Abstract
Lo sviluppo di biomateriali ha aumentato significativamente il potenziale per la consegna mirato di farmaci ad una varietà di tipi di cellule e tessuti, incluse le cellule beta del pancreas. Inoltre, biomateriale particelle, idrogel, e ponteggi offrono anche l'opportunità unica di amministrare sostenuta, controllabile somministrazione di farmaci ai beta-cellule in coltura e nei modelli di tessuto trapiantato. Queste tecnologie permettono lo studio dei fattori di proliferazione candidato β-cellule utilizzando isolotti intatti e un sistema di traslazione rilevante. Inoltre, determinare l'efficacia e la fattibilità di fattori candidati per stimolare la proliferazione delle cellule β-in un sistema di coltura è fondamentale prima di andare avanti a modelli in vivo. Qui, si descrive un metodo di co-coltura isole di topo intatte con composti biodegradabili di interesse (COI) poli MOLLA (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) microsfere al fine di valutare gli effetti della sostenuta in situ rilascio ofattori mitogeni F sulla proliferazione β-cellule. Questa tecnica viene descritto in dettaglio come generare microsfere di PLGA contenenti un carico desiderato utilizzando reagenti commercialmente disponibili. Mentre la tecnica descritta utilizza fattore ricombinante umano connettivo crescita tissutale (rhCTGF), come esempio, potrebbe essere facilmente utilizzata un'ampia varietà di COI. Inoltre, questo metodo utilizza piastre a 96 pozzetti per minimizzare la quantità di reagenti necessarie per valutare la proliferazione β-cellule. Questo protocollo può essere facilmente adattato per usare biomateriali differenti e altre caratteristiche cellulari endocrine come la sopravvivenza delle cellule e lo stato di differenziazione.
Introduction
Pancreatiche beta-cellule sono le uniche cellule che producono insulina nel corpo e sono fondamentali per mantenere l'omeostasi del glucosio nel sangue. Mentre gli individui sani hanno massa β-cellule sufficienti e la funzione di regolare correttamente il glucosio nel sangue, le persone con diabete sono caratterizzati da massa β-cellule insufficiente e / o la funzione 1,2. E 'stato proposto che induce la proliferazione delle cellule β-in ultima analisi può aumentare la massa β-cellulare e ripristinare l'omeostasi del glucosio nei soggetti con diabete 3. Tuttavia, la valutazione e la validazione di potenziali composti proliferative β-cellule in isolotti intatto è necessario, prima di terapie efficaci possono essere sviluppate. Il trapianto di isole umane cadavere in individui con diabete di ripristinare l'omeostasi del glucosio nel sangue per un certo tempo, ma la disponibilità e il successo di questa procedura sperimentale è ostacolato da una carenza di isole umane disponibili per il trapianto e la morte delle cellule beta nelle isole di poppaER trapianto 4. Anche con la scoperta di fattori che inducono la moltiplicazione delle cellule che producono insulina, una sfida importante esiste ancora nella realizzazione di questi fattori per siti rilevanti in vivo. Una strategia per la consegna locale sostenuto di composti proliferative β-cellule è il poli (lattico-co-glicolico) Acido (PLGA). PLGA ha una storia di uso in prodotti approvati dalla FDA di consegna della droga a causa della sua elevata sicurezza, biodegradabilità, e cinetica di rilascio prolungato 5. In particolare, PLGA è un copolimero di lattide e glicolide che degrada per idrolisi con acqua in vivo o in coltura in acido lattico e acido glicolico, che sono naturalmente presenti metaboliti nel corpo. Il composto farmaco incapsulato può essere rilasciato nell'ambiente circostante sia diffusione e / o meccanismi di rilascio di degradazione controllata. Incapsulamento di COI fornisce protezione contro la degradazione enzimatica, migliorando la biodisponibilità del reagente rispetto a unencapsulaTed COI 5. Si consiglia di microsfere di PLGA può essere utilizzato per amministrare composti candidati a isolotti intatti nella cultura, e in ultima analisi in vivo. Testare l'efficacia di PLGA per amministrare mitogeni β-cellule di isolotti ex vivo è fondamentale prima di protocolli di trapianto sono esplorate.
