Introduction
Miljømæssige forureninger, specielt dem af nanopartikel (NP) område (1 - 20 nm i diameter), har været forbundet med fedme og andre neurodegenerative sygdomme som følge af evnen til at krydse blod-hjerne barrieren 1-3. Forhøjet udsættes for forurening kan inducere inflammation i centralnervesystemet, herunder hypothalamus 1. En mulig mekanisme, hvor dette sker kunne være gennem nanopartikel induceret aktivering af mikroglia (hjerne immunceller) 4. Tidligere undersøgelser har anvendt in vivo modeller til at studere virkningerne af NP'er på hjernens sundhed, som er tidskrævende, dyre, og som ikke direkte besvare spørgsmålet om, hvordan NP'er påvirke mikroglia. Microglia spiller en mangesidet rolle i det centrale nervesystem, herunder vedligeholdelse af hjernen mikromiljø og kommunikere med omgivende neuroner via frigivelse af udskilte faktorer og cytokiner. Afhængigt af stimuli, kan mikroglia aktiveres til en M1 pro-inflammatoriske eller en M2 antiinflammatorisk tilstand. For eksempel M1 aktiverede mikroglia frigive pro-inflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), mens M2 aktiverede mikroglia frigivelse anti-inflammatoriske cytokiner, herunder interleukin-4 (IL-4). For at validere vores surrogat in vitro biosensor til bestemmelse neurotoksicitet af luftforurenende stoffer, vi målte mikroglial respons på 20 nm sølv nanopartikler (AgNPs). Målet med denne artikel er at beskrive, hvordan en in vitro mikroglial cellelinie kan bruges som et surrogat biosensor markør til test murine mikroglial respons på nationale parlamenter og hvordan mikroglial aktivering påvirker hypothalamus celler. Den langsigtede tilsigtede anvendelse af dette valideret model er at afprøve effekten af den virkelige verden forurenende stoffer på hjernen sundhed og neurodegenerativ sygdom. Vi giver en detaljeret beskrivelse af en in vitro format med 96 brønde assay til måling mikroglial aktivering og hypothalamus celle overlevelse efter eksponering af mic roglial konditionerede medier.
Mikroglial aktivering blev bestemt efter AgNP eksponering ved anvendelse af en TNF-α enzymbundet immunsorbentassay (ELISA). For at bestemme virkningen af aktiveret mikroglia på hypothalamus celler blev AgNPs fjernet fra mikroglial supernatant (konditioneret medium) under anvendelse af en filtreringsanordning. Filtreringen enhed bevarer cytokiner mens eksklusive AgNPs baseret på størrelse. Kort fortalt, supernatanten fra mikroglia behandlet med eller uden AgNPs blev opsamlet, tilsat til filtrene, og centrifugeret ved 14.000 xg i 15 min. Vi kunne derefter bestemme indflydelsen af microgliale secernerede cytokiner på hypothalamus cellelevedygtighed. Celletoksicitet efter udsættelse for konditionerede medier (indeholdende cytokiner) blev bestemt via en resazurin-baseret assay som tidligere beskrevet 5,6. Metabolisk aktive celler reducerer resazurin og producere et fluorescerende signal proportionalt med antallet af levedygtige celler 7.
nt "> Der er flere fordele ved at anvende denne teknik igen andre (såsom co-kultur, trans-well opsætninger, eller in vivo forsøg). Vores model giver mulighed for direkte at aktivere mikroglia og afgøre, om udskilte faktorer er giftige for neuroner 8 . Den nuværende protokol anvendelser udødeliggjort BV2 mikroglia stimuleret med nanopartikler diameter 20 nm, og udødeliggjort murine hypothalamus celler (betegnet mHypo-A1 / 2) 9 til bestemmelse af efterfølgende reaktion. Selvom denne protokol er blevet optimeret til disse specifikke betingelser, metoder kan være ændret til at blive anvendt i andre modeller af mikroglial-induceret celledød, eller med andre celletyper, herunder primære microglia og neuroner.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikroglial Cell Culture Maintenance
- Varm celledyrkningsmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium; DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / neomycin (PSN) til 37 ° C.
- Opnå frossen bestand af BV2 mikrogliaceller ved passage 18 - 25 fra opbevaring ved -80 ° C. Hurtigt tø celler i 37 ° C vandbad.
- Overføre forsigtigt celler til en 75 cm2 udluftet kolbe indeholdende 10 ml cellekulturmedium.
- Inkuber kolbe i 5% CO2 ved 37 ° C. Aspirer medier efter 24 timer og erstatte med friske medier. Grow celler indtil ca. 70 - med 80% konfluens.
2. Counting og Plating celler
- I et 37 ° C vandbad, varmt DMEM og 1x-trypsin-EDTA-opløsning.
- Aspirer medier fra celler og tilføje 500 pi trypsin. Der inkuberes ved 37 ° C til 2 - 5 min.
- Ved hjælp af en skraber, fjerne celler fra kolben og suspendere 5 mlDMEM. Pass celler gennem en 70 um si i et 50 ml rør tre gange.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og frø 8.000 celler / brønd i en sort walled klar bundplade i et endeligt volumen på 200 pi DMEM suppleret med 10% FBS og 1% PSN. Inkubér pladen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
- Fjern gamle DMEM og erstatte med 200 pi opvarmet DMEM suppleret med 1% PSN til serum sulte mikroglia. Inkubér pladen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
3. Aktivering Mikroglia
- I separate rør, fortyndes AgNPs (0,01, 0,05 eller 0,1 ug / ml) og køretøj / neutral kontrol (natriumcitrat, 0,04 mM) i serum-frit DMEM suppleret med 1% PSN til endelige arbejdsbetingelser koncentrationer.
