vid en densitet av 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4, och 10 5 celler / brunn i plattor med 96 brunnar i triplikat för varje densitet.
- Efter 5 timmars inkubering, kvantifiera tdTomato fluorescensintensiteter som använder IVIS 10.
- Klicka på ikonen bildbehandlingsprogram på skrivbordet för att starta programmet. Klicka på "Initiera" för att initiera avbildningssystemet. Efter initiering är klar (vilket tar ungefär några minuter), välj "Fluorescence", "4 sekunders" exponeringstid, "Medium" binning "2" F / stop "535" excitationsfilter,och "580" emissionsfilter.
- Placera 96 brunnar på bildstationen och klicka på "Hämta" för att starta avbildning. När bilden förvärvas genom att klicka "ROI Tools" i verktygspaletten och välj 12 x 8 från ikonen slitsen.
- Skapa 12 x 8 slitsar för att täcka området signalen på bilden av 96 brunnar och klicka på fliken mätningar. Observerar ett fönster med en tabell över ROI-mätningar med enheter av fotoner per ar per steradian per kvadratcentimeter (fotoner / s / sr / cm 2).
- Konstruera ett spridningsdiagram med argumentet (X-axeln) som är lika med antalet celler och funktion (Y-axeln) som representerar signalintensitet. Beräkna regressionskurvor med hjälp av en dataanalys programvara för att beräkna mängden av celler som motsvarar enheten för fluorescensintensitet (Figur 2) 10.
4. djurmodell av levermetastaser
- När HCT116-L2T cellerna når 70- 80% konfluens, förbereda dem ungefär en timme före mjälten injektionen. Dissociera cellerna med hjälp av 0,05% trypsin i 0,53 mM EDTA under 3-5 minuter, och sedan neutralisera dem med en lika stor mängd cDMEM. Se till att pipet noggrant för att undvika klumpbildning.
- Räkna celler med en automatisk cellräknare.
- Resuspendera cellerna i 1x DPBS till en koncentration av 1,2 - 2 x 10 6 celler / 100 mikroliter. Se till att pipett och resuspendera cellerna noggrant för att undvika klumpbildning.
- Hålla cellerna på is tills injektion, ibland återsuspendera dem i röret.
- Före anesthetizing mössen ger en preoperativ bedövningsmedel och vätska bolus av subkutant injicera 500 mikroliter av buprenorfin blandning beskrivs i steg 1,3. Administrera samma dos av ytterligare buprenorfin blandning två gånger om dagen tills tecken på smärta (nedsatt rörlighet, böjd resning, underlåtenhet att brudgummen, läte när de hanteras) har försvunnit.
- Söva 6- till 8 veckor-Gamla kvinnliga atymiska nakna möss med 2% isofluran i syre i en anestesikammare. Kontrollera att mössen är helt under anestesi genom att klämma svansen. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos. Överför varje sövda mus till en enskild noskon för mjälten injektion. Före incision, bör varje mus täckas med en steril kirurgisk duk.
- Identifiera mjälten som en lila område sett externt genom huden på den vänstra flanken av nakenmöss. Med hjälp av microdissection sax, gör en 8 mm vänsterkanten snitt på huden precis ovanför mjälten.
- Därefter lyfter upp på bukväggen och göra ett litet snitt. Tillåta luft in i bukhålan så att de inre organen rör sig bort från snittstället. Förstoring bukväggen incision till cirka 5 mm.
- Exponera mjälten genom att försiktigt applicera tryck runt snittet med en bomullspinne. Vid behov kan bukspottskörteln fett vara försiktigt manipulated att hjälpa till med exponering för att inte skada mjälten.
- Injicera långsamt 100 | il av celler med användning av en 1 ml spruta med en 27 G nål in i spetsen av den exponerade mjälten. Injicera långsamt, över en period av åtminstone 30 - 60 s, för att undvika tumörer extra-lever.
- Placera en microclip på mjälten före avlägsnande av nålen vid slutet av injektionen för att förhindra läckage av den injicerade cellsuspension.
