Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي الأب البديل لتحديد الجسيمات النانوية العصبية

Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/54662
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2,3, 1, 1,2, 1,2,4
1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

Introduction

التلوث البيئي، وتحديدا تلك التي جسيمات متناهية الصغر (NP) مجموعة (1 - 20 نانومتر القطر)، وقد تم ربط السمنة وغيرها من الأمراض العصبية بسبب القدرة على عبور حاجز الدم في الدماغ 1-3. التعرض المرتفع للتلوث قد تحفز التهاب في الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك منطقة ما تحت المهاد 1. واحد آلية المحتملة التي يحدث هذا يمكن أن يكون من خلال جسيمات متناهية الصغر التي يسببها تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة (الدماغ الخلايا المناعية) 4. وقد استخدمت الدراسات السابقة في النماذج الحية لدراسة آثار تلك المصادر على صحة الدماغ والتي تستغرق وقتا طويلا، ومكلفة، ولا تجيب بشكل مباشر على سؤال عن كيفية التأثير على مصادر القدرة النووية الخلايا الدبقية الصغيرة. الخلايا الدبقية الصغيرة تلعب دورا متعدد الأوجه في الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك صيانة المكروية الدماغ والتواصل مع توضيح الخلايا العصبية عن طريق الإفراج عن عوامل يفرز والسيتوكينات. اعتمادا على المحفزات، الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن تفعيلها لالعلاقات العامة M1س للالتهابات أو دولة M2 المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة M1 تطلق السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، في حين تفعيلها M2 إطلاق الخلايا الدبقية الصغيرة السيتوكينات المضادة للالتهابات بما في ذلك انترلوكين 4 (IL-4). للتحقق من صحة بديل لدينا في جهاز الاستشعار البيولوجي في المختبر لتحديد السمية العصبية من ملوثات الهواء، قمنا بقياس استجابة دبقية إلى 20 الفضة النانوية نانومتر (AgNPs). والهدف من هذه المقالة هو شرح طريقة خط خلية دبقية في المختبر يمكن أن تستخدم كعلامة جهاز الاستشعار البيولوجي بديلة لاختبار استجابة الدبقية الفئران لمصادر القدرة النووية وكيف دبيقي تفعيل يؤثر على الخلايا المهاد. يهدف على المدى الطويل تطبيق هذا النموذج التحقق من صحة هو لاختبار آثار الملوثات في العالم الحقيقي على صحة الدماغ والأمراض العصبية التنكسية. ونحن نقدم وصفا مفصلا لفي المختبر 96-جيدا شكل فحص لقياس تفعيل دبقية وبقاء الخلية المهاد بعد التعرض لهيئة التصنيع العسكري roglial سائل الإعلام مكيفة.

تقرر تفعيل دبقية بعد التعرض AgNP باستخدام انزيم TNF-α المناعي المرتبط مقايسة (ELISA). لتحديد تأثير تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في خلايا المخ تحت المهاد البصري، وإزالة AgNPs من طاف دبقية (وسائل الإعلام مكيفة) باستخدام جهاز الترشيح. يحتفظ الجهاز الترشيح السيتوكينات في حين باستثناء AgNPs على أساس الحجم. لفترة وجيزة، تم جمع طاف من الخلايا الدبقية الصغيرة تعامل مع أو بدون AgNPs، تضاف إلى المرشحات، وطرد في 14000 x ج لمدة 15 دقيقة. كنا بعد ذلك قادرين على تحديد تأثير السيتوكينات يفرز دبقية على بقاء الخلية المهاد. تم تحديد سمية الخلايا بعد التعرض لوسائل الإعلام مكيفة (التي تحتوي على السيتوكينات) عن طريق فحص القائم على ريسازورين كما هو موضح سابقا 5،6. عملية الأيض خلايا نشطة تحد ريسازورين وتنتج إشارة الفلورسنت يتناسب مع عدد من خلايا قابلة للحياة 7.

الإقليم الشمالي "> هناك العديد من المزايا من استخدام هذه التقنية على الآخرين (مثل ثقافة مشتركة، الاجهزة العابر جيدا، أو في التجارب المجراة). نموذجنا يوفر القدرة على تفعيل مباشرة الخلايا الدبقية الصغيرة وتحديد ما إذا كانت العوامل يفرز سامة للخلايا العصبية 8 . البروتوكول الحالي يستخدم خلدت الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 حفز مع النانوية قطرها 20 نانومتر، وتخليد خلايا المخ تحت المهاد البصري الفئران (المعين mHypo-A1 / 2) 9 لتحديد استجابة لاحقة. وفي الوقت الذي تم تحسين هذا البروتوكول لهذه الشروط محددة، وأساليب يمكن أن يكون تعديلها لاستخدامها في نماذج أخرى من موت الخلايا التي يسببها دبيقي، أو مع أنواع أخرى من الخلايا بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية والخلايا العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. دبقية الصيانة خلية ثقافة

  1. خلية ثقافة المتوسط ​​الدافئة (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط؛ DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين / النيوميسين (PSN) إلى 37 درجة مئوية.
  2. الحصول على الأوراق المالية المجمدة من الخلايا الدبقية BV2 في مرور 18 - 25 من تخزين في -80 درجة مئوية. بسرعة ذوبان الجليد الخلايا في 37 ° C حمام الماء.
  3. نقل بلطف الخلايا إلى 75 سم 2 قارورة تنفيس تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة 10 مل الخلية.
  4. احتضان قارورة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية. وسائل الاعلام نضح بعد 24 ساعة واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. تنمو الخلايا حتى ما يقرب من 70-80٪ confluency.