Attualmente, non esiste una tecnica per misurare la proliferazione β-cellule di animali vivi. Gli esperimenti per valutare l'efficacia di potenziali composti proliferative in vivo quindi richiedere la somministrazione di questi composti per animali vivi, con successiva dissezione e lavorazione di pancreas per immunomarcatura. Tali protocolli sono costosi e laboriosi e richiedono il composto deve essere somministrato per via sistemica, senza alcuna garanzia che raggiungeranno gli isolotti. Viceversa, diverse linee β-cellulari immortalizzate sono disponibili per lo studio delle cellule che producono insulina in coltura, ma queste linee cellulari mancano l'architettura isolotto e environment trovato negli organismi viventi 6. Linee β-cellulari immortalizzate sono anche caratterizzati come aventi un più alto grado di replicazione di endogene beta cellule in vivo, complicando l'analisi di composti che inducono la proliferazione così. In questo studio, si descrive un protocollo che utilizza isolotti intatti isolati da topi adulti. A differenza di linee di β-cellule, isolotti intatti conservano normale architettura isolotto. Allo stesso modo, a differenza di esperimenti condotti in vivo, il funzionamento composti proliferative direttamente isolotti intatti coltura riduce significativamente la quantità di reagenti che è necessario misurare con precisione la proliferazione β-cellule.
L'attuale studio utilizza PLGA per amministrare un COI, in questo esempio, fattore ricombinante umano del tessuto connettivo della crescita (rhCTGF). Il metodo qui descritto conferisce un vantaggio significativo rispetto la somministrazione del composto grezzo di isolotti coltivate in quanto consente un rilascio continuo di composto in the media. In particolare, questo dosaggio può essere modificato per gestire un'ampia varietà di proteine e anticorpi di interesse per isolette intatte. Effetti su altri tipi di cellule endocrine, tra cui alfa-cellule, possono anche essere analizzati.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate e eseguite in conformità con il Comitato cura e l'uso Vanderbilt Istituzionale Animal.
1. Etichettatura COI con Fluoroforo (opzionale)
- Scegliere un colorante fluorescente che reagisce con un'ammina primaria libera (ad esempio, su una proteina), come esteri o derivati succinimidyl fluoresceina, per visualizzare microsfere carico. Sciogliere 8x eccesso molare (rispetto alla moli di COI) di fluoroforo in 200 ml di dimetilsolfossido (DMSO).
- Risospendere 50 mg di COI fino ad un volume finale di 800 microlitri in una soluzione veicolo (concentrazione finale di 62,5 ng / ml). La soluzione di veicolo varierà a seconda della fonte del COI.
NOTA: veicolo tipico soluzioni includono tampone fosfato salino (PBS) o DMSO. - Aggiungere tutta la soluzione fluoroforo / DMSO dal punto 1.1 e risospendere il COI. Vortex notte a 4 ° C. In alternativa, agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente(RT) per 4 ore.
- Dopo la reazione di marcatura, rimuovere l'eccesso fluoroforo utilizzando una colonna dissalazione.
- Scolare buffer di storage da colonna dissalazione e risciacquare con 16 ml di acqua deionizzata. Gettare tutto il flusso attraverso.
- Aggiungere il COI fluorescente alla colonna di dissalazione. Eluire con 1,2 ml di acqua deionizzata e raccogliere il flusso attraverso.
- step eluizione Ripetere altre quattro volte, ogni volta aggiungendo 1,2 ml di acqua deionizzata e di raccolta del flusso attraverso come campione separato.
- Congelare tutto il flusso raccolte attraverso i campioni a -80 ° C e liofilizzare secondo le istruzioni del produttore per 24 ore.
2. COI-caricato microsfere Preparazione tramite l'acqua acqua-in-olio-in-emulsione di solventi evaporazione Metodo
- Aggiungere 1 mg di fluorescente COI a 100 ml di acqua deionizzata per formare la prima fase acquosa (W1).
- Sciogliere 65 mg di poli (aci lattico-co-glicolicod) (50:50 Lactide: Glycolide, peso molecolare 54.000 - 69.000) in 750 ml di diclorometano in una provetta. Ultrasonicate per 10 - 30 sec (a 160 W) per sciogliere completamente il PLGA. Ciò costituisce la fase olio (O).
- Aggiungere tutti fase W1 generato nel passaggio 2.1 alla fase O in maniera goccia a goccia. Emulsionare usando un omogeneizzatore portatile a 20.000 rpm per 30 secondi per formare la fase W1 / O.
