Abstract
El desarrollo de biomateriales ha aumentado significativamente el potencial para la entrega dirigida de fármacos a una variedad de tipos de células y tejidos, incluyendo las células ß pancreáticas. Además, las partículas de biomateriales, hidrogeles, andamios y también proporcionan una oportunidad única para administrar sostenida, la administración de fármacos controlable para ß-células en cultivo y en modelos de tejidos trasplantados. Estas tecnologías permiten el estudio de los factores de proliferación de células β candidato utilizando islotes intactos, así como un sistema de traslación correspondiente. Por otra parte, la determinación de la eficacia y la viabilidad de los factores de candidatos para estimular la proliferación de las células β en un sistema de cultivo es fundamental antes de seguir adelante con los modelos in vivo. Aquí se describe un método para co-cultivo de islotes de ratón intactas con el compuesto biodegradable de interés (CDI) poli RESORTE (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) con el fin de evaluar los efectos de la liberación sostenida in situ ofactores mitogénicos f sobre la proliferación de las células β. Esta técnica se describe en detalle cómo generar microesferas de PLGA que contienen una carga deseada usando reactivos disponibles comercialmente. Mientras que la técnica descrita utiliza el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF) como un ejemplo, fácilmente se podría utilizar una amplia variedad de COI. Además, este método utiliza placas de 96 pocillos para reducir al mínimo la cantidad de reactivos necesarios para evaluar la proliferación de células β. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar biomateriales alternativos y otras características de las células endocrinas, tales como la supervivencia celular y el estado de diferenciación.
Introduction
células ß pancreáticas son las únicas células productoras de insulina en el cuerpo y son críticos para mantener la homeostasis de glucosa en sangre. Mientras que los individuos sanos tienen suficiente masa de células β y la función de regular adecuadamente la glucosa en sangre, las personas con diabetes se caracteriza por la masa de células β insuficiente y / o función 1,2. Se ha propuesto que la inducción de la proliferación de células β última instancia, puede aumentar la masa de células β y restaurar la homeostasis de la glucosa en individuos con diabetes 3. Sin embargo, la evaluación y validación de los posibles compuestos de proliferación de células β en los islotes intactos es necesario antes de terapias eficaces se pueden desarrollar. El trasplante de islotes de cadáveres humanos en los individuos con diabetes restaura la homeostasis de la glucosa en sangre durante un tiempo, pero la disponibilidad y el éxito de este procedimiento experimental se ve obstaculizada por la escasez de islotes humanos disponibles para el trasplante y la muerte de las células beta en los islotes de popatrasplante er 4. Incluso con el descubrimiento de los factores que inducen la multiplicación de las células productoras de insulina, un reto importante todavía existe en la entrega de estos factores a sitios relevantes in vivo. Una estrategia para la entrega local sostenida de compuestos de proliferación de células β es el poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tiene una historia de uso en productos aprobados por la FDA de administración de fármacos debido a su alta seguridad, biodegradabilidad, y la cinética de liberación prolongada 5. Específicamente, PLGA es un copolímero de lactida y glicolida que se degrada por hidrólisis con agua, ya sea in vivo o en cultivo en ácido láctico y ácido glicólico, que son metabolitos de origen natural en el cuerpo. El compuesto fármaco encapsulado puede ser liberado en el medio ambiente circundante tanto por difusión y / o mecanismos de liberación de degradación controlada. La encapsulación de COI proporciona protección contra la degradación enzimática, mejorar la biodisponibilidad del reactivo en comparación con unencapsulaTed COI 5. Sugerimos que microesferas de PLGA se pueden utilizar para administrar compuestos candidatos a islotes intactos en cultivo, y en última instancia en vivo. Prueba de la eficacia de PLGA para administrar los mitógenos de las células β de los islotes ex vivo es crítico antes se exploran los protocolos de trasplante.