- Lämnar microclip på plats under 5 min.
- 5 min efter injektion, utför en splenektomi med hjälp av en handhållen cautery anordning för hemostas. Dissekera mjälten hilum, med början från den främre sidan. När dissekera stora fartyg, pre-koagulera den proximala sidan av fartyg med intilliggande fettvävnad, med hjälp av diatermi för att undvika alltför stora blödningar.
OBS: Metoder för hemostas: koagulera blödning punkten direkt med diatermi, sätta press på blödningen poäng för 3-5 minuter, eller sutur-ligera blödningen punkten med en 5-0 sidenslips. Stäng flanken snittet hos varje mus i två lager. Först stänger bukväggen med en 5-0 absorberbar flätad sutur (t.ex. vicryl) i ett enda övergripande stygn. Därefter stänger huden med en 4-0 icke-absorberbara monofilament sutur (t.ex. prolene), återigen med ett enda övergripande stygn. - Rengör alla instrument genom att spraya 70% isopropanol för att upprätthålla sterila förhållanden mellan varje förfarande.
OBS: Se till att djuren värms medan de vaknar från anestesi. Övervaka alla möss postoperativt tills de blir ambulatorisk och återgå till normal aktivitet. Typiskt är återhämtningstiden ca 3 - 5 min. Lämna inte djur utan uppsikt tills de har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur förrän den har återhämtat sig helt.
5. In vivo Bioluminescent Imaging
- Utföra bildbehandling påveckovis för att mäta och kvantifiera förändringar i bioluminiscens över tiden.
- Placera möss i en anestesikammare och söva dem med 2% isofluran i syre. Kontrollera att mössen är helt under anestesi genom att klämma svansar. Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Därefter intraperitonealt injicera varje mus med 150 mikroliter av preprepared eldflugeluciferin från steg 1,4.
- Placera möss i en IVIS med enskilda noskoner administrera isofluran. Placera mössen i ryggläge med distanser i mellan att minimera signalen till intilliggande möss. Högst fem möss kan avbildas på en gång.
- Mäta och analysera självlysande intensiteter tre minuter efter luciferin injektion.
- Efter att ha startat IVIS som beskrivs i steg 3.2.1, välj "Luminescent", "1 sekund" exponeringstiden, och "Medium" binning.
- Klicka på knappen "Hämta" för att starta imaging. Se till att utföra varje avbildning vid en enhetlig tids (3 min) efter luciferin injektion.
- När bilden förvärvas, kommer ett bildfönster och verktygspaletten visas. Klicka på "ROI Verktyg" och välj "1", "2", "3", "4" eller "5" från ikonen cirkel, motsvarande antalet möss avbildas.
- Att definiera områden av intresse (ROI), cirkel signalområde självlysande signalen i bukhålan av musen, och klicka sedan på "mätningar" av ROI som en godtycklig enhet av strålningsutbytet ((fotoner / s / cm2 / steradian) / (^ W / cm 2)). Se till att ha en extra ROI cirkel av bakgrunden.
- Vid fyra veckor efter injektion och före djuroffer, utföra Diffus Självlysande Imaging Tomography (DLIT) med hjälp av IVIS att utvärdera tumörbördan och distribution med hjälp av realtids-3D rekonstruktion av självlysande intensiteten hos enskilda tumörkolonier.
- Efter att ha startat IVIS, som beskrivs i steg 3.2.1, välj "Imaging wizard", "Bioluminescence", och klicka på "Nästa". Välj "DLIT" och klicka på "Nästa". Välj "Firefly" sonder och klicka på "Nästa". Välj "mus" bild ämne, exponerings parametern "Auto", "C-13 cm" synfält, och "0,5 cm" ämne höjd, och klicka på "Nästa". Klicka på "Acquire" -knappen för att starta avbildning.
