Introduction
Çevre kirliliği, özellikle nanopartikül (NP) aralığı olan (1-20 nm çapında), obezite ve kan-beyin bariyerinden 1-3 geçebilmekte bağlı başka nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Kirliliğine yükseltilmiş maruz hipotalamus 1 de dahil olmak üzere, merkezi sinir sisteminde enflamasyonun neden olabilir. Bu mikroglia nanoparçacık kaynaklı aktivasyonu (beyin bağışıklık hücreleri) 4 kanalıyla olabilir meydana geldiği bir potansiyel mekanizma. Önceki çalışmalar zaman alıcı, pahalı beyin sağlığı üzerinde NPS etkilerini incelemek için in vivo modellerinde kullanmış ve doğrudan NPS mikroglia nasıl etkilediği sorusuna cevap yok. Mikroglia beyin mikro bakım dahil olmak üzere ve salgılanan faktörler ve sitokinlerin açığa ile nöronları çevreleyen iletişim merkezi sinir sisteminde, çok yönlü bir rol oynamaktadır. uyaranlara bağlı olarak, mikroglia bir M1 pr aktif hale getirilebiliro-inflamatuar veya M2 anti-inflamatuar durum. M2, interlökin-4 (IL-4) dahil olmak üzere, mikroglia salma anti-enflamatuar sitokinler aktive Örneğin, M1, mikroglia tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) gibi pro-enflamatuar sitokinleri serbest aktif. Hava kirleticilerin nörotoksik belirlenmesi için in vitro biyosensörle bizim vekil doğrulamak için, biz 20 nm gümüş nanopartikülleri (AGNPS) için mikroglial tepki ölçülür. Bu makalenin amacı bir in vitro mikroglial hücre hattı NP için fare mikroglial tepki test ve nasıl mikroglial aktivasyon hipotalamus hücrelerini etkiler için bir vekil biyosensör belirteci olarak nasıl kullanılabileceğini açıklamaktır. Uzun vadeli bu valide modelin uygulama, beyin sağlığı ve nörodejeneratif hastalık üzerinde gerçek dünya kirleticilerin etkilerini test etmek amaçlanmıştır. Bu mikrofon maruz kaldıktan sonra mikroglial aktivasyonu ve hipotalamik hücre yaşamını ölçmek için bir in vitro 96 oyuklu bir format ayrıntılı bir açıklama temin koşullu ortam roglial.
Mikroglia aktivasyonu testi (ELISA) bağlı immünosorban bir TNF-α enzim kullanılarak AgNP maruz kalındıktan sonra belirlendi. hipotalamik hücrelerde aktif mikroglia etkisini belirlemek için, AGNPS bir süzme cihazı kullanılarak mikroglial süpernatan (koşullu ortam) çıkarıldı. boyutuna göre AGNPS hariç ise filtrasyon cihazı sitokinler korur. Kısaca, AGNPS ile veya tedavi mikroglia alınan üst faz, toplanmış, filtrelere eklenmiş ve 15 dakika için 14,000 x g'de santrifüjlenmiştir. Daha sonra hipotalamik hücre canlılığı üzerine mikroglial salgılanan sitokinlerin etkisini belirlemek başardık. Daha önce tarif edildiği gibi 5,6 koşullu ortam (ihtiva eden sitokinler) maruz kaldıktan sonra hücre toksisitesi resazurin tabanlı tahlil ile belirlenmiştir. Metabolik olarak aktif hücrelerin resazurin azaltmak ve canlı hücreler 7 sayısı ile orantılı bir flüoresan sinyal üretir.
nt "> (örneğin, ya da in vivo deneyler ko-kültür, trans-kuyu kurulumları gibi) diğerleri üzerinde bu tekniği kullanarak birçok avantajı vardır. Bizim modeli doğrudan mikroglia etkinleştirmek ve salgılanan faktörler nöronlar 8 için toksik olup olmadığını belirlemek için yeteneği sağlar . geçerli protokol ölümsüzleştirilmiş BV2 mikroglia sıçangil hipotalamik hücreleri bu protokol bu spesifik koşullar için optimize edilmiş olsa da (belirlenmiş mHypo-A1 / 2) daha sonra karşılık belirlenmesi için 9., yöntemler olabilir 20 nm çapında nano ile uyarılmış ve ölümsüzleştirilmiş kullanır değiştirilmiş mikroglial kaynaklı hücre ölümünün diğer modellerde kullanılan veya birincil mikroglia ve nöronlar gibi diğer hücre tipleri ile edilmesi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroglial Hücre Kültürü Bakım
- Sıcak hücre kültürü ortamı (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı DMEM) 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin / neomisin (PSN) ile takviye edilmiştir.
