Introduction
Pollutions environnementales, en particulier celles de la nanoparticule (NP) Plage (1 - diamètre 20 nm), ont été liés à l' obésité et d' autres maladies neurodégénératives en raison de la capacité à traverser la barrière hémato - encéphalique 1-3. Exposition élevée à la pollution peut induire une inflammation dans le système nerveux central , y compris l'hypothalamus 1. Un mécanisme potentiel dans lequel cela se produit pourrait être par nanoparticule induite par l' activation de la microglie (cellules immunitaires du cerveau) 4. Des études antérieures ont utilisé des modèles in vivo pour étudier les effets des IP sur la santé du cerveau qui sont de temps, coûteux, et ne répond pas directement à la question de la façon dont les IP influencent la microglie. Les microglies jouent un rôle multiple dans le système nerveux central, y compris la maintenance du microenvironnement du cerveau et de communiquer avec entourant les neurones via la libération de facteurs sécrétés et cytokines. En fonction des stimuli microglie peut être activé pour une pr M1o-inflammatoire ou un état anti-inflammatoire M2. Par exemple, M1 activé microglie libèrent des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), alors que la microglie activée M2 libèrent des cytokines anti-inflammatoires, y compris l'interleukine-4 (IL-4). Pour valider notre substitut en biocapteur vitro pour déterminer la neurotoxicité des polluants atmosphériques, nous avons mesuré la réponse microgliale 20 nanoparticules d' argent nm (de AGNPS). Le but de cet article est de décrire comment une lignée de cellules microgliales in vitro peut être utilisé comme un marqueur de biocapteur de substitution pour tester la réponse microgliale murine aux IP et comment la microglie activation affecte les cellules hypothalamiques. Le long terme destiné application de ce modèle validé est de tester les effets des polluants du monde réel sur la santé du cerveau et les maladies neurodégénératives. Nous fournissons une description détaillée d'un in vitro essai de 96 puits de format pour mesurer l' activation de la microglie et la survie des cellules hypothalamique suite à l'exposition des micro roglial milieu conditionné.
activation microgliale a été déterminée après une exposition AGNP utilisant une enzyme TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Pour déterminer l'effet de la microglie activée sur les cellules hypothalamiques, les AGNPS ont été retirés du surnageant microgliales (milieu conditionné) en utilisant un dispositif de filtration. Le dispositif de filtration retient les cytokines tout en excluant les AGNPS en fonction de leur taille. En bref, le surnageant de cellules microgliales traitées avec ou sans AGNPS a été recueilli, ajouté aux filtres et centrifugée à 14 000 xg pendant 15 min. Nous étions alors en mesure de déterminer l'influence de cytokines sécrétées microgliales sur la viabilité des cellules hypothalamique. Toxicité cellulaire après une exposition à des milieux conditionnés (contenant des cytokines) a été déterminée par un dosage à base de résazurine, comme décrit précédemment 5,6. Cellules métaboliquement actives réduisent résazurine et de produire un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables 7.
nt "> Il y a plusieurs avantages de l' utilisation de cette technique par rapport à d' autres (comme co-culture, les configurations trans puits, ou dans des expériences in vivo). Notre modèle offre la possibilité d'activer directement les microglies et de déterminer si les facteurs sécrétés sont toxiques pour les neurones 8 . Le protocole actuel utilise immortalisé microglie de BV2 stimulée avec des nanoparticules de 20 nm de diamètre, et cellules immortalisées hypothalamiques murins (désigné mHypo-A1 / 2) 9 pour la détermination de la réponse ultérieure. Bien que ce protocole a été optimisé pour ces conditions spécifiques, les méthodes peuvent être modifiées pour être utilisées dans d'autres modèles de la mort cellulaire induite par la microglie, ou avec d'autres types de cellules, y compris les microglies et les neurones primaires.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microglial Maintenance Cell Culture
- Milieu de culture cellulaire chaude (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine / néomycine (PSN) à 37 ° C.
- Obtenir stock congelé des cellules microgliales BV2 au passage 18 - 25 de stockage à -80 ° C. Rapidement décongeler les cellules dans 37 ° C bain d'eau.
- Le transfert en douceur les cellules dans un flacon de 75 cm2 ventilé contenant 10 ml de milieux de culture cellulaire.
- Incuber flacon à 5% de CO 2 à 37 ° C. Aspirer les médias après 24 h et le remplacer par du milieu frais. Cultiver les cellules jusqu'à environ 70 - 80% de confluence.
2. Comptage et Cellules Placage
- Dans un bain-marie à 37 ° C, DMEM chaude et une solution 1x-trypsine-EDTA.
- Aspirer le milieu de cellules et ajouter 500 pi de trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 2 à 5 min.
- À l'aide d'une raclette, d'éliminer les cellules de la fiole et mettre en suspension dans 5 mlde DMEM. Passer les cellules à travers un tamis de 70 um dans un tube de 50 ml à trois reprises.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et épépiner 8000 cellules / puits dans un noir murées plaque de fond clair dans un volume final de 200 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% PSN. Incuber plaque dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.
- Enlevez le vieux DMEM et le remplacer par 200 ul de DMEM réchauffé additionné de 1% PSN au sérum de faim microglie. Incuber plaque dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.
3. Activation Microglia
- Dans des tubes séparés, on dilue AGNPS (0,01, 0,05 ou 0,1 pg / ml) et un véhicule / contrôle neutre (citrate de sodium, 0,04 mM) dans du milieu DMEM sans sérum supplémenté avec 1% PSN à une concentration de travail finale.
- Retirer 100 ul de milieu de chaque puits et les remplacer par 100 ul de composé de traitement approprié.
- Incuber plaque dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.
