Abstract
生物材料的发展已显著增加用于靶向药物递送的潜在的各种细胞和组织类型，包括在胰岛β细胞。此外，生物材料颗粒，水凝胶，和支架还提供了一个独特的机会来管理持续的，可控的药物输送到β细胞的培养和移植的组织模型。这些技术允许使用完整的小岛和一个翻译相关制度的候选β细胞增殖因子的研究。此外，确定用于在培养系统刺激β细胞增殖的候选因素的有效性和可行性是向前移动到体内模型之前的关键。这里，我们描述的方法共培养完整小鼠胰岛与感兴趣的可生物降解化合物（COI）-loaded聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）微球，以评估原位释放ö持续的影响的目的˚F促有丝分裂因子对β细胞的增殖。这种技术详细描述了如何生成包含使用市售的试剂所需的货物PLGA微球。而所描述的技术使用的重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）作为一个例子，可以很容易地用于各种COI的。此外，此方法利用的96孔板，以尽量减少必要评估β细胞增殖的试剂的量。该协议可以很容易地适合于使用替代生物材料和其它内分泌细胞特征，例如细胞存活和分化的状态。
Introduction
胰岛β细胞是在体内仅产生胰岛素的细胞，并维持血糖稳态的关键。而健康个体具有足够的β细胞量和功能适当地调节血糖，糖尿病的个体被不足β细胞量和/或功能1,2-特征。已经提出了诱导β细胞增殖可以最终增加β细胞量和个体的糖尿病3恢复葡萄糖动态平衡。然而，评价和完整的胰岛β潜能细胞增殖的化合物的验证是必要的，可以制定有效的治疗之前。尸体人胰岛与糖尿病患者的移植恢复血液葡萄糖稳态了一段时间，但是可用性和此实验过程的成功是由可供移植人胰岛的缺乏和由β细胞死亡中的胰岛船尾受阻呃移植4。即使使用的诱导胰岛素产生细胞的倍增因子的发现，一个重大的挑战仍然存在于提供这些因素的体内相关网站。对于持续局部递送β细胞增殖的化合物的一个策略是聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）。 PLGA在FDA的使用的历史认可药物递送制品，由于其高的安全性，生物降解性，并且延长释放动力学5。具体地，PLGA是通过水解与水在体内或在培养成乳酸和乙醇酸，其天然存在于体内存在的代谢产物降解的丙交酯和乙交酯的共聚物。包封的药物化合物可以通过扩散和/或降解受控释放机构周围环境释放。 COI的封装提供了保护，防止酶降解，提高试剂的生物利用度相比unencapsula特德COI 5。我们建议，PLGA微球能够最终在体内用于施用在培养候选化合物对完整的胰岛和。测试PLGA的功效来管理β细胞有丝分裂原到胰岛离体进行了探索移植协议之前是至关重要的。
目前，没有任何技术来测量在活的动物的β细胞增殖。实验评估体内潜在的增殖的化合物的有效性，因此需要这些化合物的行政生活的动物，为胰腺免疫标记随后的解剖和处理。这些协议是昂贵和费力的，并且所需要的化合物要全身施用，不作任何保证，他们将到达小岛。相反地，几种永生β细胞系可用于在培养产生胰岛素的细胞的研究，但这些细胞系缺乏胰岛架构和环境下吨生物6中。永生化β细胞系也被表征为具有高得多的程度比内源性β细胞在体内的复制，从而变得复杂诱导增殖的化合物的分析。在这项研究中，我们描述了使用从成年小鼠中分离的完整的胰岛的协议。与β细胞系，完整保留胰岛胰岛的正常结构。同样，在对比体内进行的试验中，给予增殖性化合物直接向培养的完整胰岛显著减少了必须精确地测量β细胞增殖的试剂的量。
目前的研究利用PLGA来管理COI，在这个例子中，重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）。此处所描述的方法赋予通过原始化合物培养的胰岛给药的显著优势，因为它允许对一个持续释放化合物的成第e媒体。值得注意的是，该测定可以被修饰以管理各种蛋白质和感兴趣的完整胰岛抗体。在其他内分泌细胞类型，包括α-细胞的作用，也可以被分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有程序被批准，并按照范德比尔特机构动物护理和使用委员会进行。
