Introduction
Contaminaciones ambientales, específicamente los de la gama de nanopartículas (NP) (1 - 20 nm de diámetro), se han relacionado con la obesidad y otras enfermedades neurodegenerativas debido a la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica 1-3. Una elevada exposición a la contaminación puede inducir inflamación en el sistema nervioso central, incluyendo el hipotálamo 1. Un mecanismo potencial en la que esto ocurre podría ser a través de nanopartículas inducida por la activación de la microglía (células inmunes del cerebro) 4. Estudios anteriores han utilizado en modelos in vivo para estudiar los efectos de los PN en la salud del cerebro, que consumen mucho tiempo, es caro, y no responder directamente a la pregunta de cómo influyen los PN microglia. La microglía jugar un papel de múltiples facetas en el sistema nervioso central, incluyendo el mantenimiento del microambiente del cerebro y la comunicación con neuronas circundantes a través de la liberación de factores secretados y citoquinas. Dependiendo de los estímulos, microglia se puede activar para un pr M1o-inflamatoria o un estado anti-inflamatoria M2. Por ejemplo, M1 activa microglia liberan citocinas pro-inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), mientras que M2 activa citocinas antiinflamatorias de liberación microglia incluyendo la interleucina-4 (IL-4). Para validar nuestro sustituto en biosensor vitro para determinar la neurotoxicidad de los contaminantes del aire, que mide la respuesta microglial a 20 nm (nanopartículas de plata AGNPS). El objetivo de este artículo es describir cómo una línea de células de la microglia in vitro puede ser utilizado como un marcador sustituto biosensor para probar la respuesta de la microglia murino de PN y cómo la activación microglial afecta a las células del hipotálamo. El largo plazo destinado aplicación de este modelo validado es poner a prueba los efectos de los contaminantes del mundo real sobre la salud del cerebro y las enfermedades neurodegenerativas. Proporcionamos una descripción detallada de un ensayo de formato in vitro de 96 pocillos para medir la activación microglial y la supervivencia celular hipotalámica siguiente a la exposición de mic roglial medios condicionados.
la activación microglial se determinó después de la exposición AgNP utilizando una enzima TNF-α ensayo inmunoenzimático (ELISA). Para determinar el efecto de la microglia activada en las células del hipotálamo, los AGNPS fueron retirados de sobrenadante microglial (medio acondicionado) usando un dispositivo de filtración. El dispositivo de filtración retiene las citoquinas, excluyendo los AGNPS en función del tamaño. Brevemente, se recogió el sobrenadante de microglia tratados con o sin AGNPS, se añadió a los filtros, y se centrifugó a 14.000 xg durante 15 min. Estábamos entonces capaz de determinar la influencia de las citocinas secretadas microgliales sobre la viabilidad celular hipotalámica. Se determinó la toxicidad de la célula después de la exposición a medio acondicionado (que contienen citoquinas) por medio de un ensayo basado en la resazurina como se describió previamente 5,6. Las células metabólicamente activas reducen la resazurina y producen una señal fluorescente proporcional al número de células viables 7.
nt "> Hay varias ventajas de la utilización de esta técnica sobre los demás (como co-cultivo, las configuraciones trans pocillos, o en experimentos in vivo). Nuestro modelo ofrece la posibilidad de activar directamente la microglía y determinar si los factores secretados son tóxicos para las neuronas 8 . El protocolo actual utiliza inmortalizado microglia BV2 estimulado con nanopartículas de 20 nm de diámetro, e inmortalizó células hipotalámicas murinos (designado mHypo-A1 / 2) 9 para la determinación de la respuesta posterior. Si bien este protocolo ha sido optimizado para estas condiciones específicas, los métodos puede ser modificadas para ser utilizadas en otros modelos de muerte celular microglial inducida, o con otros tipos de células incluyendo microglia primaria y las neuronas.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microglial Mantenimiento de Cultivos Celulares
- medio de cultivo celular caliente (medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
- Obtener material congelado de las células microgliales BV2 en el paso 18 - 25 de almacenamiento a -80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua.
- Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm 2 que contiene medios de cultivo 10 ml de células.
- Incubar frasco en 5% de CO 2 a 37 ° C. Aspirar los medios de comunicación después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Se cultivan las células hasta aproximadamente el 70 - 80% de confluencia.
2. Contar las células y que platean
- En un baño de agua a 37 ° C, DMEM caliente y una solución 1x-tripsina-EDTA.
- Aspirar los medios de las células y añadir 500 l de tripsina. Se incuba a 37 ° C durante 2 - 5 min.
- El uso de un raspador, eliminar las células del matraz y suspender en 5 mlde DMEM. Pasar las células a través de un filtro de 70 micras en un tubo de 50 ml tres veces.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro y semilla de 8.000 células / pocillo en una placa de fondo negro amuralladas claro en un volumen final de 200 l DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN. Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.
- Eliminar las viejas DMEM y reemplazar con 200 l de DMEM calentado suplementado con 1% de PSN a suero de hambre microglia. Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.
3. Activación de microglía
- En tubos separados, diluir AGNPS (0,01, 0,05 o 0,1 mg / ml) y el vehículo / control neutro (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM libre de suero suplementado con 1% de PSN a concentraciones de trabajo finales.
- Eliminar 100 l de los medios de comunicación de cada pocillo y reemplazar con 100 l de compuesto de tratamiento apropiado.
- Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.