Actualmente, no existe una técnica para medir la proliferación de células β de animales vivos. Los experimentos para evaluar la eficacia de los compuestos potenciales de proliferación in vivo, por tanto, requiere la administración de estos compuestos a los animales vivos, con la disección posterior y el procesamiento de los páncreas de inmunomarcación. Tales protocolos son caros y laboriosos y requieren que el compuesto se administra por vía sistémica, sin ninguna garantía de que van a llegar a los islotes. Por el contrario, varias líneas de células inmortalizadas β están disponibles para el estudio de las células productoras de insulina en la cultura, pero estas líneas celulares carecen de la arquitectura de los islotes y ambient encuentra en los organismos que viven 6. Líneas de células inmortalizadas β también se caracterizan por tener un grado mucho más alto de replicación de las células beta endógenas in vivo, por lo tanto el análisis de compuestos que inducen la proliferación de complicación. En este estudio, se describe un protocolo que utiliza islotes intactos aisladas de ratones adultos. A diferencia de las líneas de células β, islotes intactos conservan la arquitectura normal de los islotes. Asimismo, en contraste con los experimentos llevados a cabo in vivo, la administración de compuestos proliferativos directamente a islotes intactos cultivadas reduce significativamente la cantidad de reactivos que es necesario medir con precisión la proliferación de células β.
El estudio actual utiliza PLGA para administrar un COI, en este ejemplo, el factor recombinante humano de crecimiento de tejido (rhCTGF). El método descrito aquí confiere una ventaja significativa sobre la administración del compuesto en bruto a los islotes cultivadas ya que permite una liberación continua del compuesto en THmedios electrónicos. En particular, este ensayo puede ser modificado para administrar una amplia variedad de proteínas y anticuerpos de interés a los islotes intactos. Efectos en otros tipos de células endocrinas, incluyendo las células alfa, también pueden analizarse.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Vanderbilt.
1. El etiquetado con fluoróforo COI (Opcional)
- Elija un colorante fluorescente que reaccionará con una amina primaria libre (por ejemplo, en una proteína), tales como ésteres de succinimidilo o derivados de fluoresceína, para visualizar la carga de las microesferas. Disolver exceso molar 8x (con relación a moles de COI) de fluoróforo en 200 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Resuspender 50 mg de COI hasta un volumen final de 800 l en una solución de vehículo (concentración final de 62,5 ng / l). La solución de vehículo variará dependiendo de la fuente de la COI.
NOTA: El vehículo típico soluciones incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) o DMSO. - Añadir toda la solución de fluoróforo / DMSO del paso 1.1 y resuspender el COI. Vortex durante la noche a 4 ° C. Alternativamente, vórtice la mezcla de reacción a temperatura ambiente(RT) durante 4 h.
- Después de la reacción de marcaje, eliminar el exceso de fluoróforo utilizando una columna de desalado.
- Escurrir tampón de almacenamiento de la columna de desalación y enjuague con 16 ml de agua desionizada. Desechar todo el flujo a través.
- Añadir el COI marcado con fluorescencia a la columna de desalado. Eluir con 1,2 ml de agua desionizada y se recoge el flujo a través.
- etapa de elución repetir un adicional de cuatro veces, cada vez añadiendo 1,2 ml de agua desionizada y recoger el flujo a través de como una muestra separada.
- Congelar todo el flujo de recogida a través de las muestras a -80 ° C y liofilizar según las instrucciones del fabricante para las 24 horas.
2. COI-cargada de microesferas Preparación través del agua de agua-en-aceite-en-Emulsión disolvente de evaporación Método
- Añadir 1 COI mg de marcado con fluorescencia a 100 l de agua desionizada para formar la primera fase de agua (W1).
- Disolver 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactida: glicolida, peso molecular 54.000 - 69.000) en 750 l de diclorometano en un tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate de 10 a 30 seg (a 160 W) para disolver completamente el PLGA. Esto forma la fase de aceite (O).
- Añadir toda la fase W1 generado en la etapa 2.1 a la fase O de una manera gota a gota. Emulsionar usando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar la fase W1 / O.
- Añadir toda la fase de E / S W1 de una manera gota a gota a 15 ml de una 1% (peso / volumen) de poli acuoso (alcohol de vinilo) de solución (PVA) y emulsionar utilizando un homogeneizador de mano a 20.000 rpm durante 30 sec .
- Transferir todo de la emulsión generada en la etapa 2.4 a un 200 ml matraz de fondo redondo y sujeto a un 635 mm Hg de vacío usando un evaporador rotatorio durante 1 hora para eliminar el disolvente y generar la fase acuosa.