1.标签COI与荧光基团（可选）
- 选择荧光染料，将与自由伯胺反应（ 例如 ，在一个蛋白质），如琥珀酰亚胺基酯或荧光素衍生物，可视化微球的货物。溶解8倍摩尔过量（相对于COI的摩尔数）的荧光团进入二甲基亚砜200微升（DMSO）中。
- 悬浮50毫克COI高达800微升在车辆溶液的最终体积（62.5毫微克/微升的最终浓度）。车辆的解决方案将取决于COI的来源而变化。
注意：典型车辆溶液包括磷酸盐缓冲盐水（PBS）或DMSO中。 - 从步骤1.1加入所有的荧光/ DMSO溶液，悬浮COI。涡旋过夜，在4℃。可替代地，涡旋在室温下将反应混合物（RT）下进行4小时。
- 继标记反应，用脱盐柱去除多余的荧光。
- 从脱盐柱排水存储缓冲区，并以16毫升去离子水冲洗。通过丢弃所有流量。
- 荧光标记COI添加到脱盐柱。 1.2毫升去离子水洗脱，并通过收集的流动。
- 重复洗脱步骤的额外四次，每次加的1.2ml去离子水，并通过为单独的样品收集的流动。
- 冷冻在-80℃下通过样品收集的所有流，并根据制造商的24小时指示冻干。
通过水包油包水乳液溶剂蒸发方法2. COI加载微球的制备
- 加入1毫克的荧光标记的COI为100微升去离子水，形成第一水相（W1）。
- 溶解65毫克聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸ACID）（50:50丙交酯：乙交酯，分子量54000 - 在微量离心管中750μl的二氯甲烷69000）。 Ultrasonicate为10 - 30秒（在160瓦）以完全溶解的PLGA。这就形成了油相（O）。
- 添加在步骤2.1向O相位在一个逐滴方式生成的W1相的所有。乳化使用手持式均化器在20,000rpm下30秒，以形成W1 / O相。
- 所有在一个逐滴方式W1 / O相添加到15ml的1％（重量/体积）含水聚（乙烯醇）（PVA）溶液，并使用手持式均化器乳化以20,000rpm离心30秒。
- 使用旋转蒸发1小时以除去溶剂和生成的水相的圆底烧瓶中，并受传送所有在步骤2.4中产生的乳液的一个200毫升至635毫米汞柱的真空。
- 等分试样将1ml水相在步骤2.5到十四离心管生成。离心7500在微量离心管中的水溶液xg离心8分钟。
注：在此步骤中，微球存在于剩余的水溶液并浓缩至微量离心管的底部。 - 小心地从离心管用微量取出900微升水溶液中，移液以便不打扰在微量离心管底部的微球。
- 通过加入1毫升去离子水于每个离心管中洗过量PVA的微球。离心机7500 xg离心8分钟，然后再次小心地从离心管用微量取出900微升水溶液中，移液以便不打扰在微量离心管底部的微球。
注：其余100μl的水溶液含有所生成的微球。
- 通过加入1毫升去离子水于每个离心管中洗过量PVA的微球。离心机7500 xg离心8分钟，然后再次小心地从离心管用微量取出900微升水溶液中，移液以便不打扰在微量离心管底部的微球。
- 冻结在步骤2.7在-80℃，产生的水微球的解决方案。
- 冷冻干燥的微球使用根据冻干机制造商的指令并贮存在-20℃。
注：通过完全溶解PLGA微球，并且相对于游离蛋白质7的标准曲线中的蛋白质浓度确定测量COI的装载效率。 - 作为阴性对照，产生一批次的“空白”微球（以下简称为控制微球体）。
注意：控制微球的生成是相同的亲水COI-微球的产生，无COI除了800微升媒介物溶液中步骤1.2。相对于COI-PLGA微球对β细胞有丝分裂原测定PLGA质量浓度匹配控制颗粒。
3.胰岛文化传媒和预试验培养基的制备
- 制得200毫升介质完整小鼠胰岛的培养：RPMI补充有11毫米的葡萄糖，10％马血清，100U / ml青霉素G和100微克1640培养基/ ml链霉素（以下简称为让文化传媒）。
注1：与胎牛血清（FBS），马血清缺乏胎盘催乳素，β细胞增殖，混淆分析在增殖测定的诱导。
注2：由于PLGA微球不会在使用前消毒，在加入抗生素的培养基是至关重要的，以避免微生物污染。 - 在50ml锥形管中的电子移液器和地点除去25毫升胰岛培养基。补充在50ml锥形管25毫胰岛培养基用0.2毫EGTA的终浓度，以产生预测定培养基。