2. العد والخلايا تصفيح

  1. في حمام مائي 37 ° C، DMEM الدافئة وحل 1X-التربسين- EDTA.
  2. وسائل الإعلام نضح من الخلايا وإضافة 500 ميكرولتر من التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة.
  3. استخدام مكشطة، إزالة الخلايا من القارورة وتعليق في 5 ملمن DMEM. تمر الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل ثلاث مرات.
  4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور 8000 خلية / جيدا في الأسود الجدران أسفل لوحة واضحة في الحجم النهائي من 200 ميكرولتر DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ PSN. احتضان لوحة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  5. إزالة DMEM القديمة واستبدالها مع 200 ميكرولتر من DMEM حرارة تستكمل مع 1٪ PSN إلى المصل تجويع الخلايا الدبقية الصغيرة. احتضان لوحة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

3. تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة

  1. في أنابيب منفصلة، ​​وتمييع AgNPs (0.01، 0.05 أو 0.1 ميكروغرام / مل)، ومركبة / مراقبة محايدة (سيترات الصوديوم، 0.04 ملم) في DMEM المصل خالية تستكمل مع 1٪ PSN لتركيزات العمل النهائية.
  2. إزالة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام من كل بئر واستبدالها مع 100 ميكرولتر من مجمع العلاج المناسب.
  3. احتضان لوحة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

4. فايltering وسائل الإعلام مكيفة

  1. جمع 200 ميكرولتر من طاف وسائل الإعلام من كل بئر ونقل إلى تصفية (الوزن الجزيئي قطع من 10 كيلو دالتون) مع أنبوب جمع (1،5-2 قدرة مل).
  2. أجهزة الطرد المركزي في 14000 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. تجاهل التدفق من خلال (طاف مع الجسيمات) ووضع فلتر رأسا على عقب في أنبوب المجموعة الجديدة.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: أدى وسائل الإعلام التي تمت تصفيتها (التي تحتوي على السيتوكينات يفرز) ويتركز ستة أضعاف.
  5. تبرزي حجم من التركيز إلى 400 ميكرولتر مع DMEM جديدة تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ PSN وتخزينها على الجليد.
    ملاحظة: لضمان إزالة AgNPs المتبقية من وسائل الاعلام التي تمت تصفيتها، وتوليد تركيز AgNP استنادا إلى ذروة مميزة في حوالي 390-420 نانومتر 10. لفترة وجيزة، وإعداد aliquots من AgNPs غير المرشحة (0، 0.01، 0.025، 0.05، 0.1، و 0.2 ميكروغرام / مل كما هو موضح في الخطوة 3.1) وتصفيتهاالسيطرة على السيارة (سيترات الصوديوم، 0.04 ملم) في DMEM المصل خالية. قسامة 50 ميكرولتر من العينات والمعايير التي تمت تصفيتها إلى الأسود محصنة أسفل لوحة واضحة. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وقياس الامتصاصية في 390-410 نانومتر، ومقارنة القراءات لمنحنى التركيز AgNP. إذا عينات تصفيتها لها نفس القيمة الامتصاصية كما العينة السيطرة على السيارة، فإنه يمكن أن يفترض إزالة AgNPs المتبقية.
  6. استخدام نصف من وسائل الإعلام التي تمت تصفيتها لتحديد التعليمات التالية TNF-α إفراز من عدة متاحة تجاريا.

5. المهاد الصيانة خلية ثقافة

  1. الدافئة DMEM زراعة الخلايا المتوسطة تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ PSN إلى 37 درجة مئوية.
  2. الحصول على الأوراق المالية المجمدة من المهاد الخلايا في مرور 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 تخزينها في 80 درجة مئوية. بسرعة ذوبان الجليد الخلايا في 37 ° C حمام الماء.
  3. نقل بلطف الخلايا إلى 75 سم 2 قارورة تنفيس تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة 10 مل الخلية.
  4. احتضان قارورة في 5٪ CO 2

