Abstract
De ontwikkeling van biomaterialen aanzienlijk vergroot de kans op doelgerichte geneesmiddelafgifte om een verscheidenheid aan cel- en weefseltypes, zoals de pancreas β-cellen. Daarnaast biomateriaal deeltjes, hydrogels, en steigers bieden ook een unieke gelegenheid om te dienen duurzame, controleerbare drug delivery om ß-cellen in de cultuur en in het getransplanteerde weefsel modellen. Deze technologieën kunnen de studie van proliferatie kandidaat-β-cel factoren met behulp van intacte eilandjes en een translationeel relevant systeem. Bovendien bepalen van de effectiviteit en haalbaarheid van kandidaat factoren voor het stimuleren van proliferatie β-cellen in een kweeksysteem kritisch voordat ze verder in vivo modellen. Hierin beschrijven we een werkwijze voor co-kweek intacte eilandjes muis met biologisch afbreekbare verbinding van belang (COI) -geladen poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) microsferen voor de beoordeling van de effecten van aanhoudende afgifte in situ of mitogene factoren β-celproliferatie. Deze techniek beschrijft in detail hoe PLGA microsferen die een gewenste lading met behulp van commercieel verkrijgbare reagentia te genereren. Hoewel de beschreven techniek maakt gebruik van recombinant humaan Bindweefsel groeifactor (rhCTGF) als voorbeeld, kan een grote verscheidenheid aan COI onmiddellijk kunnen worden gebruikt. Bovendien is deze werkwijze gebruikt 96-well platen de hoeveelheid reagentia die nodig zijn om proliferatie β-cellen te beoordelen minimaliseren. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere biomaterialen en andere endocrine celeigenschappen zoals celoverleving en differentiatie status gebruiken.
Introduction
Pancreatische β-cellen zijn de enige insulineproducerende cellen in het lichaam en is essentieel voor bloedglucose homeostase. Terwijl gezonde individuen voldoende β-celmassa en functionaliteit, om goed te reguleren bloedglucose, zijn individuen met diabetes gekenmerkt door onvoldoende β-celmassa en / of functie 1,2. Het is voorgesteld dat het induceren van proliferatie β-cel kan uiteindelijk stijgen β-celmassa en herstellen glucose homeostase bij patiënten met diabetes 3. Echter, beoordeling en validatie van mogelijke β-celproliferatieve verbindingen intacte eilandjes noodzakelijk voor effectieve therapieën kunnen worden ontwikkeld. Transplantatie van postmortale menselijke eilandjes in personen met diabetes herstelt bloedglucose homeostase enige tijd, maar de beschikbaarheid en het succes van deze experimentele procedure wordt gehinderd door een gebrek aan menselijke eilandjes voor transplantatie en ß-celdood in de eilandjes achtersteer transplantatie 4. Zelfs met de ontdekking van factoren die vermenigvuldiging van insulineproducerende cellen induceren een belangrijke uitdaging bestaat nog verwezenlijken van deze factoren relevante sites in vivo. Een strategie voor duurzame lokale afgifte van β-celproliferatieve verbindingen poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA). PLGA heeft een gebruiksgeschiedenis in FDA goedgekeurde geneesmiddel levering producten vanwege de hoge veiligheid, biologische afbreekbaarheid en afgiftekinetiek verlengde 5. Specifiek PLGA is een copolymeer van lactide en glycolide dat afbreekt door hydrolyse met water, hetzij in vivo of in kweek in melkzuur en glycolzuur, zijn natuurlijk voorkomende metabolieten in het lichaam. De ingekapselde geneesmiddel verbinding kan worden vrijgegeven in de omgeving van zowel diffusie en / of afbraak gecontroleerde afgiftemechanismen. Inkapseling van COI beschermt tegen enzymatische degradatie, verbetering van de biobeschikbaarheid van het reagens ten opzichte unencapsulated COI 5. Wij stellen voor dat PLGA microsferen kunnen worden gebruikt om kandidaat-verbindingen intacte eilandjes dienen in cultuur, en uiteindelijk in vivo. Het testen van de werkzaamheid van PLGA tot β-cel mitogenen toedienen aan eilandjes ex vivo kritisch voor transplantatie protocol worden onderzocht.
