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Neuroscience

एक किराए की Biosensor Nanoparticle Neurotoxicity निर्धारण करने के लिए Microglia

Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/54662
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1, 1,2, 1,2,4
1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

Introduction

पर्यावरण प्रदूषण, विशेष रूप से nanoparticle (एनपी) रेंज के उन (1 - 20 एनएम व्यास), मोटापा और रक्त मस्तिष्क बाधा 1-3 पार करने की क्षमता की वजह से अन्य neurodegenerative रोगों से जोड़ा गया है। प्रदूषण को ऊपर उठाया जोखिम हाइपोथेलेमस 1 सहित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सूजन उत्पन्न हो सकता है। एक संभावित तंत्र जिसमें यह तब होता है microglia की nanoparticle प्रेरित सक्रियण (मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं) 4 के माध्यम से हो सकता है। पूर्व के अध्ययन है जो समय लेने वाली है, महंगे हैं मस्तिष्क स्वास्थ्य पर एनपीएस के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विवो मॉडल में इस्तेमाल किया है, और सीधे कैसे एनपीएस microglia को प्रभावित के सवाल का जवाब नहीं है। Microglia और मस्तिष्क microenvironment के रखरखाव सहित secreted कारकों और साइटोकिन्स की रिहाई के माध्यम से न्यूरॉन्स के आसपास के साथ संवाद स्थापित करने, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एक बहुमुखी भूमिका निभाते हैं। उत्तेजनाओं पर निर्भर करता है, microglia एक एम 1 जनसंपर्क के लिए सक्रिय किया जा सकताओ भड़काऊ या एक M2 विरोधी भड़काऊ राज्य। उदाहरण के लिए, एम 1 सक्रिय microglia इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स जारी है, जबकि M2 सक्रिय इंटरल्यूकिन -4 (आईएल 4) सहित microglia रिहाई विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स। वायु प्रदूषण के न्यूरोटॉक्सिटी का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो biosensor में हमारे सरोगेट मान्य करने के लिए, हम 20 एनएम चांदी नैनोकणों (AgNPs) के लिए microglial प्रतिक्रिया मापा। इस लेख के लक्ष्य को कैसे इन विट्रो microglial सेल लाइन एनपीएस में murine microglial प्रतिक्रिया का परीक्षण और कैसे microglial सक्रियण हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं को प्रभावित करता के लिए एक किराए biosensor मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। लंबी अवधि का इरादा इस मान्य मॉडल के आवेदन मस्तिष्क स्वास्थ्य और neurodegenerative रोग पर वास्तविक दुनिया प्रदूषण के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए है। हम microglial सक्रियण और हाईपोथेलेमिक सेल अस्तित्व mic के प्रदर्शन के बाद मापने के लिए इन विट्रो 96 अच्छी तरह से परख प्रारूप का विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं वातानुकूलित मीडिया roglial।

Microglial सक्रियण AgNP प्रदर्शन के बाद एक TNF-α एंजाइम परख immunosorbent (एलिसा) से जुड़े का उपयोग निर्धारित किया गया था। हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं पर सक्रिय microglia के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, AgNPs microglial सतह पर तैरनेवाला (वातानुकूलित मीडिया) एक छानने का काम डिवाइस का उपयोग करने से हटा दिया गया। जबकि आकार के आधार पर AgNPs छोड़कर छानने का काम डिवाइस साइटोकिन्स बरकरार रखती है। संक्षेप में, के साथ या बिना AgNPs इलाज किया microglia से सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया गया था, फिल्टर करने के लिए जोड़ा है, और 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर centrifuged। हम तो हाईपोथेलेमिक सेल व्यवहार्यता पर microglial स्रावित साइटोकिन्स के प्रभाव का निर्धारण करने में सक्षम थे। सेल विषाक्तता (साइटोकिन्स युक्त) वातानुकूलित मीडिया के लिए जोखिम के बाद एक resazurin आधारित परख के माध्यम से निर्धारित किया गया था के रूप में पहले 5,6 वर्णित है। पाचन सक्रिय कोशिकाओं resazurin को कम करने और एक फ्लोरोसेंट संकेत व्यवहार्य कोशिकाओं 7 की संख्या के अनुपात में उत्पादन।

