Introduction
환경 오염은 특히 나노 입자 (NP)의 범위들 (1-20 nm의 직경), 비만 및 혈액 뇌 장벽 1-3을 통과 할 수있는 능력으로 인해 다른 신경 퇴행성 질환과 관련이있다. 오염에 대한 높은 노출은 시상 하나를 포함하는 중추 신경계의 염증을 유발할 수있다. 이 미세 아교 세포의 나노 입자 유도 활성화 (뇌 면역 세포) (4)를 통해 할 수 발생하는 하나의 잠재적 인 메커니즘. 선행 연구는 시간 소모, 고가 뇌의 건강에 NP에의 영향을 연구하기 위해 생체 내 모델에서 사용한 직접 NPS에서 미세 아교 세포에 영향을 미치는 방법에 대한 질문에 응답하지 않는다. 미세 아교 세포는 뇌의 미세 환경의 유지를 포함하여 분비 인자 및 사이토 카인의 방출을 통해 신경 주변 통신, 중추 신경계 다각적 역할을한다. 자극에 따라, 미세 아교 세포는 M1 홍보에 활성화 될 수있다오 염증 또는 M2 항 염증 상태. M2는 인터루킨 -4 (IL-4)를 포함하여 미세 아교 세포 분리 항 염증성 사이토 카인으로 활성화 예를 들어, M1은, 미세 아교 세포는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)와 같은 염증성 사이토 카인 방출 활성화. 대기 오염 물질의 신경 독성을 결정하기위한 시험 관내 바이오 센서 우리의 대리를 확인하기 위해, 우리는 20 nm의 나노 입자 (AGNPS)에 소교 반응을 측정했다. 이 문서의 목적은 시험 관내 소교 세포주가 NP에에 쥐 소교 반응을 테스트하는 방법과 미세 아교 활성화가 시상 하부 세포에 영향을 미치는위한 대리 바이오 마커로 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 장기는이 검증 된 모델의 응용 프로그램이 뇌 건강과 신경 퇴행성 질환에 대한 실제 오염 물질의 효과를 테스트하는 것입니다 예정. 우리는 마이크의 노출 후 미세 아교 활성화 및 시상 세포 생존율을 측정하기위한 시험 관내 96 웰 형식 분석의 상세한 설명을 제공한다 에어컨 미디어를 roglial.
소교 활성화는 (ELISA)을 면역 측정법 링크 된 TNF-α의 효소를 사용하여 노광 AgNP 따라 결정 하였다. 시상 세포에서 활성화 된 미세 아교 세포의 효과를 결정하기 위해 AGNPS는 여과 장치를 이용하여 상층 액 소교 (조정 배지)에서 제거 하였다. 크기에 따라 AGNPS을 배제하면서 여과 장치 사이토킨을 유지한다. 간단히, AGNPS 또는 처리없이 미세 아교 세포의 상등액을 수거 필터에 첨가하고, 15 분 동안 14,000 × g으로 원심 분리 하였다. 그런 다음 시상 세포 생존에 소교 분비 된 사이토 카인의 영향을 확인할 수 있었다. 이전 5,6 설명 된대로 에어컨 미디어 (포함하는 사이토 카인)에 노출 된 후 세포 독성은 레사 주린 기반 분석을 통해 측정 하였다. 대사 적 활성 세포 레사 주린을 줄이고 생세포 (7)의 수에 비례하여 형광 신호를 생성한다.
NT "> (예, 또는 생체 내 실험에서 공동 배양 트랜스 웰 설정 등) 등을 통해이 기술을 사용하여 여러 가지 이점이있다. 우리의 모델은 직접적으로 미세 아교 세포 활성화 및 분비 인자 뉴런 8 독성 여부를 결정하는 능력을 제공한다 . 현재의 프로토콜은 불후의 BV2의 미세 아교 세포는 쥐의 시상 하부 세포를이 프로토콜은 이러한 특정 조건에 최적화되었지만 (지정하는 mHypo-A1 / 2) 이후의 반응의 결정에 대한 9., 방법이 될 수 있습니다 20 나노 미터 직경의 나노 입자로 자극하고, 불멸 사용합니다 변경된은 소교에 의한 세포 사멸의 다른 모델에 사용, 또는 기본 미세 아교 세포와 신경 세포를 포함한 다른 세포 유형으로합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 소교 세포 배양 유지 보수
- 따뜻한 세포 배양 배지 (둘 베코 변형 이글 중간; DMEM) 37 ° C로 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신 (PSN)로 보충.