- Alícuota de 1 ml de la fase acuosa generado en la etapa 2.5 a catorce tubos de microcentrífuga. Centrifugación de la solución acuosa en los tubos de microcentrífuga a 7500g durante 8 min.
NOTA: En este paso, las microesferas están presentes en la solución acuosa remanente y se concentran a la parte inferior del tubo de microcentrífuga. - Retire cuidadosamente 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga.
- Se lavan las microesferas de exceso de PVA por adición de 1 ml de agua desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 xg durante 8 min, y de nuevo retirar con cuidado 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga.
NOTA: La solución acuosa de 100 l restante contiene las microesferas generados.
- Se lavan las microesferas de exceso de PVA por adición de 1 ml de agua desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 xg durante 8 min, y de nuevo retirar con cuidado 900 l de solución acuosa a partir de los tubos de microcentrífuga con una micropipeta, de pipeteado con el fin de no molestar a las microesferas en el fondo del tubo de microcentrífuga.
- Congelar la solución acuosa de microesferas generada en el paso 2.7 a -80 ° C.
- microesferas liofilizar utilizando un liofilizador de acuerdo con el fabricante delinstrucciones y almacenar a -20 ° C.
NOTA: medir la eficiencia de carga de la COI disolviendo completamente microesferas de PLGA y la determinación de la concentración de proteína en relación con una curva estándar de la proteína libre 7. - Como control negativo, generar un lote de microesferas "en blanco" (en lo sucesivo, microesferas de control).
NOTA: La generación de microesferas de control es idéntica a la generación de microesferas cargadas-COI hidrófilos, sin adición COI a 800 l de la solución de vehículo en el paso 1.2. partículas de control de ajuste de la concentración de masa de PLGA en relación con microesferas de PLGA cargadas-COI para el ensayo de mitógeno de las células β.
3. Preparación de los islotes Medios de cultivo y medios de comunicación pre-ensayo
- Preparar 200 ml de medio para el cultivo de islotes de ratón intactas: RPMI 1640 suplementado con glucosa 11 mM, 10% de suero de caballo, 100 U / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina (en lo sucesivo, esdejar que los medios de cultivo).
NOTA 1: A diferencia de suero fetal bovino (FBS), suero de caballo carece de lactógeno placentario, un inductor de la proliferación de células β, que confunde análisis en el ensayo de proliferación.
NOTA 2: Como las microesferas de PLGA no se esterilizan antes de su uso, la adición de antibióticos al medio de cultivo es crucial para evitar la contaminación microbiológica. - Retire 25 ml de medio de cultivo de islotes con una pipeta electrónica y colocar en un tubo cónico de 50 ml. Suplemento los 25 ml de medios de cultivo de los islotes en el tubo cónico de 50 ml con una concentración final de EGTA 0,2 mM para generar los medios de pre-ensayo.
NOTA: La adición de EGTA afloja ligeramente contactos célula-célula en los islotes sin alterar la arquitectura de los islotes. Esto ayuda a asegurar la COI puede llegar a las células internas del islote y ayuda a prevenir la necrosis de la isleta central.
4. El cultivo de islotes intactos mouse
- Aislar islotes intactos de una cepa pre-seleccionado, sexo, age, y el genotipo de los ratones después de una digestión con colagenasa de rutina del 8,9 páncreas. Piscina islotes juntos desde como muestras.
- Alícuota de 40 islotes en un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos en 200 l de medio de cultivo de los islotes. islotes de tamaño de los partidos visualmente por pocillo (una evaluación precisa de la equivalencia de los islotes (IEQ) entre las muestras no es necesario). Llenar los pozos vacíos inmediatamente adyacentes a los pozos con islotes con 200 l de agua estéril para amortiguar los problemas de evaporación. Cultura islotes en los medios de comunicación durante la noche a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2.
5. Re-suspensión de microesferas de control de PLGA cargadas con los países de origen y
- Después de la recuperación de los islotes durante la noche, las microesferas de volver a suspender mediante la adición de medios de pre-ensayo a una alícuota de liofilizados microesferas de PLGA cargadas con COI de tal manera que la concentración final de COI en el tubo de microcentrífuga es 10 ng / l (la cantidad de COI presente en una cantidad dada de los micros generadosFeres se determinó en el paso 2.9). Sonicar las microesferas cargadas-COI volvió a suspender en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C.