注：加入EGTA轻度松动的胰岛细胞与细胞的接触，而不改变胰岛架构。这有助于确保COI可以到达胰岛细胞内，并有助于防止胰岛中央坏死。
4.完整小鼠胰岛的培养
- 从预先选定的应变，性别，AG隔离完好胰岛e和以下胰腺8,9的例行胶原酶消化小鼠的基因型。从游泳池样品一样一起小岛。
- 等分试样40胰岛成在200μl胰岛培养基的96孔组织培养板的一个孔中。每口井目测尺寸匹配的胰岛（样本之间胰岛当量（IEQ）的精确评估是没有必要的）。填写紧邻井用200微升无菌水的小岛提供一个缓冲蒸发井空。在媒体过夜，在37℃培养胰岛95％空气和5％CO 2的气氛下。
COI装载和控制PLGA微球5.停牌重组
- 过夜后胰岛的恢复，重新悬浮的微球通过将测定预媒体冻干COI-PLGA微球中的一个等分试样，使得COI中的离心管中最终浓度为10纳克/微升（COI存在于一个给定的量的量生成的万分之一pheres在步骤2.9）来测定。超声处理在冰水浴悬浮COI加载的微球在160 10分钟W和在4℃下10秒长的脉冲。
- 悬浮控制PLGA微球通过将测定预介质的相同体积冻干控制PLGA微球的质量相等。超声处理在冰水浴再悬浮控制PLGA微球在160 10分钟W和在4℃下10秒长的脉冲。
- 直观地确认微球通过吸取2微升两个玻璃盖玻片之间的微球悬浮分散。使用可视化上落射荧光或明显微镜40倍物镜球。
- 如果微球显著聚合仍然可见，声处理，在冰水浴中在160额外10分钟W和在4℃下10秒长的脉冲和再悬浮的微球重复可视化。
6.治疗COI加载或控制PLGA微球胰岛</ P>
- 对于每个孔与COI-微球被处理，稀释预先测定培养基再悬浮COI微球体的10毫微克/微升至100微升的最终体积和预定的最终浓度制备试验培养基。
注：该蛋白质的最优的最终浓度将对于用于该测定各COI变化。理想情况下，一个范围的最终浓度进行试验。 - 每个孔用作对照，稀释在步骤5.2与用来稀释COI-微球在步骤6.1相同的稀释量产生的重悬的控制PLGA微球制备控制测定培养基。
注：与对照测定培养基处理的胰岛将作为阴性对照，以使空白微球体可具有对实验结果的任何影响的检测。 - 小心地从每个孔中除去100μl的胰岛培养基用微量使得没有胰岛从孔脱落。轻轻地添加100μ升测定培养基或100微升控制试验培养基到每个孔中的。
- 孵育在37℃的胰岛95％空气和5％CO 2的气氛下三天。
7.完整分散到胰岛显微镜载玻片
- 三天后，用微量小心从所有孔取出并丢弃试验介质以免撞出小岛。轻轻地加入200μl的PBS胰岛洗试验培养基他们。小心地取出，用微量丢弃PBS并轻轻地用一个额外的200微升PBS洗一遍小岛。
- 捞出用微量弃PBS，加入100微升0.025％胰蛋白酶，2毫米EDTA溶液。孵育在室温3分钟。吸管胰岛中的胰蛋白酶-EDTA溶液上下每2分钟直到胰岛目视确认被分散成单个细胞（请注意，细胞的一些小块可能仍然存在）使用光学显微镜。转移每孔个体的整个体积LY到labeled-离心管。
- 添加400μl的胰岛培养基到每个离心管中以停止胰蛋白酶介导的细胞解离。
- 在4℃100 xg离心5分钟离心样品以沉淀胰岛细胞到离心管的底部。
- 轻轻地取出用微量上清，重新悬浮颗粒在200微升新鲜胰岛培养基。
- 使用CYTO离心机，离心机分离在140 XG 3分钟胰岛到充电显微镜载玻片。
- 在RT风干载玻片10分钟，然后绘制围绕与疏水标记笔离解的胰岛一个框。
- 修复用75微升4％低聚甲醛（PFA）在室温10分钟的细胞。除去4％PFA和在75微升轻轻洗涤细胞的PBS两次。洗涤后，将透用75微升0.2％的Triton X-100的PBS 10分钟的细胞。然后，立即用75微升PBS细胞。
注意：PFA是已知的过敏，致癌和有毒的。 8.游离的胰岛细胞免疫荧光标记胰岛素和细胞增殖标记，Ki67的 - 通过将两个湿纸巾在100滑动容量显微镜滑动箱的底部制备潮湿室。
- 广场幻灯片平倒在潮湿室（朝上细胞）。通过从使用微量先前洗涤步骤抽吸PBS并且加入阻断溶液的75微升准备用于标记样品（5％正常驴血清（NDS）的PBS），以每滑动阻止抗体与样品的非特异性结合。孵育载玻片在在RT 1小时封闭溶液。