Momenteel is er geen techniek om proliferatie β-cellen in levende dieren te meten. Experimenten om de effectiviteit van mogelijke proliferatieve verbindingen in vivo te beoordelen vereisen daarom toediening van deze verbindingen levende dieren, met daaropvolgend dissectie en verwerking van pancreata voor immunokleuring. Dergelijke protocollen zijn duur en arbeidsintensief en vereisen de verbinding systemisch worden toegediend, zonder garantie dat de eilandjes bereiken. Omgekeerd verschillende β-geïmmortaliseerde cellijnen beschikbaar voor de studie van insulineproducerende cellen in kweek, maar deze cellijnen missen het eilandje architectuur en environment gevonden in levende organismen 6. Β-geïmmortaliseerde cellijnen worden ook gekenmerkt door een opvallend hoger dan replicatie endogene β-cellen in vivo, waardoor complicerende analyse van verbindingen die proliferatie induceren. In deze studie beschrijven we een protocol dat intacte eilandjes geïsoleerd uit volwassen muizen gebruikt. In tegenstelling tot de β-cellijnen, intact eilandjes behouden normale eilandje architectuur. Ook in tegenstelling tot experimenten in vivo toediening proliferatieve verbindingen direct gekweekte intacte eilandjes vermindert de hoeveelheid reagentia die nodig zijn om nauwkeurig proliferatie β-cel.
De huidige studie gebruikt PLGA een COI beheren, in dit voorbeeld, recombinante humane bindweefselgroeifactor (rhCTGF). De hier beschreven methode geeft een aanzienlijk voordeel ten opzichte van de toediening van ruwe verbinding gekweekte eilandjes omdat het zorgt voor een continue afgifte van de verbinding in the media. Met name kan deze test worden aangepast aan een grote verscheidenheid aan eiwitten en antilichamen van belang intacte eilandjes dienen. Endocrine effecten op andere celtypen, waaronder α-cellen kunnen worden geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de Vanderbilt Institutional Animal Care en gebruik Committee.
1. Labeling COI met Fluorofoor (optioneel)
- Kies een fluorescente kleurstof die reageren met een vrij primair amine (bijvoorbeeld een eiwit), zoals succinimidyl esters of fluoresceïne derivaten op microsfeer lading visualiseren. Ontbinden 8x molaire overmaat (ten opzichte van mol COI) fluorofoor in 200 gl dimethylsulfoxide (DMSO).
- Resuspendeer 50 mg COI tot een eindvolume van 800 pl in een drageroplossing (eindconcentratie van 62,5 ng / ul). De drageroplossing hangt af van de bron van de COI.
LET OP: Typisch voertuig oplossingen omvatten fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of DMSO. - Voeg alle van de fluorofoor / DMSO-oplossing van stap 1.1 en resuspendeer de COI. Vortex overnacht bij 4 ° C. Alternatief vortex het reactiemengsel bij kamertemperatuur(RT) gedurende 4 uur.
- Naar aanleiding van de etikettering reactie, verwijder overtollig fluorofoor met een ontzouten kolom.
- Drain opslagbuffer uit ontzoutingskolom en spoelen met 16 ml gedeïoniseerd water. Gooi alle stroom door.
- Voeg de fluorescent gelabelde COI de ontzoutingskolom. Elueer met 1,2 ml gedeïoniseerd water en laat de stroom door.
- Herhaal elutiestap nog vier keer, telkens toevoegen van 1,2 ml gedeïoniseerd water en de stroom verzamelen door middel van een afzonderlijk monster.
- Freeze alle verzamelde doorstroming monsters bij -80 ° C en lyofiliseren volgens de instructies van de fabrikant gedurende 24 uur.
2. COI-loaded microbolvormpreparaat via het water-in-olie-in-water emulsie werkwijze met oplosmiddelverdamping
- Voeg 1 mg fluorescent gelabelde COI tot 100 pl gedeïoniseerd water tot de eerste waterfase (W1) vormen.
- Los op 65 mg van poly (melkzuur-co-glycolzuur acid) (50:50 lactide: glycolide, molecuulgewicht 54.000 - 69.000) in 750 pl methyleenchloride in een microcentrifugebuis. Ultrasonicate voor 10 - 30 sec (bij 160 W) om de PLGA volledig op te lossen. Dit vormt de oliefase (O).
- Voeg alle van de W1 fase gegenereerd in stap 2.1 van de O fase in een druppelsgewijze manier. Emulgeren met een hand gehouden homogenisator bij 20.000 tpm gedurende 30 seconden om de W1 / O-fase vormen.
- Voeg alle W1 / O-fase in een druppelsgewijze wijze 15 ml van een 1% (gewicht / volume) waterige poly (vinylalcohol) oplossing (PVA) en emulgeren onder toepassing van een draagbare homogenisator bij 20.000 tpm gedurende 30 sec .
- Overdracht van al de emulsie opgewekt in stap 2.4 een 200 ml rondbodemkolf en onder een 635 mm Hg vacuüm met een rotatieverdamper gedurende 1 uur om het oplosmiddel te verwijderen en het genereren van de waterfase.
- Aliquot 1 ml van de waterige fase geproduceerd in stap 2,5 tot veertien microcentrifugebuizen. Centrifugeren van de oplossing in microcentrifugebuizen van 7500xg gedurende 8 minuten.
Opmerking: In deze stap worden de microbolletjes aanwezig in de resterende waterige oplossing en geconcentreerd tot de bodem van de microcentrifugebuis. - Verwijder voorzichtig 900 pi oplossing van de microcentrifuge buizen met een micropipet, pipetteren om de microsferen niet storen aan de onderkant van de microcentrifugebuis.
- Was de overmaat PVA microbolletjes door toevoeging van 1 ml gedeïoniseerd water aan elke microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 7500 xg gedurende 8 min en opnieuw verwijder voorzichtig 900 pi oplossing van de microcentrifuge buizen met een micropipet, pipetteren om de microsferen niet storen aan de onderkant van de microcentrifugebuis.
OPMERKING: De resterende 100 pl waterige oplossing de gegenereerde microsferen.
- Was de overmaat PVA microbolletjes door toevoeging van 1 ml gedeïoniseerd water aan elke microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 7500 xg gedurende 8 min en opnieuw verwijder voorzichtig 900 pi oplossing van de microcentrifuge buizen met een micropipet, pipetteren om de microsferen niet storen aan de onderkant van de microcentrifugebuis.
- Bevries de microsfeer waterige oplossing geproduceerd in stap 2,7 bij -80 ° C.
- Lyophilize microsferen met een vriesdroger volgens de fabrikantinstructies en bewaar bij -20 ° C.
OPMERKING: Meten beladingsgraad van de COI door het volledig oplossen van PLGA microsferen en het bepalen van de eiwitconcentratie opzichte van een standaardkromme van vrij eiwit 7. - Als negatieve controle, genereert een batch "blanco" microbolletjes (hierna controlemicrosferen).
Opmerking: Het produceren van controlemicrosferen is identiek aan de vorming van hydrofiele COI-geladen microsferen, zonder COI Naast 800 gl van het voertuig in stap 1,2. Match controle deeltjes in de massa concentratie van PLGA ten opzichte van COI geladen PLGA microsferen voor β-cel mitogeen assay.
3. Voorbereiding van Islet voedingsbodems en pre-assay Media
- Bereid 200 ml media voor de kweek van intacte muizen eilandjes: RPMI 1640 medium aangevuld met 11 mM glucose, 10% paardenserum, 100 U / ml penicilline G en 100 ug / ml streptomycine (hierna islaat cultuur media).
LET OP 1: In tegenstelling tot foetaal runderserum (FBS), paardenserum ontbreekt placenta lactogeen, een inductor van β-cel proliferatie, die analyse verwart in de proliferatie-assay.
NB 2: Zoals de PLGA microsferen niet voor gebruik worden gesteriliseerd, de toevoeging van antibiotica aan het kweekmedium is cruciaal om microbiologische besmetting te voorkomen. - Verwijder 25 ml van eilandje cultuur media met een elektronische pipet en plaats in een 50 ml conische buis. Vul het 25 eilandje ml kweekmedium in de 50 ml conische buis met een eindconcentratie van 0,2 mM EGTA aan de pre-test media genereren.
NB: De toevoeging van EGTA los mild cel-cel contacten in de eilandjes zonder dat eilandje architectuur. Dit helpt ervoor te zorgen de COI kan de binnenste cellen van het eilandje te bereiken en helpt necrose van de centrale eilandje te voorkomen.
4. Het kweken van de Intact Mouse Islets
- Isoleer intacte eilandjes uit een vooraf geselecteerde stam, geslacht, age en genotype van muizen na een routine collagenase vertering van de alvleesklier 8,9. Pool eilandjes met elkaar uit als monsters.
- Aliquot 40 eilandjes in een putje van een 96-well weefselkweekplaat in 200 gl kweekmedium eilandje. Visueel size-match eilandjes per putje (een exacte beoordeling van de eilandjes van Langerhans gelijkwaardigheid (IEQ) tussen de monsters is niet nodig). Vul lege putten direct grenzend aan putjes met eilandjes met 200 ul steriel water om een verdamping buffer te voorzien. Cultuur eilandjes media overnacht bij 37 ° C onder een atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2.
5. Re-opschorting van de COI-loaded and Control PLGA microsferen
- Na overnacht eilandje herstel resuspendeer microsferen door het toevoegen van pre-testmedium een aliquot van gevriesdroogde COI-beladen PLGA microsferen zodanig dat de eindconcentratie van COI in de microcentrifugebuis is 10 ng / pl (de hoeveelheid COI aanwezig is in een bepaalde hoeveelheid de gegenereerde microsPheres werd bepaald in stap 2.9). Ultrasone trillingen de geresuspendeerde COI-beladen microbolletjes in een ijswaterbad gedurende 10 minuten bij 160 W met 10 sec lange pulsen bij 4 ° C.
- Resuspendeer control PLGA microbolletjes met hetzelfde volume van pre-testmedium toegevoegd aan een gelijke hoeveelheid van gevriesdroogde controle PLGA microsferen. Ultrasone trillingen de geresuspendeerde control PLGA microsferen in een ijswaterbad gedurende 10 minuten bij 160 W met 10 sec lange pulsen bij 4 ° C.
- Visueel bevestigen microsferen worden verspreid door pipetteren 2 pl gesuspendeerd microsferen tussen twee dekglaasjes. Visualiseren microsferen met een 40X objectief op epifluorescentie of helderveld microscoop.
- Indien significante aggregatie van microsferen is nog zichtbaar, ultrasone trillingen in een ijswaterbad gedurende nog 10 minuten bij 160 W met 10 sec lange pulsen bij 4 ° C en herhaal visualisatie geresuspendeerde microsferen.
6. Behandeling van eilandjes met COI-geladen of control PLGA microsferen </ P>
- Voor iedere put worden behandeld met COI-geladen microsferen, bereid testmedium door verdunning van de 10 ng / ul van de geresuspendeerde COI microsferen met vooraf testmedium een eindvolume van 100 pl en een vooraf bepaalde eindconcentratie.
OPMERKING: De optimale eindconcentratie van het eiwit varieert van COI voor deze test. Idealiter een reeks eindconcentraties worden getest. - Voor iedere put worden gebruikt als een controle, bereid control testmedium door verdunning van de geresuspendeerde control PLGA microbolletjes gegenereerd in stap 5.2 met dezelfde verdunningsvolume gebruikt om de COI-beladen microbolletjes verdunnen in stap 6,1.
OPMERKING: Eilandjes behandeld met controle testmedium zal dienen als een negatieve controle voor de detectie van enig effect de lege microsferen kunnen hebben op de experimentele resultaten mogelijk. - Verwijder voorzichtig 100 ul van eilandje cultuur media uit elk putje met een micropipet zodanig dat er geen eilandjes zijn losgeraakt van de putten. Zachtjes voeg 100 μl testmedium of 100 pl control testmedium aan elk putje.
- Incubeer eilandjes bij 37 ° C onder een atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2 gedurende drie dagen.
7. Verspreiden Intact Eilandjes op Microscope Slides
- Na drie dagen, gebruik een micropipet voorzichtig verwijdert en weggooit testmedium uit alle putjes zodat geen eilandjes verwijderen. Zachtjes voeg 200 ul PBS om eilandjes om ze te wassen van de test media. Verwijder voorzichtig en gooi PBS met een micropipet en voorzichtig weer wassen eilandjes met een extra 200 ul PBS.
- Verwijdert en weggooit PBS met een micropipet en voeg 100 ul van 0,025% trypsine, 2 mM EDTA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Pipet eilandjes in de trypsine-EDTA-oplossing op en neer elke 2 min totdat eilandjes visueel bevestigd worden gedispergeerd in afzonderlijke cellen (sommige kleine klompjes cellen nog steeds aanwezig kan zijn) met een lichtmicroscoop. Breng de gehele volume van elk putje individuelely in labeled- microcentrifugebuizen.
- Voeg 400 ul eilandcellen kweekmedium aan elke microcentrifugebuis met de trypsine-gemedieerde dissociatie stoppen.
- Centrifuge monsters 5 min bij 100 xg bij 4 ° C tot pellet eilandje cellen onderaan microcentrifugebuizen.
- Verwijder voorzichtig supernatant met behulp van een micropipet, en resuspendeer pellet in 200 ui verse eilandje cultuur media.
- Met behulp van een cyto-centrifuge, centrifuge gescheiden eilandjes op 140 g gedurende 3 min op een toeslag van microscoopglaasjes.
- Lucht drogen dia's bij kamertemperatuur gedurende 10 min, dan trek een kader rond de gedissocieerde eilandjes met een hydrofobe markering pen.
- Fix cellen met 75 pi 4% paraformaldehyde (PFA) bij KT gedurende 10 min. Verwijderen 4% PFA en voorzichtig te wassen cellen in 75 ui PBS twee keer. Na wassen doorlaatbaar cellen met 75 pi 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 10 min. Daarna wassen cellen met 75 pl PBS.
Let op: PFA is bekend allergeen, kankerverwekkend en giftig. 8. Immunofluorescentie Labeling van Gescheiden eilandjes voor insuline en de Cell Proliferation Marker, Ki67 - Bereid een vochtige kamer door twee natte papieren handdoeken in de bodem van een 100 dia capaciteit microscoopglaasje vak.
- Plaats dia's plat neer (cellen naar boven) in vochtige kamer. Bereiden monsters voor labeling door opzuigen van de PBS uit de vorige wasstap met behulp van een micropipet en het toevoegen van 75 ul van blokkeeroplossing (5% Normal Donkey Serum (NDS) in PBS) aan elk objectglaasje om niet-specifieke binding van antilichamen aan de specimens blokkeren. Incubeer dia's in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij KT.
- Voorzichtig aspireren blokkeeroplossing behulp van een micropipet en voeg 75 ul van primaire antilichaamoplossing die cavia anti-insuline en konijn anti-Ki67-antilichamen verdund 1 ug / ml in 5% NDS in PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
LET OP: Alternative markers van celproliferatie omvatten uitdijende cel nucleair antigen (PCNA) en phosphohistone H3 (PH3), - Zuig primaire antilichaamoplossing met behulp van een micropipet en spoel de cellen met 75 pl PBS. Aspireren PBS met behulp van een micropipet en spoel cellen twee keer met telkens 75 pi PBS. Incubeer elk monster met 75 ul anti-cavia Cy5 secundair antilichaam en anti-konijn Cy3 secundair antilichaam verdund tot 2 ug / ml in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij KT.
OPMERKING: Gebruik secundaire antilichamen gemerkt met dezelfde of overlappende fluorofoor spectraal reeds werd toegepast om de microsferen te labelen. - Aspireren secundaire antilichaamoplossing met behulp van een micropipet en incubeer bij 75 ui 300 nM DAPI in PBS gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren DAPI behulp van een micropipet en spoelen in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.
- Zuig water uit monsters met behulp van een micropipet. Spot een druppel (ongeveer 100 pl) van sneldrogende montage oplossing die antifade reagens op een glazen dekglaasje. Keren de microscoopglaasje monster naar beneden, onto de montage oplossing. Druk voorzichtig op het dekglaasje tegen de schuif met behulp van een pipet tip om bellen te verwijderen en veeg overtollige vloeistof weg met een zachte reiniging weefsel. Laat dekglaasjes een nacht drogen bij kamertemperatuur.
- Gebruik een epifluorescentiemicroscoop met een aangesloten camera voor het overname. Voor elke fluorofoor, het bepalen van de optimale belichtingstijd (typisch 20 msec voor DAPI, 40-80 msec voor insuline, en 250 msec voor Ki67). Zorg ervoor dat beeldopname parameters gelijk voor alle monsters.
- Voor elk monster handmatig tellen 3000 insuline-positieve cellen en die tellen hoeveel ook Ki67-positieve. Tellen alleen de insuline-positieve cellen die een welomschreven en duidelijk zichtbare kern hebben. Bereken het percentage prolifererende β-cellen voor elk monster door het aantal Ki67-positieve / insuline-positieve cellen te delen door het totale aantal insuline-positieve cellen en vermenigvuldigen met 100.
- na determining het percentage prolifererende β-cellen voor elk monster te bepalen of een statistisch significant verschil in β-celproliferatie bestaat tussen controle en experimentele monsters door het analyseren van resultaten met een one-way ANOVA met behulp van commercieel beschikbare statistische software.
9. Image Acquisition and Analysis
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 is een visuele weergave van de microsferen geproduceerd met de bovenstaande protocol. De hier beschreven protocol levert rhCTGF-beladen microsferen van verschillende groottes. De grootste fractie van microsferen zal tussen 1 en 10 urn in diameter, hoewel sommige microsferen groter (Figuur 2) zijn. Desgewenst kan microsfeergrootte worden afgestemd en geoptimaliseerd op basis fabricage parameters zoals homogeniseren snelheid en tijd, surfactant gebruikt en relatieve hoeveelheden van elk water / olie / water-fase 10.
Na dispersie van intacte eilandjes behandeld met PLGA microsferen en daaropvolgende immunokleuring, is het gebruikelijk om gebieden van het monster zonder enige labeling tussen cellen (figuur 3) te zien. Terwijl de meeste microsferen die nog intact zijn na het verstrijken cultuur behandelingverwijderd tijdens het wassen stappen, sommige blijven nadat de eilandjes worden gesponnen op de microscoop dia's. Deze microsferen ertoe leiden dat de hole-achtige structuren gevisualiseerd tijdens de beeldvorming. Deze overgebleven microsferen meestal niet verstoren latere kwantificering.
Na beeldvorming, kan het percentage Ki67-positieve / insuline-positieve cellen worden gekwantificeerd door het aantal handmatig tellen van gemerkte cellen, of met behulp beeld analyse software. Eerder hebben wij aangetoond dat recombinante humane bindweefselgroeifactor (rhCTGF) proliferatie muizen β-cel kan stimuleren intacte eilandjes ex vivo 11. Met behulp van de eerder genoemde protocol, genereerden wij PLGA microsferen met rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Behandelen intacte eilandjes met rhCTGF-PLGA microsferen gedurende 3 dagen resulteerde in een gelijke toename van β-celproliferatie als eerder voor het ruwe eiwit, wat aantoont dat het eiwit niet lo se elke microsfeer worden blijven genereren (Figuur 4).