- Resuspender de control de PLGA microesferas añadiendo el mismo volumen de medio pre-ensayo a una masa igual de control liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar las microesferas resuspendidas control de PLGA en un baño de agua con hielo durante 10 minutos a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C.
- confirmar visualmente microesferas se dispersan con la pipeta 2 l de microesferas resuspendidas entre dos portaobjetos de vidrio. Visualizar microesferas utilizando un objetivo 40X en un microscopio de epifluorescencia o campo claro.
- Si la agregación significativa de las microesferas es aún visible, se somete a ultrasonidos en un baño de agua con hielo durante otros 10 min a 160 W con pulsos largos de 10 segundos a 4 ° C y repita la visualización de microesferas resuspendidas.
6. Tratamiento de los islotes con control de PLGA microesferas cargadas con los países de origen o </ P>
- Para cada pocillo para ser tratados con microesferas cargadas-COI, preparar medio de ensayo diluyendo el 10 ng / l de las microesferas resuspendidas COI con los medios de pre-ensayo para un volumen final de 100 l y una concentración final predeterminado.
NOTA: La concentración final óptima de la proteína variará para cada COI utilizado para este ensayo. Idealmente, una gama de concentraciones finales se prueban. - Para cada pocillo para ser usado como control, preparar los medios de ensayo de control mediante la dilución de los de control resuspendidos microesferas de PLGA generados en la etapa 5.2 con el mismo volumen de dilución usado para diluir las microesferas cargadas con COI en el paso 6.1.
NOTA: Los islotes tratados con medio de ensayo de control servirán como control negativo para permitir la detección de cualquier efecto de las microesferas en blanco pueden tener sobre los resultados experimentales. - Retire cuidadosamente 100 l de medio de cultivo de los islotes de cada pocillo con una micropipeta de tal manera que no hay islotes se desprenden de los pozos. añadir con cuidado 100 μl de medio de ensayo o 100 l de medio de ensayo de control a cada pocillo.
- Incubar islotes a 37 ° C bajo una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO 2 durante tres días.
7. La dispersión de los islotes intactos Onto portas de microscopio
- Después de tres días, utilizar una micropipeta para retirar cuidadosamente y deseche medio de ensayo de todos los pozos de modo que no se desprenda islotes. añadir con cuidado 200 l de PBS a los islotes de lavarlas del medio de ensayo. Con cuidado, retirar y desechar PBS con una micropipeta y lavar suavemente islotes de nuevo con un 200 l de PBS adicional.
- Retire y deseche PBS con una micropipeta y añadir 100 l de 0,025% de tripsina, la solución 2 mM de EDTA. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min. Pipet islotes en la solución de tripsina-EDTA arriba y hacia abajo cada 2 min hasta islotes se confirman visualmente a ser dispersados en células individuales (tenga en cuenta que algunos pequeños grupos de células pueden todavía estar presente) utilizando un microscopio de luz. Transferir la totalidad del volumen de cada pozo individualLy en tubos de microcentrífuga labeled-.
- Añadir 400 l de medio de cultivo de los islotes a cada tubo de microcentrífuga para detener la disociación celular de tripsina mediada.
- Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 100 xg a 4 ° C para sedimentar las células de los islotes a la parte inferior de los tubos de microcentrífuga.
- Retire con cuidado el sobrenadante con micropipeta, y el sedimento se vuelve a suspender en 200 medios de cultivo de islotes l fresco.
- Usando una cito-centrífuga, centrífuga disociado islotes a 140 xg durante 3 min en portaobjetos de microscopio cargados.
- Air secar los portaobjetos a TA durante 10 minutos, a continuación, dibuje un cuadro alrededor de los islotes disociadas con un rotulador hidrófobo.
- Fijar las células con 75 l 4% de paraformaldehído (PFA) a TA durante 10 min. Retire el 4% PFA y lavar suavemente las células en 75 l de PBS dos veces. Después del lavado, permeabilizar las células con 75 l 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 10 min. A continuación, lavar las células con 75 l de PBS.
Precaución: PFA se sabe que es alergénica cancerígenos y tóxicos. 8. La inmunofluorescencia etiquetado de los islotes disociada de la insulina y el marcador de proliferación celular, Ki67 - Preparar una cámara húmeda mediante la colocación de dos toallas de papel húmedo en el fondo de una caja portaobjetos de microscopio capacidad 100 de diapositivas.