- 轻轻使用微量并添加75微升含豚鼠抗胰岛素和兔抗Ki67抗体初级抗体溶液抽吸封闭溶液，在PBS中稀释的1μg/ ml的5％NDS。孵育在RT 1小时。
注意：细胞增殖的替代标记包括增殖细胞核抗原（PCNA）与磷酸化ohistone H3（PH 3）， - 使用微量轻轻吸一次抗体溶液和冲洗用75微升PBS中的细胞。吸出PBS中使用微量和冲洗细胞两次，用75微升的PBS各一次。孵育在在RT 1小时封闭液稀释至2微克/毫升75微升抗豚鼠Cy5的二级抗体和抗兔Cy3标记的二级抗体各样品。
注意：不要使用贴有一个已经用于标记微球相同或频谱重叠荧光第二抗体。 - 使用微量并且在75微升为300nM的DAPI的PBS中在室温下孵育3分钟抽吸二级抗体溶液。抽吸DAPI使用微量并且在去离子水中漂洗5分钟。
- 轻轻地从使用微量样品吸的水。现货滴（约100微升）载于玻璃盖玻片抗淬灭剂快干安装的解决方案。倒置显微镜载玻片样品的一面朝下，邻n要安装的解决方案。轻轻地用吸管尖除去气泡，擦干用柔软清洁纸巾多余的液体按盖玻片反对的幻灯片。允许盖玻片在RT干燥过夜。
- 使用落射荧光显微镜与连接的摄像头进行图像采集。对于每一个荧光团，确定最佳的曝光时间（通常为20毫秒DAPI，40 - 80毫秒胰岛素和250毫秒Ki67的）。确保图像采集参数相等对于所有样品。
- 对于每个样本，算上人工胰岛素3000阳性细胞和那些算多少也Ki67的阳性。只计算有一个明确和清晰可见核胰岛素阳性细胞。计算通过分割的Ki67阳性/胰岛素阳性细胞的数目由胰岛素阳性细胞的总数再乘以100增殖β细胞对每个样品的百分比。
- 天后etermining增殖β细胞对每个样品的百分比，确定是否控制和通过分析与使用市售统计软件方差单向结果实验样品之间存在的β细胞增殖的统计学显著差异。
9.图像采集与分析
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1是利用上述协议所产生的微球的视觉表示。这里所描述的协议产生各种大小的rhCTGF加载的微球。微球体的最大分数为1和10微米之间的直径，尽管一些微球可以更大（ 图 2）。如果需要的话，微球尺寸可以被调整，并根据工艺参数，如均化速度和时间，所用表面活性剂浓度，并且每个水/油/水相10的相对体积进行优化。
以下与PLGA微球和随后的免疫标记处理完好胰岛的扩散，这是经常可以看到样品不含细胞（ 图3）之间的任何标记的区域。虽然大多数是仍然完好无损培养治疗期后的微球是在洗涤步骤去除，一些残留的胰岛旋涂在显微镜载玻片后。这些微球导致成像期间可视孔状结构。这些残留的微球通常不与随后的量化干扰。
成像后，Ki67的阳性/胰岛素阳性细胞的百分比可以通过手动计数标记的细胞的总数，或使用软件的图像分析来定量。此前，我们已经证明，重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）能刺激小鼠胰岛β细胞增殖，胰岛完整体外 11。使用上述协议中，我们生成了包含rhCTGF（rhCTGF-PLGA）微球。治疗完好胰岛与rhCTGF-PLGA微球3天导致β细胞增殖有类似的增加与前面的原始蛋白的报道，这表明该蛋白没有罗瑟微球生成（ 图4）中的任何功能。
图1：PLGA微球的可视化表示通过将荧光染料到制造协议，PLGA微球可使用表面荧光显微镜来观察。比例尺代表200微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：PLGA微球的粒度分布虽然尺寸分布可以变化，大多数的微球将小于10微米的直径。ARGET =“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 分散相增殖β细胞免疫荧光可视化分散胰岛免疫标记的增殖标记Ki67的（红色）和胰岛素（绿色）来标记增殖β细胞。细胞核被标以DAPI（蓝色）。箭头指示的Ki67阳性/胰岛素阳性细胞。星号（*）表示未降解微球。比例尺为100μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 量化与分析β细胞临liferation。胰岛具有不同量rhCTGF-PLGA微球处理。的Ki67阳性/胰岛素阳性细胞的数目是手动从所有样品计算并表示为胰岛素阳性β细胞总数的百分比。 