4. Filtrado medio condicionado
- Recoger 200 l de sobrenadante de medios de cada pocillo y transferir a un filtro (corte de peso molecular de 10 kDa) con el tubo de recogida (1,5 a 2 ml de capacidad).
- Centrifugar a 14.000 xg a temperatura ambiente durante 15 min.
- Desechar el flujo continuo (sobrenadante con partículas) y colocar el filtro al revés en un nuevo tubo de recogida.
- Centrifugar a 1000 xg a temperatura ambiente durante 2 min.
NOTA: Los medios de comunicación filtrada resultante (que contiene citoquinas secretadas) se concentra por seis veces. - Llevar el volumen del concentrado a 400 l con DMEM fresco suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN y almacenar en hielo.
NOTA: Para garantizar AGNPS residuales se eliminan de los medios de comunicación filtradas, se genera una concentración AgNP basado en el pico característico en alrededor de 390 - 420 nm 10. Brevemente, se preparan alícuotas de AGNPS sin filtrar (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, y 0,2 g / ml como se describe en el paso 3.1) y se filtrócontrol de vehículo (citrato de sodio, 0,04 mM) en DMEM libre de suero. Alícuota de 50 l de muestras y patrones filtró en un negro amuralladas placa de fondo claro. El uso de un espectrofotómetro, medir la absorbancia a 390 - 410 nm y comparar las lecturas de la curva de concentración AgNP. Si muestras filtradas tienen el mismo valor de la absorbancia como la muestra de control del vehículo, se puede suponer AGNPS residuales se eliminan. - Usar medio de los medios filtrados para determinar siguientes instrucciones de secreción de TNF-α a partir de un kit disponible en el mercado.
5. hipotalámico Mantenimiento de Cultivos Celulares
- medio de cultivo celular caliente DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN a 37 ° C.
- Obtener material congelado de células del hipotálamo en el paso 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 almacenados a 80 ° C. Descongelar rápidamente las células en 37 ° C baño de agua.
- Transferir suavemente las células a un matraz de ventilación 75 cm 2 que contiene medios de cultivo 10 ml de células.
- Incubar matraz en 5% de CO 2
6. Determinación de la toxicidad celular hipotalámica
- DMEM caliente y una solución 1x-tripsina-EDTA en un baño de agua a 37 ° C.
- Aspirar los medios de comunicación a partir de células hipotalámicas y añadir 500 l de tripsina. Se incuba a 37 ° C durante 2 - 5 min. Extraer células del matraz utilizando un raspador como se describe anteriormente en el paso 2.
- Recuento de células utilizando un hemocitómetro y la placa células hipotalámicas a 5.000 células / pocillo en un negro amuralladas placa de fondo claro en un volumen final de DMEM 200 l suplementado con 10% de FBS y 1% de PSN y se incuba durante la noche en 5% de CO2 a 37 ° C .
- Eliminar 100 l de viejos medios utilizando un pipeteador multicanal y añadir 100 l de medio acondicionado concentrado se filtraron, a una concentración final de 1x.
- Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas.
- Añadir 221; l de reactivo de resazurina y se incuba la placa durante 20 minutos en 5% de CO 2 a 37 ° C.
- El uso de un espectrofotómetro multimodo, ficha fluorescencia (560 nm EX / EM 590 nm) para medir la viabilidad celular. Informar de los resultados como unidades de fluorescencia relativa (RFU).
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Representative Results
Se demuestra que la función de microglia como un biosensor sustituto de la respuesta del cerebro a las nanopartículas utilizando el protocolo anterior. Nuestros resultados incluyen la medición de los efectos tóxicos de la activación microglial en la muerte celular neuronal aguas abajo. La Figura 1 muestra un flujo de trabajo del protocolo para activar microglia y determinar si las citoquinas secretadas reducen la viabilidad de las neuronas hipotalámicas. La secreción de TNF-α fue significativamente mayor después de la exposición AgNP (Figura 2). Cuando las neuronas hipotalámicas se exponen a medios acondicionados de microglia activada con AgNP, la viabilidad celular se redujo significativamente (Figura 3). La figura 4 esboza el posible mecanismo en el que AGNPS activan microglia y contribuyen a la muerte celular hipotalámica.
FiguraSe añade 1. Flujo de trabajo para AgNP Filtración Método. El sobrenadante de microglia activada a dispositivos de filtración y se centrifuga para eliminar AGNPS de los medios de comunicación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. TNF-α secreción está aumentada tras la exposición AgNP. Microglial células BV2 se trataron con control de vehículo o AGNPS de 2 hr. la secreción de TNF-α se aumentó significativamente tras la exposición a AGNPS. Los datos se presentan como media ± SEM. ** p <0,001 frente al control no apareado según la evaluación de la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Viabilidad de las células del hipotálamo es reducido después de la exposición de medios Microglial acondicionado. Células hipotalámicas muestran aumento de la muerte celular después de la exposición a los medios acondicionados de la microglia estimulado con AgNP. Los datos se presentan como media ± SEM. * P <0,05 frente al control no apareado según la evaluación de la prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. vía potencial de AgNP inducida por la activación microglial y la Influencia en hipotalámico neurotoxicidad. Tras la exposición a las nanopartículas de plata, microglia se activan a un estado proinflamatorio M1, que se caracteriza por un aumento de la secreción y la expresión de citoquinas y los responsables de pro-inflamatorias. La liberación de las citoquinas pro-inflamatorias y los responsables contribuye a que rodea la muerte de las células neuronales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
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