- Lugar se desliza hacia abajo planas (células hacia arriba) en la cámara húmeda. Preparar las muestras para el etiquetado mediante la aspiración de la PBS de la etapa de lavado anterior utilizando una micropipeta y la adición de 75 l de solución de bloqueo (5% normal burro suero (NDS) en PBS) a cada diapositiva para bloquear la unión no específica de anticuerpos a las muestras. Incubar los portaobjetos en solución de bloqueo durante 1 hora a RT.
- Suavemente aspirado de solución de bloqueo utilizando una micropipeta y añadir 75 l de solución de anticuerpo primario que contiene de cobaya anti-insulina y anticuerpos de conejo anti-Ki67, se diluyó 1 mg / ml en 5% NDS en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr.
NOTA: Los marcadores alternativos de proliferación celular incluyen la proliferación de núcleos de células antígeno (PCNA) y phosphohistone H3 (PH3), - Se aspira suavemente la solución de anticuerpo primario utilizando una micropipeta y enjuagar las células con 75 l de PBS. Aspirar PBS utilizando una micropipeta y enjuagar las células dos veces más, cada vez con 75 l de PBS. Incubar cada muestra con 75 l anti-conejillo de indias Cy5 y anticuerpo secundario anti-conejo Cy3 anticuerpo secundario diluido a 2 g / ml en solución de bloqueo durante 1 hora a RT.
NOTA: No utilizar anticuerpos secundarios marcados con el mismo o superposición espectral fluoróforo que ya se utiliza para etiquetar las microesferas. - solución de anticuerpo secundario Aspirar utilizando una micropipeta y se incuban en 75 l de 300 nM DAPI en PBS durante 3 min a TA. Aspirar DAPI utilizando una micropipeta y enjuague en agua desionizada durante 5 min.
- Se aspira suavemente el agua de las muestras utilizando una micropipeta. Detectar una gota (aproximadamente 100 l) de la solución de montaje de secado rápido que contiene antifade reactivo sobre un cubreobjetos de vidrio. Invertir el lado microscopio muestra de deslizarse hacia abajo, ore a la solución de montaje. Presione suavemente el cubreobjetos contra el portaobjetos con una punta de pipeta para eliminar las burbujas y limpie el exceso de líquido con un tejido suave de limpieza. Permitir cubreobjetos de secar durante la noche a TA.
- Utilizar un microscopio de epifluorescencia con una cámara adjunta para la adquisición de imágenes. Para cada fluoróforo, determinar el tiempo óptimo de exposición (normalmente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para la insulina, y 250 ms para Ki67). Asegúrese de parámetros de adquisición de imágenes son iguales para todas las muestras.
- Para cada muestra, contar manualmente 3.000 células positivas para insulina y de los que contar cuántas son también Ki67 positivo. Sólo contar las células positivas para insulina que tienen un núcleo bien definido y claramente visible. Calcular el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra dividiendo el número de las células Ki67 positivas / positivas para insulina por el número total de células positivas para insulina y multiplicando por 100.
- después dara determinar el porcentaje de la proliferación de las células ß para cada muestra, determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa en la proliferación de células β entre el control y las muestras experimentales mediante el análisis de los resultados con un ANOVA de una vía utilizando el software estadístico comercialmente disponible.
9. Adquisición de imágenes y análisis
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Representative Results
La Figura 1 es una representación visual de las microesferas generadas utilizando el protocolo anterior. El protocolo descrito aquí produce microesferas cargadas con rhCTGF de varios tamaños. La mayor fracción de microesferas estará entre 1 y 10 micras de diámetro, aunque algunas microesferas pueden ser más grandes (Figura 2). Si se desea, el tamaño de las microesferas se puede ajustar y optimizado sobre la base de parámetros de fabricación tales como la velocidad de homogeneización y el tiempo, la concentración de agente tensioactivo usado, y los volúmenes relativos de cada fase de agua / aceite / agua 10.