X轴对应于rhCTGF存在于各处理的最终浓度。使用单向ANOVA，然后通过Tukey多重比较检验，确定统计学意义。统计显着性设定为p≤0.05。误差棒代表平均值的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β细胞增殖的培养物研究通常是由几个困难阻碍。首先，永生化β细胞系由较高程度的增生比什么是内源性β细胞活胰岛发现的特点。此外，这些永生化细胞系缺乏正常结构正常β细胞功能的关键。这两个事实使得难以确定是否使用永生化的β细胞系在体内或整个胰岛进行测试时将保持真获得的结果。我们描述的方案，它使用新鲜分离完整小鼠胰岛，如胰岛架构被保持和β细胞增殖相当于在体内发现的规避了这些问题。
培养完整胰岛当一个显著关注的是，胰岛芯内的细胞将经历缺氧诱导坏死或不会暴露到rhCTGF的可能性。因为这个原因，最终为0.1mM的EGTA浓度被添加到媒体松开细胞 - 细胞接触，而不破坏胰岛架构。我们先前已经公布了单独加入EGTA可以增加β细胞的增殖，这可能是由于在媒体上的胰岛芯12的营养物质和有丝分裂因子的增加的访问。响应于EGTAβ细胞增殖的增加也可能是由于在细胞-细胞接触本身13,14下降。在这个协议中所描述的媒体也被补充有马血清代替更传统的胎牛血清。这个取代是由于胎盘催乳素在胎牛血清存在下，其可以刺激自身β细胞的增殖，在增殖测定潜在复杂分析的。
的PLGA微球（有或没有COI）至胰岛细胞的相对毒性的测定可以通过马的免疫荧光分析来评估细胞死亡或DNA损伤的rkers包括TUNEL或γ-H2AX 15,16。虽然除了PLGA微球的未示出任何明显的不利影响，以胰岛离体 ，用户应该知道的微球可具有图像分析的影响。如在图3显示出，并在结果部分所提到的，未降解的微球可以是如免疫荧光图像中的黑斑，同被用于增加浓度时出现更多的微球明显。
应当指出的是，描述的协议已针对具有隔离小鼠胰岛工作。因此，目前还不清楚，如果在相同的条件将与来自替代的生物，如鼠和人类收获胰岛工作。值得注意的是，胰岛收获来自不同生物的通常具有不同的最佳培养条件和不同程度的β细胞增殖17,18。
许多BIOM材料板是潜在可用的施用rhCTGF到分离的胰岛，包括聚（酮缩硫醇-氨基甲酸酯）和聚（硫化丙烯）19。我们选择把重点放在PLGA由于它具有几个显着的特质。首先，PLGA是一个比较实惠的试剂和微球可以用可在大多数研究机构的标准设备（离心机，均质机，冻干机）产生。 PLGA是有由于其生物相容性，生物可降解性，其调节化合物的释放率20能力，FDA批准的设备成功使用先例的人造聚合物。 PLGA降解通过水解在水的存在下，在此过程中释放出的货物。 PLGA粒子的化学组成可以在一化合物在体内在几个星期的期间释放量身定做这样。 PLGA也已在临床前动物试验和人临床疗法用于局部给药的化合物对各种器官和Tissu酒店ES 21,22。其它疏水性聚合物也可以在可生物降解的微球的生成中使用。这些聚合物可以以特定环境刺激，例如pH，温度，和活性氧23,24的存在作出响应。因此，研究人员应仔细考虑其生物材料是最适合他们的学业。
任何利用PLGA，或其他生物材料研究，以研究β细胞增殖的体外应该意识到包封COI的相比未包封COI效果之间的电位差。例如，通过PLGA rhCTGF的递送可以相比于用未包囊蛋白治疗改变的β细胞增殖的诱导的程度和时间。目前在我们的实验室正在进行的研究正在研究这些潜在的分歧。
β细胞增殖的培养胰岛的分析是识别和我一个强大的模型β细胞的有丝分裂原的chanistic分析。使用此处描述我们显示用于与延长释放递送载体给药COI分离的培养的胰岛相对快速且经济有效的方法测定。该测定应该纯粹是根据它的先前公布的刺激β细胞增殖的体内能力和离体 11是适用于感兴趣几乎任何COI，和我们的选择集中于CTGF。此外，该法可推进到胰岛在活的生物体移植模型之前验证的有效性和使用PLGA作为传递方法的安全性。总体而言，所描述的协议提供了施用化合物培养的胰岛与测量PLGA的安全可移植组织一个更广泛的影响的新方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