- När bilden förvärvas, välj "DLIT 3D-rekonstruktion" -fliken och "Analysera" -fliken och klicka på "rekonstruera" för att generera 3D-rekonstruktion bilden.
- Klicka på "Verktyg" och "Animation 3D". Välj "Spin CCW på Y-axeln" i 3D-animation fönstret. Klicka på "Record" och "Spara" i en .mov-fil.
6. Ex Vivo Fluorescent Imaging
- Offra mössen genom cervikal dislokation medan sövda, eller i enlighet med institutionens riktlinjer på 4 - 6 veckor efter mjälten injektioner.
- Skörda levern. Gör ett horisontellt snitt från vänster till höger flank. Gripa tag i xiphoid process med en pickup, dissekera falciform, den hepatiska venen, och den nedre hålvenen.
- Dissekera rätt hepatorenalt ligament, den hepatoduodenal ligament och vänster hepatorenalt ligament, noga med att inte skada caudatus lob medan dissekera hepatoduodenal ligament. Efter skörd levern, ta bort gallblåsan, eftersom detta kommer att visa autofluorescens. Notera eventuella ytterligare extra levertumörer närvarande.
- Ta del av antal och storlek av levertumörer närvarande makroskopiskt och placera skördade lever i DPBS.
OBS: Tumörer är makroskopiskt synliga för blotta ögatsom vita tumörer (för ett representativt exempel, se Figur 4). - Före placering på bildarket, ta varje lever och försiktigt avlägsna överskottsvätska genom blotting på en pappershandduk.
- Mäta de fluorescerande intensiteter från varje tumör koloni med hjälp IVIS.
- Välj "Fluorescence", "4 sekunder" exponeringstid, "Medium" binning "2" F / stop "535" excitationsfilter och "580" emissionsfilter. Klicka på "Acquire" -knappen för att starta avbildning.
- Efter förvärvet bilden lokalisera bildfönstret och verktygspaletten. Klicka på "ROI Verktyg" och välj "1" från ikonen cirkeln. För att definiera ROI, cirkel signal av individuella tumör kolonier på bilden, och klicka sedan på "mätningar" av ROI som en godtycklig enhet av strålningsutbytet ((fotoner / s / cm2 / steradian) / (iW / cm 2) ). Se till att ha en extra ROI cirkel av bakgrunden.
- Beräkna den totala tumörvolymen genom att anta att det är en sfär. Tumörvolymen = 4 x π XR 3/3 (r = radie). Beräkna den fraktion av tumörkolonibildande celler (FC) som antalet tumörer i levern dividerat med antalet celler splenically injiceras.
- Beräkna det totala antalet celler per koloni (= X) från den linjära approximation från steg 3,3. Beräkna antalet celldelningar (= Y) som Y = log 2 x och Td som Td (dag) = 28 / Y.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med detta experiment var att fastställa ett konsekvent och lätt reproducerbar djurmodell med potential för serie kvantifiering av metastaserande tumörbördan in vivo och för uppskattning av koloniserande frekvens och tillväxt kinetik att utveckla levermetastaser. Figurerna 2-6, med legender, tillhandahålls från vår tidigare publikation enligt en Creative Commons CC-BY-licens 10.
Generation av dubbelmärkta tumörceller Monoclones
Först en panel av självlysande och fluorescerande monoklonala cellinjer genereras med olika metastaserande förmågor. Efter framgångsrik transfektion av luminescent (Luc2) och fluorescerande (tdTomato) proteiner i föräldra HCT116 kolorektala cancerceller, 16 dubbelmärkta monoclones genereras genom att späda föräldra HCT116-L2T celler till en cell / 200 mikroliter i 96 brunnar (Figur 1) 10. In vitro fluorescens och ljusflöde av HCT116-L2T därefter kvantifieras med hjälp av en ökande mängd celler för att uppskatta antalet tumörceller från in vivo och ex vivo levertumör avbildning (Figur 2) 10.