- -80 ° C'de depolamadan 25 - geçit 18 BV2 mikroglial hücreler dondurulmuş stok elde edilir. Hızla 37 ° C su banyosu içinde hücreleri eritin.
- Yavaşça 10 ml hücre kültür ortamı içeren 75 cm 2 Bacalı şişeye hücreleri aktarmak.
- 37 ° C'de% 5 CO2 içinde balon inkübe edin. Medya aspire 24 saat sonra ve taze medya ile değiştirin. % 80 confluency - yaklaşık 70 kadar hücreleri büyür.
2. Sayma ve Kaplama Hücreler
- 37 ° C su banyosu, sıcak DMEM ve 1 x-tripsin-EDTA çözeltisi içinde.
- hücrelerden aspire medya ve tripsin 500 ul ekleyin. 5 dakika - 2 37 ° C'de inkübe edin.
- kazıyıcı kullanarak şişeye hücreleri çıkarmak ve 5 ml askıyaDMEM. 50 ml'lik bir tüp içine üç kez 70 mikron süzgeç vasıtasıyla hücrelere geçerler.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve% 10 FBS ve% 1 PSN ile desteklenmiş 200 ul DMEM nihai hacimde net bir alt plaka duvarlı / göz, bir siyah 8.000 hücre tohum. 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin.
- Eski DMEM çıkarın ve mikroglia açlıktan serum% 1 PSN ile takviye ısıttı DMEM 200 ul ile değiştirin. 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin.
3. etkinleştirilmesi Mikroglia
- Ayrı tüplerde, AGNPS seyreltilmiş (0.01, 0.05 ya da 0.1 ug / ml) ve araç / nötr kontrolü son işleme konsantrasyonları% 1 PSN ile takviye edilmiş serumsuz DMEM (sodyum sitrat, 0.04 mM).
- her bir ortamın 100 ul çıkarın ve uygun tedavi, bileşiğin 100 ul ile değiştirin.
- 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin.
4. FiKoşullu ortam edilmiş filtre edilmiş
- Her ortam süpernatan 200 ul iyi toplama toplama tüpünün (1,5-2 mi kapasite) sahip bir filtre (10 kDa moleküler ağırlık cutoff) aktarmak.
- 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 14,000 x g'de santrifüjleyin.
- flow-through (parçacıkları ile süpernatant) atın ve yeni bir toplama tüpüne filtre ters yerleştirin.
- 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1000 x g'de santrifüjleyin.
Not: Elde edilen filtre ortamı (salgılanmış sitokinler ihtiva eden) altı kat konsantre edilir. - Buz üzerinde,% 10 FBS ve% 1 PSN ve mağaza ile desteklenmiş taze DMEM ile 400 ul, konsantratın hacimle getirin.
NOT: - 420 nm 10 yaklaşık 390 karakteristik tepe dayalı bir AgNP konsantrasyonu, artık AGNPS süzülmüş ortamdan kaldırılır sağlamak oluşturmak için. (Adım 3.1 de tarif edildiği gibi, 0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, ve 0.2 ug / ml) ve süzüldü Kısaca, süzülmemiş AGNPS hacimde hazırlanmasıAraç kontrol serumsuz DMEM (sodyum sitrat, 0.04 mM). Kısım Bir siyah süzülür örnekler ve standartlar 50 ul açık alt plaka duvarlı. bir spektrofotometre kullanılarak, 390 absorbans ölçmek - 410 nm ve AgNP konsantrasyon eğrisine okumaları karşılaştırın. süzüldü örnekler araç kontrol numunesi ile aynı emilme değeri varsa, kalıntı AGNPS kaldırılır varsayılabilir. - Bir ticari olarak temin edilebilir kit TNF-α salgılanmasını talimatlarını belirlemek için, filtre ortamının yarısı kullanın.
5. Hipotalamik hücre kültürü Bakım
- Sıcak DMEM hücre kültür aracı 37 ° C,% 10 FBS ve% 1 PSN ile takviye edilmiştir.
- 80 ° C de muhafaza 25 - hipotalo dondurulmuş stok (mHypo-A1 / 2) geçit 18 hücreleri elde etmek. Hızla 37 ° C su banyosu içinde hücreleri eritin.
- Yavaşça 10 ml hücre kültür ortamı içeren 75 cm 2 Bacalı şişeye hücreleri aktarmak.