NT "> दूसरों (जैसे सह-संस्कृति, या विवो प्रयोगों में ट्रांस-अच्छी तरह से सेटअप) पर इस तकनीक का उपयोग करने के कई फायदे हैं। हमारे मॉडल सीधे microglia को सक्रिय करने और निर्धारित करती है कि स्रावित कारकों न्यूरॉन्स 8 को विषाक्त कर रहे करने की क्षमता प्रदान करता है । वर्तमान प्रोटोकॉल अमर BV2 microglia 20 एनएम व्यास नैनोकणों के साथ प्रेरित करता है और अमर murine हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं (नामित mHypo-A1 / 2) बाद में प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए 9। इस प्रोटोकॉल इन विशेष परिस्थितियों के लिए अनुकूलित किया गया है, हो सकता है तरीकों बदल microglial प्रेरित कोशिका मृत्यु के अन्य मॉडलों में इस्तेमाल किया, या प्राथमिक microglia और न्यूरॉन्स सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ हो।

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Protocol

1. microglial सेल संस्कृति रखरखाव

  1. गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम; DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / neomycin (पी एस एन) 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस पर 25 भंडारण से - पारित होने के 18 में BV2 microglial कोशिकाओं के जमे हुए शेयर प्राप्त करते हैं। तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं पिघलना।
  3. धीरे से एक 75 सेमी 2 निकाल कुप्पी 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया से युक्त कोशिकाओं हस्तांतरण।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में कुप्पी सेते हैं। महाप्राण मीडिया 24 घंटे के बाद और नए सिरे से मीडिया के साथ बदलें। 80% confluency - लगभग 70 तक कोशिकाओं को विकसित।

2. गिनती और चढ़ाना प्रकोष्ठों

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान, गर्म DMEM और 1x-trypsin EDTA के समाधान में।
  2. कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया और trypsin के 500 μl जोड़ें। 5 मिनट - 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. एक खुरचनी का उपयोग करना, कुप्पी से कोशिकाओं को हटाने और 5 मिलीलीटर में निलंबितDMEM के। तीन बार एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक 70 माइक्रोन झरनी के माध्यम से कोशिकाओं गुजरती हैं।
  4. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 8,000 कोशिकाओं / एक काले रंग में अच्छी तरह से 200 μl DMEM 10% FBS और 1% पी एस एन साथ पूरक के अंतिम मात्रा में स्पष्ट नीचे की थाली घिरी बीज। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में थाली सेते हैं।
  5. वर्ष DMEM निकालें और microglia भूखा सीरम के लिए 1% पी एस एन साथ पूरक गर्म DMEM के 200 μl के साथ बदलें। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में थाली सेते हैं।

3. सक्रिय Microglia

  1. अलग ट्यूबों में, AgNPs पतला (0.01, 0.05 या 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) और वाहन / तटस्थ नियंत्रण (सोडियम साइट्रेट, 0.04 मिमी) सीरम मुक्त DMEM अंतिम काम सांद्रता के लिए 1% पीएसएन के साथ पूरक है।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया के 100 μl निकालें और उचित उपचार परिसर के 100 μl के साथ बदलें।
  3. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में थाली सेते हैं।