Metastaser Utveckling per Kloner med Differential Lever Colonization
Nästa, för att generera levermetastaser, 16 tidigare genererade individuella HCT116-L2T kloner intrasplenically injiceras i möss; en splenektomi genomfördes därefter. Utvecklingen av levermetastaser följdes genom veckovis in vivo självlysande imaging, följt av ex vivo fluorescerande avbildning efter offra mössen. Av de 16 monoclones genereras, valde vi kloner betecknade P1, P2, O1 och O2, på grund av sin different observerade kolonisering och tillväxtkapacitet i levern. Kloner O1 och O2 hade en mindre tumörbörda, som representerar "oligometastatic" kloner, och potentiellt rekapitulera en fenotyp av begränsad metastaserad sjukdom. Kloner P1 och P2 hade en större tumörbörda, som representerar en bred spridning, vilket även kallas polymetastatic sjukdom. Den bioluminiscens var högre i P1 och P2-möss (6,7 x 10 6 ± 4,7 x 10 6 och 3,6 x 10 6 ± 2,5 x 10 6 fotoner / s / cm 2 / steradian) jämfört med den O1 och O2-möss (2,0 x 10 5 ± 1,3 x 10 5 och 1,7 x 10 5 ± 9,1 x 10 4 fotoner / s / cm 2 / steradian) 3 veckor efter mjälten injektion (Figur 3A, B) 10. Kvantifieringen av ex vivo fluorescens av levrarna vid 4 veckor efter mjälten injektion visade att P1 och P2 levrar hade högre fluorescent intensiteter jämfört med O1 och O2 lever (Figur 3C). Tumörfördelningarna i de ex vivo fluorescerande bilder överensstämde med makroskopiska fynd (figur 3C, D) 10.
Kolonisering och tillväxt Kinetics av individuella kloner
Siffrorna och storlekar av tumörer visualiseras makroskopiskt räknades och mättes i varje enskilt levern. Dessutom har ex vivo fluorescens avbildning görs på varje enskild tumör koloni för varje monoclone (figur 4) 10. Det totala antalet tumörer i P1 var högre, jämfört med P2, O1 och O2, medan storleken av tumörer var större i P2 än i P1, O1, och O2 (p <0,001; figur 5A, B) 10. Emellertid den totala tumörvolymen i levern i P1 och P2 var större jämfört med O1 och O2 (figur 5C)
3D-fördelning av metastatiska tumörer i levern visades genom DLIT (figur 6) 10. Med hjälp av denna bildteknik, är det möjligt att övervaka spatial-temporala dynamiska beteende metastaser vid detektering och mätning av mareld enskilda levermetastatiska kolonier.
De data som genereras analyserades med användning av standarddataanalysmjukvara, och felstaplar demonstrerades som medelvärde ± standardavvikelse. Pearsons korrelationskoefficienter användes för att utvärdera associationer mellan parametrar. P-värden bedömdes med hjälp 2-tailed Students t-test, med ett p <0,05 anses vara statistiskt signifikant.
Figur 1:. Bildning av en panel av Monoclones märkt HCT116 celler (A) Odla föräldra HCT116 celler märkta med luciferas och tdTomato. (B) Späd föräldra HCT116 celler till en cell / 200 mikroliter. (C) Plate 200 mikroliter av utspädning i en 96-brunnsplatta. (D) Grow monoclones från varje brunn i 96-brunnsplatta. (E) Injicera monoclones intrasplenically i möss för att generera levermetastaser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Uppskattning av antalet celler av fluorescensintensiteter (A) luminescent bild av olika antal celler tripplerade i en platta med 96 brunnar.. (B) Korrelationen mellan antalet celler och luminiscensen (R = 0,99, p <0,0001). Skalstrecket representerar självlysande intensitet (fotoner / s / cm2 / steradian). (C) Den fluorescerande bilden av olika antal celler tripplerade i en 96-brunnsplatta. intensiteter vire förvärvats som strålande effektivitetsvinster med en 535 nm excitation och 580 nm emission. (D) Korrelationen mellan antalet celler och fluorescens (R = 0,99, p <0,0001). Skalstrecket representerar fluorescensintensiteten i en godtycklig enhet av strålningsutbytet ((fotoner / s / cm 2 / steradian) / (^ W / cm 2)). Återges med tillstånd 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bioluminescence och E x Vivo fluorescens av levern i utvalda kloner (A) Representativa självlysande bilder.. Skalstrecket representerar självlysande intensity (fotoner / s / cm 2 / steradian). (B) Bioluminescence mättes varje vecka från 1 - 3 veckor i P1 och P2, och 1 - 4 veckor i O1 och O2. Data var representerade som medelvärde ± standardavvikelse. (C) representant ex vivo fluorescerande bilder av levrar. Intensiteter förvärvades som strålande effektivitetsvinster med en 535 nm excitation och 580 nm emission. Skalstrecket representerar fluorescensintensitet i en godtycklig enhet av strålningsutbytet ((fotoner / s / cm 2 / steradian) / (^ W / cm 2)). (D) Makroskopiska lever bilder (pilarna visar små vita tumörer). P1 och P2: polymetastatic kloner, O1 och O2: oligometastatic kloner. Återges med tillstånd 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Kvantifiering av fluorescensintensiteter av Individuell Lever Kolonier bilder till vänster är representativa makroskopiska fynd och bilder till höger är fluorescensintensiteter i varje klon. De fluorescerande intensiteter förvärvades som strålande effektivitetsvinster med en 535 nm excitation och 580 nm emission. P1 och P2: polymetastatic kloner, O1 och O2: oligometastatic kloner. Återges med tillstånd 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Kvantitativ Uppskattning av koloniseringsförmåga och tillväxt Kinetics (
Figur 6: Quantificatining Bioluminescence av individuella tumör Kolonier använder Diffus Självlysande Imaging Tomography (DLIT). (A) 3D översiktsvy. Skalstrecket representerar fluorescensintensitet i en godtycklig enhet av strålningsutbytet. (B) Coronal sektion. (C) sagittalsnitt. (D) transaxiell avsnitt. (E) Makroskopisk bild av levern. (F) Ex vivo fluorescerande bild av levern. Återges med tillstånd 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellen djur som presenteras i denna rapport bygger på två huvudinriktningar. Först, för att säkerställa förmågan att observera metastatiska kloner med olika benägenheter att kolonisera och proliferera i levern, var en panel av mycket heterogena monoklonala cellinjer etableras, i stället för en etablerad ofraktionerat cancercellinjen 12,13. Den monoklonala syn på metastaser utveckling motiveras av de senaste genetiska data 14 och framgångsrikt använts tidigare för att modellera metastaserande process 10,15,16. För det andra, var dubbel-märkning av föräldra cellinje genom luciferas och tdTomato markörer införlivade för att ge förbättrad analys av metastatisk tillväxt både in vivo och ex vivo. Den självlysande och fluorescerande märkning möjliggör en detaljerad anatomisk undersökning och potentiell kvantifiering av både mängden metastaserande tumörer (betraktas som frekvensen eller effekten av lever colonization) och storleken på varje enskild koloni. Den senare kan lätt omvandlas till en faktisk antal celler med användning av en enkel kalibrerings förfarandet beskrivet i steg 2 och fig 2 10 och 4 10. Med hjälp av dessa data, är det möjligt att uppskatta Td för varje metastaserande nod i levern och att utvärdera tillväxt kinetiken av levermetastaser för varje inledande monoclone injiceras (Figur 5) 10.