Después de la dispersión de islotes intactos tratados con microesferas de PLGA y la posterior immunolabeling, es común ver a regiones de la muestra desprovista de etiquetado en entre las células (Figura 3). Mientras que la mayoría de las microesferas que aún están intactas después del período de tratamiento de cultivo seeliminado durante las etapas de lavado, algunos permanecen después de que los islotes se hacen girar sobre los portaobjetos de microscopio. Estas microesferas hacen que las estructuras de tipo agujero visualizados durante la exploración. Estas microesferas residuales típicamente no interfieren con la posterior cuantificación.
Después de formación de imágenes, el porcentaje de células Ki67 positivas / positivas para insulina puede cuantificarse contando manualmente el número total de células marcadas, o el uso de análisis de imágenes de software. Anteriormente, hemos demostrado que conectivo Factor de crecimiento del tejido humano recombinante (rhCTGF) puede estimular la proliferación de células β de ratón en islotes intactos ex vivo 11. Utilizando el protocolo antes mencionado, hemos generado microesferas de PLGA que contienen rhCTGF (rhCTGF-PLGA). El tratamiento de islotes intactos con microesferas de PLGA-rhCTGF durante 3 días resultó en un aumento similar en la proliferación de células β como se informó anteriormente con la proteína cruda, lo que demuestra que la proteína no hizo lo tilice cualquier funcionalidad durante la generación de microesferas (Figura 4).
Figura 1:. Visual Representación de PLGA Las microesferas Mediante la incorporación de un colorante fluorescente en el protocolo de fabricación, las microesferas de PLGA puede ser visualizado usando un microscopio de epifluorescencia. La barra de escala representa 200 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Distribución de Tamaño de PLGA Las microesferas Aunque la distribución de tamaño puede variar, la mayoría de microesferas será inferior a 10 micras de diámetro.arget = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Visualización de inmunofluorescencia de Disperso La proliferación de las células ß Dispersos islotes se immunolabeled para el marcador de proliferación Ki67 (rojo) e insulina (verde) para marcar la proliferación de las células ß. Los núcleos están etiquetados con DAPI (azul). Las flechas indican las células Ki67 positivas / positivas para insulina. Asteriscos (*) indican microesferas no degradado. La barra de escala representa 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación y análisis de células β-Proproliferación. islotes tratados con diferentes cantidades de microesferas de PLGA-rhCTGF. El número de células Ki67 positivas / positivas para insulina se contó manualmente de todas las muestras y se expresó como un porcentaje del número total de células beta positivas para insulina. El eje X corresponde a la concentración final de rhCTGF presente en cada tratamiento. La significación estadística se determinó usando un ANOVA de una vía seguido por prueba de comparación múltiple de Tukey. La significación estadística se estableció en p ≤ 0,05. Las barras de error representan el error estándar de la media. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El estudio de la proliferación de células β en cultivo típicamente se ve obstaculizada por varias dificultades. En primer lugar, las líneas de células inmortalizadas β se caracterizan por grados más altos de proliferación de lo que se encuentra en las células beta en los islotes endógenos en vivo. Además, estas líneas celulares inmortalizadas carecen de la arquitectura normal crítico para la función de las células β normal. Estos dos hechos hacen que sea difícil determinar si los resultados obtenidos usando líneas de células inmortalizadas β será verdad cuando se prueba in vivo o in islotes completos. Nuestro protocolo descrito, que utiliza recién aisladas islotes de ratón intactas, evita estos problemas ya que la arquitectura de los islotes se mantiene y la proliferación de células β es comparable a la encontrada in vivo.
Una preocupación importante cuando se cultiva islotes intactos es la posibilidad de que las células dentro del núcleo de islotes serán sometidos a la necrosis inducida por hipoxia o no estarán expuestos a rhCTGF. Por esta razón, una finalse añade concentración de EGTA 0,1 mM a los medios de comunicación para aflojar contactos célula-célula sin interrumpir la arquitectura de los islotes. Hemos publicado previamente que la adición de EGTA solo puede aumentar la proliferación de células β, presumiblemente debido a un mayor acceso de nutrientes y mitógenos en los medios de comunicación con el núcleo de los islotes 12. El aumento de la proliferación de células β en respuesta a EGTA también podría ser debido a la disminución en el contacto célula-célula en sí 13,14. Los medios descritos en este protocolo también se complementa con suero de caballo en lugar del suero más tradicional bovino fetal. Esta sustitución se hace debido a la presencia de lactógeno placentario en suero bovino fetal, que puede estimular la proliferación de células β por sí mismo, complicando potencialmente el análisis en el ensayo de proliferación.