- Fjern 100 pi medium fra hver brønd og udskiftes med 100 pi passende behandling forbindelse.
- Inkubér pladen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
4. Filtering konditionerede medier
- Indsaml 200 pi medier supernatant fra hver brønd og overføres til et filter (molekylvægtafskæring på 10 kDa) med opsamlingsrør (1,5 til 2 ml kapacitet).
- Centrifuger ved 14.000 xg ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Kassér gennemløbet (supernatant med partikler) og placere filteret på hovedet ind i en ny opsamlingsrør.
- Centrifuger ved 1.000 xg ved stuetemperatur i 2 minutter.
BEMÆRK: Det resulterende filtrerede medier (indeholdende udskilles cytokiner) koncentreres ved seks gange. - Bringe volumenet af koncentratet til 400 pi med frisk DMEM suppleret med 10% FBS og 1% PSN og opbevares på is.
BEMÆRK: For at sikre resterende AgNPs fjernes fra filtrerede medier, generere en AgNP koncentration baseret på den karakteristiske top på omkring 390-420 nm 10. Kort beskrevet forberede alikvoter af ufiltrerede AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 og 0,2 ug / ml som beskrevet i trin 3.1) og filtreretvehikelkontrol (natriumcitrat, 0,04 mM) i serum-frit DMEM. Aliquot 50 pi filtrerede prøver og standarder til en sort walled klar bundplade. Ved hjælp af et spektrofotometer, måle absorbans ved 390-410 nm og sammenligne aflæsninger til AgNP koncentrationen kurve. Hvis filtrerede prøver har samme absorbansværdi som køretøjet kontrolprøven, kan det antages resterende AgNPs fjernes. - Brug halvdelen af de filtrerede medier til at bestemme TNF-α sekretion følgende instruktioner fra et kommercielt tilgængeligt kit.
5. Hypothalamus Cell Culture Maintenance
- Varm DMEM cellekulturmedium suppleret med 10% FBS og 1% PSN til 37 ° C.
- Opnå frossen stamopløsning af hypothalamus (mHypo-A1 / 2) celler ved passage 18 - 25 lagret ved 80 ° C. Hurtigt tø celler i 37 ° C vandbad.
- Overføre forsigtigt celler til en 75 cm2 udluftet kolbe indeholdende 10 ml cellekulturmedium.
- Inkuber kolbe i 5% CO2
6. Bestemmelse Hypothalamus celletoksicitet
- Varm DMEM og 1x-trypsin-EDTA-opløsning i et 37 ° C vandbad.
- Aspirer medier fra hypothalamus celler og tilføje 500 pi trypsin. Der inkuberes ved 37 ° C til 2 - 5 min. Fjerne celler fra kolben med en skraber som beskrevet ovenfor i trin 2.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og plade hypothalamiske celler ved 5.000 celler / brønd i en sort walled klar bundplade i et endeligt volumen på 200 pi DMEM suppleret med 10% FBS og 1% PSN og inkuberes natten over i 5% CO2 ved 37 ° C .
- Fjern 100 pi gamle medier ved anvendelse af en multikanal pipette og tilsæt 100 pi filtrerede koncentrerede konditionerede medier, til en slutkoncentration på 1 x.
- Inkubér pladen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
- Tilføj 221 l af resazurin reagens og inkuberes pladen i 20 minutter i 5% CO2 ved 37 ° C.
- Ved hjælp af en multimode spektrofotometer, rekord fluorescens (560 nm EX / 590 nm EM) til at måle cellernes levedygtighed. Rapporter resultater som relative fluorescensenheder (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser, at mikroglia fungerer som et surrogat biosensor for hjernens reaktion på nanopartikler ved anvendelse af protokollen ovenfor. Vores resultater omfatter måling af de toksiske virkninger af mikroglial aktivering på downstream neuronal celledød. Figur 1 viser en arbejdsproces af protokollen til at aktivere mikroglia og afgøre, om der udskilles cytokiner reducere levedygtighed hypothalamus neuroner. TNF-α-sekretion blev signifikant øget efter AgNP eksponering (figur 2). Når hypothalamiske neuroner udsættes for konditionerede medier fra AgNP-aktiverede mikroglia, er cellelevedygtighed reduceres betydeligt (figur 3). Figur 4 skitserer den potentielle mekanisme, hvor AgNPs aktivere mikroglia og bidrage til hypothalamus celledød.
Figur1. Workflow for AgNP Filtration metode. Supernatant fra aktiveret mikroglia føjes til filtrering enheder og centrifugeres for at fjerne AgNPs fra medierne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. TNF-α Sekretion forøges Efter AgNP Exposure. Mikrogliaceller BV2-celler blev behandlet med vehikelkontrol eller AgNPs i 2 timer. TNF-α-sekretion blev øget markant efter udsættelse for AgNPs. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. ** p <0,001 vs. kontrol vurderet ved Students uparrede t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Hypothalamus Cellelevedygtighed Reduceret Efter microgliale konditioneret Media Eksponering. Hypothalamus celler viser øget celledød efter udsættelse for konditioneret medier fra mikroglia stimuleret med AgNP. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. * P <0,05 vs. kontrol vurderet ved Students uparrede t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Potentiel Pathway af AgNP induceret microgliale Aktivering og Indflydelse på Hypothalamus Neurotoksicitet. Efter udsættelse for sølv nanopartikler, mikroglia aktiveres til en M1 pro-inflammatorisk tilstand, kendetegnet ved øget sekretion og ekspression af pro-inflammatoriske cytokiner og temaskine. Frigivelsen af de pro-inflammatoriske cytokiner og beslutningstagere bidrager til omgivende neuronal celledød. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