6. تحديد المهاد سمية خلية

  1. DMEM الدافئة وحل 1X-التربسين- EDTA في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  2. وسائل الإعلام نضح من خلايا المخ تحت المهاد البصري وإضافة 500 ميكرولتر من التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة. إزالة الخلايا من قارورة باستخدام مكشطة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.
  3. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ولوحة خلايا المخ تحت المهاد البصري في 5000 خلية / جيدا في الأسود الجدران أسفل لوحة واضحة في الحجم النهائي من DMEM 200 ميكرولتر تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ PSN واحتضان بين عشية وضحاها في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية .
  4. إزالة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام القديمة باستخدام pipetter متعدد القنوات وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام مكيفة تتركز المفلتر وذلك لتركيز النهائي من 1X.
  5. احتضان لوحة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  6. إضافة 221؛ لتر من كاشف ريسازورين واحتضان لوحة لمدة 20 دقيقة في 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
  7. باستخدام مقياس الطيف المتعدد، مضان سجل (560 نانومتر EX / 590 نانومتر EM) لقياس بقاء الخلية. عن النتائج وحدات مضان النسبي (RFU).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتبين لنا أن وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي البديل للاستجابة المخ لالنانوية باستخدام بروتوكول أعلاه. وتشمل نتائجنا قياس التأثيرات السامة لتفعيل دبقية على المصب موت الخلايا العصبية الشكل 1 يدل على سير العمل في بروتوكول لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتحديد ما إذا كان السيتوكينات يفرز تقلل قابلية الخلايا العصبية المهاد. تم زيادة إفراز TNF-α بشكل ملحوظ بعد التعرض AgNP (الشكل 2). عندما تتعرض الخلايا العصبية تحت المهاد البصري إلى وسائل الإعلام مكيفة من تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة AgNP، يتم تقليل بقاء الخلية بشكل ملحوظ (الشكل 3). الشكل 4 الخطوط العريضة لآلية المحتملة التي AgNPs تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتساهم في موت الخلايا المهاد.

شكل 1
الشكليضاف 1. سير العمل لAgNP الترشيح الطريقة. طاف من تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة إلى أجهزة الترشيح وطرد لإزالة AgNPs من وسائل الاعلام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
هل زيادة الرقم 2. TNF-α إفراز بعد التعرض للAgNP. وعولج الخلايا الدبقية BV2 مع التحكم في السيارة أو AgNPs لمدة 2 ساعة. وزيادة إفراز TNF-α بشكل ملحوظ بعد التعرض لAgNPs. وتعرض البيانات كما يعني ± SEM. ** ف <0.001 السيطرة مقابل وفقا لتقييم الطالب ر -test أونبايريد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
هل انخفاض الرقم 3. المهاد بقاء الخلية بعد التعرض للوسائل الإعلام مكيفة دبقية صغيرة، وتظهر خلايا تحت المهاد البصري زيادة موت الخلايا بعد التعرض لوسائل الإعلام مكيفة من الخلايا الدبقية الصغيرة حفز مع AgNP. وتعرض البيانات كما يعني ± SEM. * ف <0.05 مقابل السيطرة وفقا لتقييم الطالب ر -test أونبايريد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. المسار المحتمل للAgNP المستحثة دبقية تفعيل والتأثير على المهاد العصبية. وبعد التعرض لالفضة النانوية، ميكروغراميتم تنشيط ليا للدولة M1 الموالية للالتهابات، والتي تتميز زيادة إفراز والتعبير عن السيتوكينات وصناع الموالية للالتهابات. الافراج عن السيتوكينات وصناع الموالية للالتهابات يساهم في موت الخلايا العصبية المحيطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells/Reagents
Mouse microglial cell line (BV2) Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) ATL03001
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2  Cellutions Biosystems Inc. CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Invitrogen 10313-039
Fetal bovine serum  PAA Labs A15-751
Penicillin/Streptomycin/Neomycin Thermo Fisher Scientific 15640-055
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Silver nanoparticles (20 nm) Sigma-Aldrich 730793

PrestoBlue Cell Viability Reagent		 Invitrogen A13262
Mouse TNF-α ELISA Max Delux Biolegend 430904
Lipopolysaccharide Sigma-Aldrich L4391
Sodium Citrate Sigma-Aldrich S4641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile Thermo Fisher Scientific 165305
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane EMD Millipore UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate Molecular Devices M5
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Corning, Inc
14-432-22
Falcon Cell Strainers 70 μm Corning, Inc 08-771-2
Tabletop centrifuge 5430 Eppendorf 22620560

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
  2. Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
  3. Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
  4. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
  5. Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
  6. Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
  7. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  8. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
  9. Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
  10. Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
  11. Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
  12. Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
  13. Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
  14. Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
  15. Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
  16. Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
  17. Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
  18. Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
  19. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
  20. Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
  21. Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
  22. Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
  23. Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
  24. Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
  25. PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
  26. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  27. McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
  28. Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
  29. Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
  30. Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).

Tags

علم الأعصاب، العدد 116، الخلايا الدبقية الصغيرة، وسائل الإعلام مكيفة، موت الخلايا، جسيمات متناهية الصغر، neuroinflammation، وخلايا المخ تحت المهاد البصري
الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة جهاز الاستشعار البيولوجي الأب البديل لتحديد الجسيمات النانوية العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duffy, C. M., Ahmed, S., Yuan, C.,… More

Duffy, C. M., Ahmed, S., Yuan, C., Mavanji, V., Nixon, J. P., Butterick, T. Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (116), e54662, doi:10.3791/54662 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter