Introduction
Miljømessige forurensninger, spesielt de av nanopartikkel (NP) område (1 - 20 nm i diameter), har vært knyttet til fedme og andre nevrodegenerative sykdommer som skyldes evnen til å krysse blod-hjerne barrieren 1-3. Forhøyet eksponering for forurensning kan indusere inflammasjon i sentralnervesystemet, inkludert hypothalamus 1. En mulig mekanisme hvor dette skjer kan være gjennom nanopartikkel indusert aktivering av microglia (hjerneimmunceller) 4. Tidligere studier har brukt in vivo modeller for å studere effekter av NPs på hjernen helse som er tidkrevende, dyrt og ikke direkte svar på spørsmålet om hvordan NPs påvirke microglia. Mikroglia spille en mangesidig rolle i sentralnervesystemet, blant annet vedlikehold av hjerne mikromiljøet og kommuniserer med omgivende neuroner via frigjøring av utskilte faktorer og cytokiner. Avhengig av stimuli, kan mikroglia aktiveres til en M1 pro-inflammatorisk eller en M2 anti-inflammatorisk tilstand. For eksempel, M1 aktiverte mikroglia frigi pro-inflammatoriske cytokiner slik som tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), mens M2 aktiverte mikroglia frigivelse anti-inflammatoriske cytokiner, inkludert interleukin-4 (IL-4). For å validere vår surrogat in vitro biosensor for å bestemme nevro av luftforurensning, vi målte microglial respons på 20 nm sølv nanopartikler (AgNPs). Målet med denne artikkelen er å beskrive hvordan en in vitro microglial cellelinje kan brukes som et surrogat biosensor markør for testing muse microglial respons på NPs og hvordan microglial aktivisering påvirker hypothalamus celler. Den langsiktige tiltenkt anvendelse av denne validert modellen er å teste effekten av virkelige forurensninger på hjernen helse og nevrodegenerativ sykdom. Vi gir en detaljert beskrivelse av en in vitro 96-brønners format undersøkelse for å måle microglial aktivering og hypotalamus celleoverlevelse etter eksponering av mikrofonen roglial klimaanlegg medier.
Microglial aktivering ble bestemt etter AgNP eksponering ved hjelp av en TNF-α enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA). For å bestemme virkningen av aktiverte mikroglia på hypotalamus-celler, ble AgNPs fjernet fra microglial supernatant (kondisjonert medium) ved hjelp av en filtreringsanordning. Den filtrering enhet beholder cytokiner mens utelukke AgNPs basert på størrelse. I korthet supernatant fra mikroglia behandlet med eller uten AgNPs ble oppsamlet, tilsatt til filtrene, og sentrifugert ved 14 000 xg i 15 min. Vi var da i stand til å bestemme påvirkning av mikrogliaceller utskilt cytokiner på hypothalamus celle levedyktighet. Celle toksisitet etter eksponering til kondisjonert medium (inneholdende cytokiner) ble bestemt ved hjelp av en resazurin-basert assay som tidligere beskrevet 5,6. Metabolsk aktive celler redusere resazurin og frembringe et fluorescerende signal proporsjonal med antallet levedyktige celler 7.
nt "> Det er flere fordeler med å bruke denne teknikken fremfor andre (slik som ko-kultur, trans-brønners oppsett, eller in vivo-forsøk). Vår modell gjør det mulig å direkte aktivere mikroglia og bestemme om utskilt faktorer er toksisk for nevroner 8 . Den nåværende protokollen bruker udødelig BV2 microglia stimulert med 20 nm diameter nanopartikler, og udødelig murine hypothalamus celler (betegnet mHypo-A1 / 2) 9 for bestemmelse av påfølgende reaksjon. Selv om denne protokollen er optimalisert for disse konkrete forholdene, metodene kan være endret for å bli brukt i andre modeller av microglial-indusert celledød, eller med andre celletyper, inkludert primære mikroglia og nerveceller.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. microglial Cell Culture Vedlikehold
- Varm cellekulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle-medium, DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / neomycin (PSN) til 37 ° C.
- Skaff frossen lager av BV2 mikrogliaceller celler ved passering 18 - 25 fra lagring ved -80 ° C. Hurtig tines celler i 37 ° C vannbad.
- Forsiktig overføre celler til en 75 cm2 kolbe luftes inneholdende 10 ml cellekulturmedier.
- Inkuber kolbe i 5% CO2 ved 37 ° C. Sug media etter 24 timer og erstatte med nye medier. Grow cellene til ca 70 - 80% sammenflytning.
2. Opptelling og Plating Cells
- I et 37 ° C vannbad, varm DMEM og 1x-trypsin-EDTA-oppløsning.
- Sug media fra cellene og legge 500 mL av trypsin. Inkuber ved 37 ° C i 2 - 5 min.
- Ved hjelp av en skrape, fjerne celler fra kolben og suspendere i 5 mlDMEM. Passere cellene gjennom et 70 um sil inn i et 50 ml rør tre ganger.
- Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og frø 8000 celler / brønn i et sort vegger klar bunnplate i et sluttvolum på 200 ul DMEM supplert med 10% FBS og 1% PSN. Inkuber platen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
- Fjern gamle DMEM og erstatte med 200 ul varmet DMEM supplert med 1% PSN til serum sulte microglia. Inkuber platen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
3. Aktivering Microglia
- I separate rør, fortynnet AgNPs (0,01, 0,05 eller 0,1 ug / ml) og kjøretøyet / nøytral-kontroll (natriumcitrat, 0,04 mM) i serumfritt DMEM supplementert med 1% PSN til endelig arbeidskonsentrasjoner.
- Fjern 100 mL av media fra hver brønn og erstatte med 100 ul riktig behandling sammensatte.
- Inkuber platen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
4. Fifiltrerende kondisjonerte medier
- Samle 200 ul media supernatant fra hver brønn og overføring til et filter (molekylvektsperre på 10 kDa) med oppsamlingsrør (1,5 til 2 ml kapasitet).
- Sentrifuger ved 14.000 xg ved romtemperatur i 15 min.
- Kast gjennomstrømnings (supernatant med partikler) og plasser den opp ned inn i en ny samling rør.
- Sentrifuger ved 1000 xg ved romtemperatur i 2 min.
MERK: Den resulterende filtrert media (som inneholder utskilt cytokiner) er konsentrert ved seksdoblet. - Bringe volumet av konsentratet til 400 pl med frisk DMEM supplert med 10% FBS og 1% PSN og lagre på is.
MERK: For å sikre gjenværende AgNPs fjernes fra filtrert media, generere en AgNP konsentrasjon basert på den karakteristiske topp på ca 390-420 nm 10. I korthet fremstille alikvoter av ufiltrerte AgNPs (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 og 0,2 ug / ml som beskrevet i trinn 3.1) og filtrertbærerkontroll (natriumcitrat, 0,04 mM) i serumfritt DMEM. Delmengde 50 mL av filtrerte prøver og standarder i en svart vegger klar bunnplaten. Ved hjelp av et spektrofotometer, måle absorbans ved 390-410 nm og sammenligne målinger til AgNP konsentrasjonskurven. Hvis filtrerte prøver har den samme verdi som absorbans kjøretøyet kontrollprøve, kan det antas gjenværende AgNPs fjernes. - Bruk halvparten av de filtrerte media for å bestemme TNF-α sekresjon følgende instruksjoner fra en kommersielt tilgjengelig kit.
5. hypothalamus Cell Culture Vedlikehold
- Varm DMEM cellekulturmedium supplert med 10% FBS og 1% PSN til 37 ° C.
- Skaff frossen lager av hypothalamus (mHypo-A1 / 2) cellene ved passasje 18-25 lagret ved 80 ° C. Hurtig tines celler i 37 ° C vannbad.
- Forsiktig overføre celler til en 75 cm2 kolbe luftes inneholdende 10 ml cellekulturmedier.
- Inkuber kolbe i 5% CO2
6. Fastsettelse hypothalamus Cell Toxicity
- Varm DMEM og 1x-trypsin-EDTA-oppløsning i et 37 ° C vannbad.
- Sug media fra hypothalamus celler og legge 500 mL av trypsin. Inkuber ved 37 ° C i 2 - 5 min. Fjerne celler fra kolben ved hjelp av en skraper som er beskrevet ovenfor i trinn 2.
- Cellene telles ved hjelp av et hemocytometer og plate hypotalamiske cellene ved 5000 celler / brønn i et sort vegger klar bunnplate i et sluttvolum på 200 ul DMEM supplert med 10% FBS og 1% PSN og inkuberes over natten i 5% CO2 ved 37 ° C .
- Fjerne 100 pl av gamle mediet ved hjelp av en flerkanals pipetter og tilsett 100 ul av filtrerte konsentrert kondisjonert medium, til en sluttkonsentrasjon på 1 x.
- Inkuber platen i 5% CO2 ved 37 ° C i 24 timer.
- Legg 221; l av resazurin reagens og inkuber platen i 20 minutter i 5% CO2 ved 37 ° C.
- Ved hjelp av en multimode spektrofotometer, rekord fluorescens (560 nm EX / 590 nm EM) for å måle celle levedyktighet. Rapportere resultater som relative fluorescens enheter (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser at mikroglia funksjon som et surrogat biosensor for hjernen svar på nanopartikler ved anvendelse av protokollen ovenfor. Våre resultater omfatte måling av de toksiske virkninger av microglial aktivering på nedstrøms neuronal celledød. Figur 1 viser en arbeidsflyt av protokollen for å aktivere mikroglia og avgjøre om utskilte cytokiner reduserer levedyktigheten til hypothalamus neuroner. TNF-α sekresjon ble signifikant øket følgende AgNP eksponering (figur 2). Når hypothalamus neurons utsettes for kondisjonert medium fra AgNP-aktiverte mikroglia blir cellenes levedyktighet betydelig redusert (figur 3). Figur 4 skisserer potensialet mekanisme der AgNPs aktivere mikroglia og bidra til hypothalamus celledød.
Figur1. Arbeidsflyt for AgNP filtreringsmetode. Supernatant fra aktivert microglia legges til filtrering enheter og sentrifugert for å fjerne AgNPs fra media. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. TNF-α sekresjon er økt etter AgNP Exposure. Microglial BV2 celler ble behandlet med kjøretøy kontroll eller AgNPs i 2 timer. TNF-α sekresjon ble betydelig økt etter eksponering for AgNPs. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. ** p <0,001 vs. kontroll som vurderes av Student uparet t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. hypothalamus celleviabilitet reduseres Etter microglial Betinget medieeksponering. Hypothalamus cellene vise økt celledød etter eksponering for betinget media fra microglia stimulert med AgNP. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05 vs. kontroll som vurderes av Student uparet t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Potensielle Pathway av AgNP Induced microglial Aktivisering og innflytelse på hypothalamus Nevro. Etter eksponering for sølv nanopartikler, mikrogramlia aktiveres til en M1 pro-inflammatorisk tilstand, karakterisert ved økt sekresjon og ekspresjon av pro-inflammatoriske cytokiner og maskin. Utgivelsen av proinflammatoriske cytokiner og beslutningstakere bidrar til omkringliggende nevroncelledød. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