- -80 ° C에서 저장 25 - 통로 (18)에 BV2 소교 세포의 냉동 주식을 얻습니다. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동.
- 조심스럽게 10 ㎖ 세포 배양 배지를 포함하는 75cm 2 배기 플라스크에 세포를 옮긴다.
- 37 ° C에서 5 % CO 2에서 플라스크를 품어. 기음 미디어 24 시간 후 신선한 용지로 교체합니다. 80 % 컨 플루 - 약 70 때까지 세포를 성장.
2. 계수 및 도금 세포
- 37 ° C의 물을 욕조, 따뜻한 DMEM과 1 배 - 트립신 EDTA 용액합니다.
- 세포에서 대기음 매체와 트립신의 500 μl를 추가합니다. 5 분 - 2 37 ° C에서 품어.
- 스크레이퍼를 사용하여 플라스크로부터 세포를 제거하고, 5 ml의 정지DMEM의. 50 ML 튜브에 세 번 70 μm의 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다.
- 혈구 세포를 사용하여 계산하고, 10 % FBS, 1 %의 PSN이 보충 된 DMEM을 200㎕의 최종 부피에서 선명한 바닥 판 성벽 / 웰 블랙 8000 세포를 시드. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 판을 품어.
- 오래 된 DMEM를 제거하고 미세 아교 세포를 굶어 혈청 1 %의 PSN 보충 따뜻하게 DMEM 200 μL로 교체합니다. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 판을 품어.
3. 활성화 미세 아교 세포
- 별도의 튜브에 AGNPS 희석 (0.01, 0.05, 0.1 μg의 / mL) 및 비히클 / 중립 제어 최종 작업 농도 1 % PSN이 보충 된 무 혈청 DMEM에서 (구연산 나트륨, 0.04 mm)이다.
- 각 우물에서 미디어 100 μl를 제거하고 적절한 치료 화합물 100 ㎕로 교체합니다.
- 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 판을 품어.
4. 인터넷금연실 미디어 ltering
- 각에서 미디어 상층 액 200 μl를 잘 수집하고 수집 관 (1.5-2 ml의 용량)와 필터 (10 kDa의 분자량 차단)로 전송합니다.
- 실온에서 15 분 동안 14,000 × g으로 원심 분리기.
- 플로우를 통해 (입자 상층 액)을 버리고 새 컬렉션 튜브에 필터 거꾸로 놓습니다.
- 2 분 동안 실온에서 1,000 XG에 원심 분리기.
참고 : 결과 필터링 미디어는 (분비되는 사이토 카인을 포함) 6 배 농축한다. - 얼음에 10 % FBS와 1 % PSN 저장 보충 된 신선한 DMEM 400 ㎕의 농축액의 양을 준비한다.
주 : - 420 내지 약 10 nm (390)에서 특징적인 피크에 근거 AgNP 농도, 잔류 AGNPS 여과 매체로부터 제거되도록 생성한다. (3.1 단계에 설명 된대로 0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 ㎍ / ㎖) 및 여과 요약하면, 필터링되지 않은 AGNPS의 분취 량을 준비차량 제어 무 혈청 DMEM에서 (구연산 나트륨, 0.04 mm)이다. 나누어지는 검은 색으로 필터링 된 시료와 표준의 50 μl를 명확 바닥 판을 벽으로 둘러싸인. 분광 광도계를 사용하여 390에서의 흡광도를 측정 - 410 nm의 상기 AgNP 농도 곡선 판독을 비교한다. 필터링 된 샘플은 차량 제어 샘플과 동일한 흡광도 값을 갖는 경우, 잔여 AGNPS 제거한 것으로 가정 할 수있다. - 시중에서 판매하는 키트에서 TNF-α 분비 다음 지시 사항을 결정하기 위해 여과 매체의 절반을 사용합니다.