Figuur 1:. Visuele weergave van PLGA microsferen Door het opnemen van een fluorescerende kleurstof in de productie protocol kunnen PLGA microsferen worden gevisualiseerd met behulp van een microscoop epifluorescerende. Schaal bar vertegenwoordigt 200 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Grootteverdeling van microsferen PLGA Hoewel grootteverdeling kan variëren, zullen de meeste microbolletjes kleiner dan 10 urn in diameter.arget = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Immunofluorescente Visualisatie van gespreide Prolifererende β-cellen Verspreide eilandjes immunolabeled de proliferatie merker Ki67 (rood) en insuline (groen) markeren β-prolifererende cellen. Kernen zijn gelabeld met DAPI (blauw). Pijlen geven Ki67-positief / insuline-positieve cellen. Sterretjes (*) geven onverteerbaar microsferen. Schaal bar vertegenwoordigt 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering en analyse van β-cel Proproliferatie. eilandjes behandeld met verschillende hoeveelheden rhCTGF-PLGA microsferen. Het aantal Ki67-positieve / insuline-positieve cellen werd geteld hand van alle monsters en uitgedrukt als percentage van het totale aantal insuline-positieve β-cellen. X-as komt overeen met de uiteindelijke concentratie van rhCTGF aanwezig in elke behandeling. Statistische significantie werd bepaald met een one-way ANOVA gevolgd door meervoudige vergelijkingstest Tukey. Statistische significantie werd vastgesteld op p ≤ 0,05. Fout balken geven standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De studie van β-celproliferatie in kweek wordt gewoonlijk afgeremd door een aantal moeilijkheden. Eerst worden geïmmortaliseerde β-cellijnen gekarakteriseerd door een hogere graad van proliferatie dan wat in endogene β-cellen in levende eilandjes. Bovendien zijn deze geïmmortaliseerde cellijnen missen de normale architectuur essentieel voor normale β-celfunctie. Deze twee feiten maken het moeilijk om te bepalen of de resultaten verkregen met β-geïmmortaliseerde cellijnen opgaan wanneer getest in vivo of geheel eilandjes. Onze beschreven protocol, dat vers geïsoleerde eilandjes intact muis gebruikt, omzeilt deze problemen als het eilandje architectuur onderhouden en β-celproliferatie is vergelijkbaar met die in vivo.
Een belangrijke zorg bij het kweken van eilandjes intact is de mogelijkheid dat cellen in de eilandjes kern hypoxie geïnduceerde necrose ondergaan of zullen niet worden blootgesteld aan rhCTGF. Daarom, een definitieveconcentratie van 0,1 mM EGTA toegevoegd aan de media tot cel-cel contacten los zonder verstoring eilandje architectuur. We hebben eerder bekend dat de toevoeging van EGTA alleen β-celproliferatie, waarschijnlijk door een betere toegang van nutriënten en mitogenen in de media het eilandje kern 12 kan verhogen. De toename van β-celproliferatie in respons op EGTA kan ook worden veroorzaakt door de afname in cel-cel contact zelf 13,14. De in dit protocol beschreven medium wordt ook aangevuld met paardenserum in plaats van de meer traditionele foetaal runderserum. Deze substitutie is gemaakt door de aanwezigheid van placenta lactogen in foetaal runderserum, die proliferatie β-cel kan stimuleren op zich potentieel complicerende analyse bij de proliferatie assay.