Tre olika kolorektala metastatiska fenotyper observerades i detta experimentella system, som betecknas som P1, P2, och O1 / O2. Dessa metastatiska fenotyper skilde när man jämför data från frekvensen av kolonisering och lokala tillväxttakten för varje metastaserande klon. Den första metastatisk fenotyp, P1, visade en förbättrad förmåga att kolonisera i levern men en relativt låg lokal tillväxthastighet, som svarar mot många små metastatiska tumörer i hela levern. Den andra metastatisk fenotyp, P2, hadeen lägre frekvens av kolonisering men en betydligt högre lokal tillväxthastighet, vilket resulterar i ett relativt litet antal stora sekundära tumörer. Slutligen den tredje metastatisk fenotyp, O1 och O2, visade både en låg frekvens av kolonisering och långsamma lokala tillväxt. Denna tredje metastatisk fenotyp kan betraktas som en representation av kliniska oligometastatic leversjukdom (figurerna 3 10 och 5 10). Dessutom genuttryck analys jämföra dessa kloner 10 identifierade betydande skillnader i uttrycksmönster. Till exempel, när man jämför P1 med O1 och O2-kloner, fanns det 756 differentiellt uttryckta gener, däribland en undergrupp av gener som är involverade i inflammatoriska svar och interferon-signalering. Denna studie, liksom andra, har inblandad dessa gener att spela nyckelroller i tumörtillväxt och överlevnad 21, 22. Dessutom, när man jämför P2 till O1 och O2, fanns 461 differentiellt expressed gener, med en delmängd omfattar gener som är viktiga för celltillväxt och proliferation förmedlas genom ERK1 / 2 signalering.
Mångfalden av metastaserande fenotyper som produceras av denna experimentella modell är förenlig med den observerade kliniska representationer av metastaserad heterogenitet. Exempelvis har det visat sig att storleken på levermetastaser (en parameter relaterad till tillväxtpotential) och deras nummer (en parameter relaterad till koloniseringsförmåga) är oberoende riskfaktorer för fjärrmetastaser 1. Med förbättrad tillväxtpotential eller koloniseringsförmåga, de egenskaper som observerats i P1 och P2 är förenliga med dessa uppgifter. Dessutom, de senaste observationer av patienter som behandlats med Stereotactic Body Radio-terapi (SBRT) eller med kirurgiskt utskurna lungmetastaser pekar både antalet tumörer och graden av progression som viktiga faktorer som avgör övergripande och sjukdomsfria utfall 17,18. Således, kolonisering och tillväxt förmåga tycksvara bland de mest kritiska faktorerna för att bestämma utvecklingen av metastatiska kloner på avlägsna platser 19,20. Experimentella modeller, som är baserade på dessa egenskaper hos metastatiska kloner, kan ge användbara verktyg för att förstå mekanismerna för metastaser utveckling, samt ge ett medel för att testa nya behandlingsmetoder för att bota lever metastaserad sjukdom.
Medan en ortotopisk modell med förmåga att producera spontana metastaser är perfekt, finns det fortfarande en brist på enkelt reproducerbara och konsekventa spontana modeller. Medan modellerna utnyttjar intracecal implantation eller injektioner har beskrivits, visade de variabla hastigheter av upptag och metastasbildning 23-26. Andra metoder har använt en ektopisk implantation tillvägagångssätt från mjälten eller intraportal injektion för att generera levermetastaser. Även om den övergripande tekniken för injektion är densamma, modell presenteras här ger en känslig metod för understanding mekanismerna för metastas utveckling, med början från stadiet av cirkulerande tumörceller (CTC). Känslighet och reproducerbarhet vår strategi bestäms av dubbelmärkning av cellinjerna för att möjliggöra både självlysande och fluorescerande avbildning för att spåra dynamiken i den metastatiska processen. På grund av möjligheten att kvantifiera metastaserande bördan från självlysande och fluorescerande data är det möjligt att systematiskt mäta och följa tillväxt kinetik metastaser över tiden. Även alternativa metoder, såsom ultraljudsbaserad avbildning, har använts, dessa villkor är mycket mer användarberoende, med potentiellt ökad inter användare variabilitet 27. Dessutom, genom att generera en panel av monoklonala cellinjer, har vi möjlighet att ge reproducerbara och distinkta metastatiska fenotyper för att bättre modell variabiliteten av metastatisk sjukdom ses i klinisk miljö.