- CO2% 5 balon inkübe
6. belirlenmesi Hipotalamus Hücre zehirlilik
- Sıcak DMEM ve 37 ° C su banyosu içinde 1x-tripsin-EDTA çözeltisi.
- hipotalamik hücrelerden aspire medya ve tripsin 500 ul ekleyin. 5 dakika - 2 37 ° C'de inkübe edin. 2. adımda, yukarıda tarif edildiği gibi, bir kazıyıcı kullanılarak şişeden hücreler çıkarın.
- Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve% 10 FBS ve% 1 PSN ile desteklenmiş 200 ul DMEM nihai hacimde net bir alt plaka duvarlı / göz, bir siyah 5000 hücre olacak şekilde hipotalamus hücreleri plaka ve 37 ° C'de% 5 CO2 içinde gece boyunca inkübe .
- Çok kanallı bir pipet kullanılarak, eski ortamın 100 ul çıkarın ve 1x bir son konsantrasyon elde etmek üzere filtre konsantre hale koşullu ortamın 100 ul, ilave edin.
- 24 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde plaka inkübe edin.
- 22 ekle1 'dir; resazurin ayıracı ve 37 ° C'de% 5 CO2 içinde 20 dakika süreyle plaka inkübe edin.
- Bir modlu spektrofotometre, kayıt floresan (560 nm EX / 590 nm EM) kullanarak hücre canlılığını ölçmek için. bağıl floresan üniteleri (RFU) olarak sonuçları rapor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokolünü kullanarak nanopartiküller beyin yanıtı için bir vekil biyosensör olarak bu mikroglia işlevini göstermektedir. Bizim sonuçlarımız aşağı nöronal hücre ölümü üzerindeki mikroglial aktivasyon toksik etkileri ölçülmesini içerir. 1 mikroglia etkinleştirmek ve salgılanan sitokinler hipotalamik nöronların canlılığını azaltır olmadığını belirlemek için protokol iş akışı gösterir Şekil. TNF-α salgısı belirgin AgNP maruz (Şekil 2), aşağıdaki arttırılmıştır. Hipotalamik nöronlar AgNP-aktif mikroglia uygun koşullara maruz kaldığında, hücre canlılığı gözlendi (Şekil 3) indirgenir. 4 AGNPS mikroglia etkinleştirmek ve hipotalamik hücre ölümüne katkıda bulunan olası bir mekanizma özetlemektedir Şekil.
şekilAktif mikroglia gelen AgNP Filtrasyon Yöntemi. Süpernatant 1. İş Akışı filtrasyon cihazları eklendi ve medyadan AGNPS kaldırmak için santrifüj edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2, TNF-α salgılanması AgNP maruz kaldıktan sonra artar. Mikroglial BV2 hücreleri, araç kontrolü ya da 2 saat süre ile AGNPS ile muamele edilmiştir. TNF-α salgısı belirgin AGNPS maruz kaldıktan sonra artırıldı. Veri ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. ** p <Student eşleştirilmemiş t-testi ile değerlendirilen 0.001 vs kontrolü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Hipotalamus Hücre Canlılık Mikroglial Klima Medya Pozlama takiben azalır. Hipotalamik hücreler AgNP ile uyarılan mikroglia şartlandırılmış medyaya maruz kaldıktan sonra artan hücre ölümünü gösterir. Veri ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. * P <karşı kontrol 0,05 Öğrenci eşleştirilmemiş t-testi ile değerlendirilen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hipotalamik Nörotoksisite Şekil 4. Potansiyel AgNP Kaynaklı Mikroglial aktivasyonu Yolu ve Etkisi. Gümüş nanopartiküller maruz kalma sonrasında, microglia salgılanmasının arttığını ve pro-enflamatuar sitokin ve vericiler ifadesi ile karakterize edilen, bir M1 pro-enflamatuar duruma aktive edilir. Pro-inflamatuar sitokinler ve yapımcıları bırakma nöronal hücre ölümünü çevreleyen katkıda bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells/Reagents | |||
| Mouse microglial cell line (BV2) | Interlab Cell Line Collection (Genoa, Italy) | ATL03001 | |
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Thermo Fisher Scientific | 15640-055 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Silver nanoparticles (20 nm) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Mouse TNF-α ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L4391 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | EMD Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices | M5 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Corning, Inc | 14-432-22 |
|
| Falcon Cell Strainers 70 μm | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| Tabletop centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620560 |
References
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
- Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49 (2014).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
- Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
- Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
- Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
- Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
- Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105 (2011).
- Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
- Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
- Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
- Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
- Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
- Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
- Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
- Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
- Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
- Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
- PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
- Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
- Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).