4. Filtrage Médias Conditionné
- Recueillir 200 pl de surnageant de chaque puits de support et de transfert dans un filtre (coupure de masse moléculaire de 10 kDa) avec un tube de collecte (de 1,5 à 2 ml de capacité).
- Centrifuger à 14000 xg à la température ambiante pendant 15 min.
- Jeter l'écoulement (surnageant avec des particules) et placer le filtre à l'envers dans un nouveau tube de collecte.
- Centrifuger à 1000 xg à température ambiante pendant 2 min.
NOTE: Les médias filtré résultant (contenant des cytokines sécrétées) est concentrée par six fois. - Amener le volume du concentré à 400 ul avec du DMEM frais complété avec 10% de FBS et 1% PSN et de stocker de la glace.
REMARQUE: Pour AGNPS résiduels sont éliminés des médias filtrés, générer une concentration AGNP sur la base du pic caractéristique à environ 390-420 nm 10. En bref, préparer des aliquotes de AGNPS non filtrés (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, et 0,2 pg / ml comme décrit dans l'étape 3.1) et filtrécontrôle du véhicule (citrate de sodium, 0,04 mM) dans du milieu DMEM sans sérum. Aliquoter 50 ul d'échantillons et les étalons filtrés dans un noir murées plaque de fond clair. L'utilisation d'un spectrophotomètre, mesurer l'absorbance à 390-410 nm et comparer les lectures à la courbe de concentration AGNP. Si les échantillons filtrés ont la même valeur que l'absorbance de l'échantillon témoin du véhicule, on peut supposer AGNPS résiduels sont éliminés. - Utilisez la moitié des médias filtrés pour déterminer le TNF-α sécrétion instructions suivantes à partir d'un kit disponible dans le commerce.
5. hypothalamo Entretien de culture cellulaire
- Chaud DMEM milieu de culture cellulaire supplémenté avec 10% de FBS et 1% PSN à 37 ° C.
- Obtenir stock congelé de hypothalamique cellules au passage 18 (mHypo-A1 / 2) - 25 stockées à 80 ° C. Rapidement décongeler les cellules dans 37 ° C bain d'eau.
- Le transfert en douceur les cellules dans un flacon de 75 cm2 ventilé contenant 10 ml de milieux de culture cellulaire.
- Incuber ballon à 5% de CO 2
6. Détermination de la toxicité cellulaire hypothalamique
- DMEM chaud et une solution 1x-trypsine-EDTA dans un bain d'eau à 37 ° C.
- Aspirer le milieu de cellules hypothalamiques et ajouter 500 pi de trypsine. Incuber à 37 ° C pendant 2 à 5 min. Retirer les cellules du flacon à l'aide d'un grattoir tel que décrit ci-dessus à l'étape 2.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et plaque cellules hypothalamiques à 5000 cellules / puits dans un noir murées plaque de fond clair dans un volume final de 200 ul DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% PSN et incuber une nuit à 5% de CO 2 à 37 ° C .
- Prélever 100 ul d'anciens supports en utilisant un pipetteur multi-canal et ajouter 100 ul de milieu conditionné concentré filtré, jusqu'à une concentration finale de 1 x.
- Incuber plaque dans 5% de CO 2 à 37 ° C pendant 24 heures.
- Ajouter 221; l de réactif de résazurine et incuber la plaque pendant 20 min dans 5% de CO 2 à 37 ° C.
- À l'aide d'un spectrophotomètre multimodes, fiche fluorescence (560 nm EX / 590 nm EM) pour mesurer la viabilité cellulaire. Rapport des résultats comme des unités de fluorescence relative (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous montrons que la fonction microglies comme un biocapteur de substitution pour la réponse du cerveau à des nanoparticules en utilisant le protocole ci-dessus. Nos résultats incluent la mesure des effets toxiques de l' activation de la microglie sur la mort des cellules neuronales en aval. La figure 1 montre un flux de travail du protocole pour activer la microglie et de déterminer si les cytokines sécrétées réduisent la viabilité des neurones hypothalamiques. TNF-α la sécrétion a été significativement augmentée après exposition AGNP (Figure 2). Lorsque les neurones hypothalamiques sont exposés à des milieux conditionnés à partir de la microglie activée AGNP, la viabilité cellulaire est réduite de façon significative (Figure 3). La figure 4 présente le mécanisme de potentiel dans lequel AGNPS activer la microglie et contribuent à la mort cellulaire hypothalamique.
Figure1. Workflow pour AGNP méthode de filtration. Surnageant de microglie activé est ajouté à des dispositifs de filtration et centrifugé pour éliminer AGNPS des médias. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. TNF-α Sécrétion est augmentée Après exposition AGNP. Cellules microgliales BV2 ont été traités avec le contrôle du véhicule ou AGNPS pendant 2 heures. TNF-α la sécrétion a été significativement augmentée après exposition à AGNPS. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. ** p <0,001 vs contrôle évaluée par apparié t -test de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. hypothalamo Viabilité cellulaire est réduite après une exposition médiatique microglial conditionné. Cellules hypothalamiques montrent la mort cellulaire accrue suite à une exposition à des milieux conditionnés à partir de microglie stimulées avec AGNP. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. * P <0,05 par rapport au témoin comme évalué par apparié t -test de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Pathway Potentiel de AGNP Induced microglial Activation et influence sur hypothalamo neurotoxicité. Après l' exposition à des nanoparticules d' argent, microglia sont activés à un état pro-inflammatoire M1, caractérisé par une sécrétion accrue et l'expression des cytokines et les responsables pro-inflammatoires. La libération des cytokines et les responsables pro-inflammatoires contribue à entourant la mort des cellules neuronales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