Bepaling van de relatieve toxiciteit van de PLGA microsferen (met of zonder COI) naar het eilandje cellen kunnen worden beoordeeld via immunofluorescentie analyse van markers van celdood of DNA-schade, waaronder TUNEL of γ-H2AX 15,16. Hoewel de toevoeging van PLGA microsferen geen noemenswaardige nadelige effecten op eilandjes ex vivo is gebleken, moeten de gebruikers zich bewust zijn van de effecten op de microsferen kan beeldanalyse hebben. Zoals aangetoond in Figuur 3 en in het gedeelte resultaten vermeld kan afgebroken microsferen zichtbaar als donkere plekken in immunofluorescentie beelden, meer microsferen verschijnen bij toenemende concentraties gebruikt worden.
Opgemerkt wordt dat de beschreven protocol is aangepast om met geïsoleerde eilandjes muis. Als zodanig is het onduidelijk of identieke omstandigheden zullen met eilandjes geoogst van andere organismen, zoals de rat en de mens. Opmerkelijk eilandjes geoogst van verschillende organismen vaak verschillende optimale kweekomstandigheden en verschillende graden van β-celproliferatie 17,18.
talrijke biomaterialen potentieel beschikbaar rhCTGF toedienen aan geïsoleerde eilandjes, zoals poly (thioketaal-urethaan) en poly (propyleen sulfide) 19. We hebben ervoor gekozen om zich te concentreren op PLGA te wijten aan een aantal opmerkelijke kwaliteiten die het bezit. Eerst PLGA is een relatief betaalbaar reagens en de microsferen kunnen worden gemaakt met standaarduitrusting (centrifuge, homogenisator, vriesdroger) verkrijgbaar bij de meeste onderzoeksinstellingen. PLGA is een kunstmatige polymeer dat precedent voor succesvol gebruik in FDA goedgekeurde apparaten vanwege zijn biologische verenigbaarheid, biologische afbreekbaarheid, en zijn vermogen om verbinding afgiftesnelheden 20 moduleren heeft. PLGA degradeert door hydrolyse in aanwezigheid van water, het vrijgeven van de lading in het proces. De chemische samenstelling van PLGA deeltjes zodanig worden aangepast dat een verbinding wordt vrijgegeven in vivo over de periode van enkele weken. PLGA is ook gebruikt in preklinische dierproeven en klinische therapieën voor lokaal toe te dienen verbindingen met verschillende organen en tissues 21,22. Andere hydrofobe polymeren kunnen ook worden gebruikt bij het genereren van biologisch afbreekbare microsferen. Deze polymeren kunnen reageren op bepaalde prikkels uit de omgeving, zoals pH, temperatuur en de aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten 23,24. Daarom moet onderzoekers zorgvuldig te overwegen welke biomateriaal is het meest geschikt is voor hun studie.
Elke onderzoeker gebruik te maken van PLGA, of andere biomaterialen, om te studeren β-celproliferatie ex vivo moeten zich bewust zijn van de mogelijke verschillen tussen de effecten van ingekapselde COI in vergelijking met niet-ingekapselde COI. Zo kan de levering van rhCTGF via PLGA de mate en timing van β-celproliferatie inductie wijzigen vergelijking met behandeling met ingekapseld eiwit. Lopende studies in ons lab onderzoeken momenteel deze potentiële verschillen.
De analyse van β-celproliferatie in gekweekte eilandjes is een krachtig model voor de identificatie en mechanistic analyse van β-cel mitogenen. Met de hier beschreven tonen wij een relatief snelle en kosteneffectieve werkwijze voor het toedienen van een COI geïsoleerde eilandjes gekweekt met verlengde afgifte assay voertuig. Deze test moet van toepassing zijn op bijna elk COI van belang, en onze keuze om te focussen op CTGF zijn is puur gebaseerd op de eerder gepubliceerde vermogen om proliferatie β-cellen te stimuleren in vivo en ex vivo 11. Bovendien kan deze test de effectiviteit en veiligheid van het gebruik van PLGA als een levering methode te valideren alvorens naar modellen waar de eilandjes worden getransplanteerd in levende organismen. Kortom, de beschreven protocol verschaft een nieuwe manier om verbindingen gekweekt eilandjes toedienen met een grotere invloed op het meten van de veiligheid van PLGA tot transplanteerbare weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