4. फाईवातानुकूलित मीडिया ltering

  1. अच्छी तरह से प्रत्येक से मीडिया सतह पर तैरनेवाला के 200 μl लीजिए और एक फिल्टर संग्रह ट्यूब (1.5 2 मिलीलीटर क्षमता) के साथ (आणविक वजन 10 केडीए की कटऑफ) में स्थानांतरित।
  2. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. प्रवाह के माध्यम से (कणों के साथ सतह पर तैरनेवाला) त्यागें और एक नया संग्रह ट्यूब में फिल्टर ऊपर से नीचे जगह है।
  4. 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप फ़िल्टर मीडिया (स्रावित साइटोकिन्स युक्त) छह गुना से केंद्रित है।
  5. 10% FBS और 1% पी एस एन और बर्फ पर दुकान के साथ पूरक ताजा DMEM के साथ 400 μl के लिए ध्यान की मात्रा लाओ।
    नोट: - 420 एनएम 10 के बारे में 390 पर यह सुनिश्चित करने के लिए अवशिष्ट AgNPs मीडिया छान से हटा रहे हैं, विशेषता शिखर पर आधारित एक AgNP एकाग्रता उत्पन्न करते हैं। संक्षेप में, अनफ़िल्टर्ड AgNPs की aliquots (0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, और 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल 3.1 कदम के रूप में वर्णित) और छान तैयारवाहन नियंत्रण (सोडियम साइट्रेट, 0.04 मिमी) सीरम मुक्त DMEM में। अशेष एक काले रंग में नमूने और मानकों को छान के 50 μl स्पष्ट नीचे की थाली घिरी। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग, 390 पर absorbance उपाय - 410 एनएम और AgNP एकाग्रता वक्र करने के लिए रीडिंग की तुलना करें। फ़िल्टर नमूने वाहन पर नियंत्रण नमूना के रूप में ही absorbance के मूल्य है, यह अवशिष्ट AgNPs हटा रहे हैं ग्रहण किया जा सकता है।
  6. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से TNF-α स्राव निम्न निर्देश निर्धारित करने के लिए फ़िल्टर मीडिया के आधे का प्रयोग करें।

5. हाइपोथैलेमिक सेल संस्कृति रखरखाव

  1. गर्म DMEM सेल संस्कृति के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस तक 10% FBS और 1% पी एस एन साथ पूरक।
  2. 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत 25 - हाईपोथेलेमिक के जमे हुए शेयर (mHypo-A1 / 2) पारित होने के 18 में कोशिकाओं को प्राप्त करते हैं। तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं पिघलना।
  3. धीरे से एक 75 सेमी 2 निकाल कुप्पी 10 मिलीलीटर सेल संस्कृति मीडिया से युक्त कोशिकाओं हस्तांतरण।
  4. 5% में कुप्पी सेते सीओ 2

6. निर्धारण हाइपोथैलेमिक सेल विषाक्तता

  1. गर्म DMEM और एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1x-trypsin-EDTA समाधान।
  2. हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं से महाप्राण मीडिया और trypsin के 500 μl जोड़ें। 5 मिनट - 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक खुरचनी के रूप में चरण 2 में ऊपर वर्णित का उपयोग कर कुप्पी से कोशिकाओं निकालें।
  3. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और 5000 कोशिकाओं / एक काले रंग में अच्छी तरह से 200 μl DMEM के अंतिम मात्रा 10% FBS और 1% पी एस एन साथ पूरक में स्पष्ट नीचे की थाली घिरी पर हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं थाली और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में रातोंरात सेते ।
  4. पुराने मीडिया एक multichannel pipetter का उपयोग कर के 100 μl निकालें और 1x के अंतिम एकाग्रता के लिए फ़िल्टर केंद्रित वातानुकूलित मीडिया के 100 μl, जोड़ें।
  5. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में थाली सेते हैं।
  6. 22 जोड़े1; resazurin अभिकर्मक के एल और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 में 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  7. एक बहुपद्वति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति (560 एनएम पूर्व / 590 एनएम ईएम) का उपयोग सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए। रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के रूप में परिणाम की रिपोर्ट।