5. 시상 하부 세포 배양 유지 보수
- 따뜻한 DMEM 세포 배양 배지는 37 ° C로 10 % FBS와 1 % PSN 보충.
- 80 ° C에서 보관 25 - 시상 하부의 냉동 재고 (mHypo-A1 / 2) 통로 (18)에 세포를 얻습니다. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동.
- 조심스럽게 10 ㎖ 세포 배양 배지를 포함하는 75cm 2 배기 플라스크에 세포를 옮긴다.
- CO 2 5 %에 플라스크를 품어
6. 확인 시상 하부의 세포 독성
- 따뜻한 DMEM과 37 ° C의 물을 욕조에 1 배 - 트립신 EDTA 솔루션입니다.
- 시상 하부 세포에서 대기음 매체와 트립신의 500 μl를 추가합니다. 5 분 - 2 37 ° C에서 품어. 2 단계에서 상술 한 바와 같이 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 제거합니다.
- 혈구를 이용하여 세포 수를 계산하고, 10 % FBS, 1 % PSN 보충을 200㎕ DMEM 최종 부피에 클리어 바닥 판 성벽 / 웰 블랙 5000 세포에서 시상 세포 플레이트 및 37 ℃에서 5 % CO 2에서 하룻밤 부화 .
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 이전 미디어 100 ㎕를 제거하고 1 배의 최종 농도로 여과하고, 농축 된 배지 100 ㎕를 추가한다.
- 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 판을 품어.
- 22 추가1; 레사 주린 시약 L 및 37 ℃에서 5 % CO 2에서 20 분 동안 플레이트를 배양한다.
- 멀티 모드 분광 광도계, 기록 형광 (560 nm의 EX / 590 나노 EM)을 사용하여 세포 생존율을 측정합니다. 상대 형광 단위 (RFU) 등의 결과를보고합니다.
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Representative Results
우리는 위의 프로토콜을 사용하여 나노 입자에 대한 뇌의 반응에 대한 대리 바이오 센서 등이 미세 아교 세포의 기능을 보여줍니다. 우리의 결과는 다운 스트림 신경 세포 사멸에 소교 활성화의 독성 효과의 측정을 포함한다. (1) 미세 아교 세포를 활성화하고 분비되는 사이토 카인은 시상 하부 신경 세포의 생존을 줄일 수 있는지를 확인하는 프로토콜의 워크 플로를 보여줍니다. TNF-α 분비가 크게 AgNP 노출 (그림 2) 다음과 같은 증가 하였다. 시상 하부 뉴런 AgNP 활성화 된 미세 아교 세포의 조정 배지에 노출되는 경우, 세포 생존율이 상당히 (도 3) 감소된다. 4 AGNPS는 미세 아교 세포 활성화 및 시상 세포 사망에 기여하는 전위기구를 설명도.
그림활성화 된 미세 아교 세포에서 AgNP 여과 방법. 뜨는 1. 워크 플로우 여과 장치에 추가 미디어에서 AGNPS을 제거하기 위해 원심 분리된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 TNF-α 분비 AgNP 노출 후 증가된다. 소교 BV2 세포 차량 제어 또는 제 2 시간 동안 AGNPS 처리 하였다. TNF-α의 분비는 현저 AGNPS에 노출 후 증가되었다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. ** p <학생의 짝 t의 -test에 의해 평가로 0.001 대 제어 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 시상 하부의 세포 생존 능력은 소교 금연실 미디어 노출에 따라 감소된다. 시상 하부 세포 AgNP 자극 미세 아교 세포에서 에어컨 미디어에 노출 된 후 증가 된 세포의 죽음을 보여줍니다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. * P <컨트롤 대 0.05 학생의 짝 t의 -test에 의해 평가로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시상 하부 신경 독성에 그림 4. 잠재적 AgNP 유도 소교 활성화의 통로 및 영향. 실버 나노 입자에 노출 된 후, 마이크로 그램LIA는 증가 분비 및 염증성 사이토 카인 및 업체의 발현에 의해 특징, M1 염증성 상태로 활성화됩니다. 친 염증성 사이토 카인 및 업체의 릴리스는 신경 세포의 죽음을 둘러싼에 기여한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
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