Samtidigt behärska detta experimentella teknik,specifikt mjälten injektion för in vivo musmodell in (se steg 4), finns det några viktiga steg som kan kräva modifiering. Att notera, utföra mjälten injektion är den viktigaste delen av modellen, som en inadekvat injektion av mjälten kan resultera i dåliga resultat. Läckage av celler under injektionen, eller läckage som orsakas av olämplig placering av microclip, kan resultera i ett lägre antal levermetastaser och / eller en betydande mängd extra-levertumörer eller peritoneala carcinomatoses. Dessutom är det viktigt att injicera tumörcellerna långsamt, åtminstone så länge som beskrivs i protokollet, i syfte att undvika en ökning av mjälten tryck, vilket kan leda till extravasation av cellerna till angränsande vävnader och tillväxten av extra-levertumörer runt stump av mjälte dissekering.
Slutligen i steg 4,3, finns det en rad av celler som ges för mjälten injektion (1,2-2 x 10 6 </ Sup> celler). Syftet med detta intervall är att ta hänsyn till individuella operatörer av denna teknik. Det kan ta tid att kalibrera ett optimalt antal celler att injicera. Om alltför få celler injiceras, kan levermetastaser utvecklar inte konsekvent, och om alltför många celler injiceras, kan portal venös ocklusion inträffar, vilket leder till tidig död hos djuret. Det kan vara klokt att först prova flera olika koncentrationer av tumörceller vid start denna modell för att finna det optimala antalet.
En fallgrop av det presenterade modellen är att den är baserad på en xenograft tillvägagångssätt och utnyttjar immundefekta nakna möss. En alternativ metod som föreslås är alstringen av en liknande panel av monoklonala derivat av den murina kolorektal cellinje MC38, dubbelmärkt med luciferas och tdTomato eller EGFP proteins. Dessa kloner kan sedan användas i syngena djurmodeller för att fånga samspelet utvecklingslevermetastaser med värd IMMUne-system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Geoffrey L. Greene (University of Chicago) för Luc2-tdTomato plasmid och HCT116 cellinje Mr Ani Solanki (Animal Resource Center) för mössen ledning, och Dr Lara Leoni för stöd med DLIT. Kvantifieringar av fluorescerande och luminescerande intensiteter utfördes i den integrerade smådjurs Imaging Research Resource vid University of Chicago på ett IVIS Spectrum (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Detta arbete stöddes av Virginia och DK Ludwig fonden för cancerforskning, Lung Cancer Research Foundation (LCRF), Prostate Cancer Foundation (PCF), och Cancer Center Support Grant (P30CA014599). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Caliper Life Sciences | 124262 | In Vivo imaging system |
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | 128165 | Imaging software |
| VAD-MGX Research Anesthetic Machine | Vetamac | VAD-MGX | Inhalation anesthesia machine |
| DMEM | Gibco | 11965-118 | Cell culture reagents |
| DPBS | Gibco | 14190250 | Cell culture reagents |
| Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin) | Invitrogen | 15140163 | Cell culture reagents |
| HBSS | ThermoFisher | 24020117 | Cell culture reagents |
| Buprenex Injection (0.3 mg/mL) | Reckitt Benckiser Healthcare Ltd. | 12496-0757-5 | Buprenorphine hydrochloride |
| Gemini Cautery System | Braintree Scientific | GEM 5917 | Hand-held cautery for splenectomy |
| Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length | Roboz Surgical Instrument | RS-5426 | Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio Technology | LUCK-1G | Luciferin potassium salt |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Reduced Serum Medium |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | Automatic cell counter |
| JMP10 software | SAS Institute | Data analysis software | |
| BD FACSAria II cell sorter | BD Biocsiences | Cell sorter |
References
- Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
- Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
- Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
- Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
- Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
- O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
- House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
- Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
- Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714 (2013).
- Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821 (2009).
- Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
- Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141 (2012).
- Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650 (2011).
- Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
- Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
- Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
- Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677 (2014).
- Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).