Determinación de la toxicidad relativa de las microesferas de PLGA (con o sin el COI) a las células de los islotes se puede evaluar mediante el análisis de inmunofluorescencia de markers de la muerte celular o el daño del ADN, incluyendo TUNEL o γ-H2AX 15,16. Aunque la adición de microesferas de PLGA no ha mostrado ningún efecto perjudicial evidentes a islotes ex vivo, los usuarios deben ser conscientes de los efectos de las microesferas pueden tener en el análisis de imágenes. Como se demuestra en la Figura 3 y se ha mencionado en la sección de resultados, no degradadas microesferas pueden ser evidentes como manchas oscuras dentro de imágenes de inmunofluorescencia, con más microesferas que aparecen cuando se utilizan concentraciones crecientes.
Debe tenerse en cuenta que el protocolo descrito ha sido adaptado para trabajar con islotes aislados de ratón. Como tal, no está claro si las condiciones idénticas trabajarán con islotes cosechadas a partir de organismos alternativos, tales como ratas y seres humanos. Notablemente, islotes cosechado de diferentes organismos a menudo tienen diferentes condiciones óptimas de cultivo y diferentes grados de proliferación de las células β 17,18.
numerosos biomateriales están potencialmente disponibles para administrar rhCTGF a los islotes aislados, incluyendo poli (tiocetal-uretano) y poli (sulfuro de propileno) 19. Elegimos a centrarse en PLGA debido a varias cualidades notables que posee. En primer lugar, PLGA es un reactivo relativamente asequible y las microesferas se puede generar con el equipo estándar (centrífuga, homogeneizador, liofilizador) disponible en la mayoría de las instituciones de investigación. PLGA es un polímero artificial que tiene precedente para uso con éxito en dispositivos aprobados por la FDA debido a su biocompatibilidad, biodegradabilidad, y su capacidad para modular las velocidades de liberación compuesto 20. PLGA se degrada por hidrólisis en presencia de agua, liberando su carga en el proceso. La composición química de las partículas de PLGA se puede adaptar de tal manera que un compuesto se libera in vivo durante el periodo de varias semanas. PLGA también se ha utilizado en ensayos preclínicos con animales y terapias clínicos en humanos para administrar localmente compuestos a diversos órganos y tissues 21,22. Otros polímeros hidrófobos también se pueden utilizar en la generación de microesferas biodegradables. Estos polímeros pueden responder a estímulos ambientales específicos, tales como el pH, la temperatura, y la presencia de especies reactivas de oxígeno 23,24. Por lo tanto, los investigadores deben considerar cuidadosamente qué biomaterial es el más apropiado para sus estudios.
Cualquier investigador que utiliza PLGA, u otros biomateriales, para estudiar la proliferación de células β ex vivo deben ser conscientes de las posibles diferencias entre los efectos de la COI encapsulado en comparación con los países de origen no encapsulado. Por ejemplo, la entrega de rhCTGF través de PLGA podría cambiar el grado de y el momento de la inducción de la proliferación de células β comparación con el tratamiento con la proteína no encapsulado. Los estudios en curso en nuestro laboratorio están examinando estas diferencias de potencial.
El análisis de la proliferación de células β en los islotes de cultivo es un modelo de gran alcance para la identificación y mechanistic análisis de mitógenos de células β. Usando el ensayo descrito aquí mostramos un método relativamente rápido y rentable para la administración de un conflicto de interés a los islotes aislados cultivadas con un vehículo de entrega de liberación prolongada. Este ensayo debe ser aplicable a casi cualquier COI de interés, y nuestra elección de centrarse en CTGF está puramente basado en su capacidad publicado previamente para estimular la proliferación de las células β in vivo y ex vivo 11. Además, este ensayo puede validar la eficacia y seguridad del uso de PLGA como un método de entrega antes de avanzar a los modelos en los islotes son trasplantados en los organismos vivos. En general, el protocolo descrito proporciona una nueva forma de administrar compuestos a los islotes cultivados con un impacto más amplio en la medición de la seguridad de PLGA al tejido transplantable.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
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