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Representative Results

हम ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग नैनोकणों के लिए मस्तिष्क की प्रतिक्रिया के लिए एक किराए के रूप में biosensor कि microglia समारोह दिखा। हमारे परिणाम नीचे की ओर न्यूरोनल कोशिका मृत्यु पर microglial सक्रियण के जहरीले प्रभाव का माप शामिल हैं। चित्रा 1 प्रोटोकॉल का एक कार्यप्रवाह microglia को सक्रिय करने और निर्धारित करती है कि स्रावित साइटोकिन्स हाईपोथेलेमिक न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता को कम करने के लिए यह दर्शाता है। TNF-α स्राव काफी AgNP जोखिम (चित्रा 2) निम्न वृद्धि की गई थी। हाईपोथेलेमिक न्यूरॉन्स AgNP सक्रिय microglia से वातानुकूलित मीडिया को उजागर कर रहे हैं, सेल व्यवहार्यता काफी (चित्रा 3) कम हो जाता है। चित्रा 4 संभावित तंत्र जिसमें AgNPs microglia को सक्रिय करने और हाईपोथेलेमिक कोशिका मृत्यु के लिए योगदान की रूपरेखा।

आकृति 1
आकृति1. AgNP निस्पंदन विधि। सक्रिय microglia से सतह पर तैरनेवाला के लिए कार्यप्रवाह निस्पंदन उपकरणों को जोड़ा गया है और मीडिया से AgNPs दूर करने के लिए centrifuged है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. TNF-α स्राव AgNP प्रदर्शन के बाद बढ़ जाती है। Microglial BV2 कोशिकाओं वाहन पर नियंत्रण या 2 घंटे के लिए AgNPs के साथ इलाज किया गया। TNF-α स्राव काफी AgNPs को प्रदर्शन के बाद बढ़ गया था। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। ** पी <0.001 बनाम नियंत्रण के रूप में छात्र unpaired टी -Test द्वारा मूल्यांकन। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. हाइपोथैलेमिक सेल व्यवहार्यता के बाद microglial वातानुकूलित मीडिया एक्सपोजर कम हो जाता है। हाइपोथैलेमिक कोशिकाओं में वृद्धि हुई कोशिका मृत्यु AgNP के साथ प्रेरित microglia से वातानुकूलित मीडिया को प्रदर्शन के बाद दिखा। डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। * पी <0.05 नियंत्रण बनाम के रूप में छात्र unpaired टी -Test द्वारा मूल्यांकन। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. AgNP प्रेरित microglial सक्रियण के संभावित मार्ग और हाइपोथैलेमिक Neurotoxicity पर प्रभाव। चांदी नैनोकणों के लिए जोखिम के बाद, microglia एक एम 1 समर्थक भड़काऊ राज्य को सक्रिय कर रहे हैं, वृद्धि स्राव और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और निर्माताओं की अभिव्यक्ति की विशेषता है। समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स और निर्माताओं की रिहाई के neuronal सेल मौत के आसपास करने के लिए योगदान देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells/Reagents
Mouse microglial cell line (BV2) Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) ATL03001
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2  Cellutions Biosystems Inc. CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 10313-039
Fetal bovine serum  PAA Labs A15-751
Penicillin/Streptomycin/Neomycin Thermo Fisher Scientific 15640-055
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Silver nanoparticles (20 nm) Sigma-Aldrich 730793

PrestoBlue Cell Viability Reagent		 Invitrogen A13262
Mouse TNF-α ELISA Max Delux Biolegend 430904
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich L4391
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile Thermo Fisher Scientific 165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Molecular Devices M5
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Corning, Inc
14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 μm Corning, Inc 08-771-2
Tabletop centrifuge 5430 Eppendorf 22620560

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 116 microglia वातानुकूलित मीडिया कोशिका मृत्यु nanoparticle neuroinflammation हाईपोथेलेमिक कोशिकाओं
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Duffy, C. M., Ahmed, S., Yuan, C., Mavanji, V., Nixon, J. P., Butterick, T. Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (116), e54662, doi:10.3791/54662 (2016).

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