- Aggiungere tutti fase / O W1 in maniera goccia a goccia a 15 ml di una soluzione all'1% (PVA) (peso / volume) poli acquosa (vinil alcool) ed emulsionare usando un omogeneizzatore portatile a 20.000 rpm per 30 sec .
- Trasferire tutto dell'emulsione generato nel passaggio da 2.4 a 200 ml pallone a fondo tondo e soggetto ad un 635 millimetri Hg di vuoto usando un evaporatore rotante per 1 ora per rimuovere il solvente e generare la fase acquosa.
- Aliquota 1 ml di fase acquosa generati in fase di 2,5 a quattordici provette da microcentrifuga. La centrifugazione della soluzione acquosa in tubi da microcentrifuga a 7.500xg per 8 min.
NOTA: A questo punto, le microsfere sono presenti nella soluzione acquosa rimanente e si concentrano sul fondo della provetta. - Rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta.
- Lavare le microsfere di un eccesso di PVA con l'aggiunta di 1 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta. Centrifugare a 7500 xg per 8 minuti, e ancora rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta.
NOTA: La soluzione acquosa 100 microlitri rimanente contiene microsfere generate.
- Lavare le microsfere di un eccesso di PVA con l'aggiunta di 1 ml di acqua deionizzata ad ogni provetta. Centrifugare a 7500 xg per 8 minuti, e ancora rimuovere con cautela 900 ml di soluzione acquosa dai tubi microcentrifuga con una micropipetta, pipettaggio in modo da non disturbare le microsfere sul fondo della provetta.
- Congelare la soluzione acquosa microsfera generato nel passaggio 2,7 a -80 ° C.
- microsfere lyophilize utilizzando un liofilizzatore secondo il fornitore dile istruzioni e conservare a -20 ° C.
NOTA: Misura efficienza carico del COI sciogliendo completamente microsfere di PLGA e determinare la concentrazione di proteine rispetto ad una curva standard della proteina free 7. - Come controllo negativo, genera una serie di microsfere "in bianco" (di seguito denominati microsfere di controllo).
NOTA: La generazione di microsfere di controllo è identica alla generazione di idrofili microsfere COI caricati, senza aggiunta COI a 800 microlitri della soluzione di veicolo in fase 1.2. particelle di controllo Partita a concentrazione di massa di PLGA rispetto a microsfere PLGA COI-caricati per il saggio mitogeno β-cellule.
3. Preparazione di Islet cultura dei media e media pre-test
- Preparare 200 ml media per la cultura di isole di topo intatte: RPMI 1640 multimediale integrato con 11 mm di glucosio, il 10% siero di cavallo, 100 U / ml di penicillina G e 100 mg / ml di streptomicina (di seguito indicato come èlasciare terreni di coltura).
NOTA 1: A differenza di siero fetale bovino (FBS), siero di cavallo manca lattogeno placentare, un induttore della proliferazione β-cellule, che confonde l'analisi del saggio di proliferazione.
NOTA 2: Poiché le microsfere di PLGA non vengono sterilizzati prima dell'uso, l'aggiunta di antibiotici ai terreni di coltura è fondamentale per evitare contaminazione microbiologica. - Rimuovere 25 ml di terreni di coltura isolotto con una pipetta elettronica e posto in un tubo conico da 50 ml. Supplemento 25 ml di mezzo di coltura isolotto nel tubo conico 50 ml con una concentrazione finale di 0,2 mM EGTA per generare il supporto pre-test.
NOTA: L'aggiunta di EGTA allenta leggermente contatti cellula-cellula nelle isole senza alterare l'architettura isolotto. Questo aiuta a garantire la COI può raggiungere le cellule interne del isolotto e aiuta a prevenire la necrosi del isolotto centrale.
4. coltura di Intact isole di topo
- Isolare isolotti intatti da un ceppo preselezionato, il sesso, age, e il genotipo di topi dopo una digestione collagenasi di routine del 8,9 pancreas. Pool insieme isolotti da come campioni.
- Aliquota 40 isolotti in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti in 200 ml di terreni di coltura isolotto. Visivamente isolotti size-partita per bene (una precisa valutazione di equivalenza isolotto (IEQ) tra i campioni non è necessario). Riempire i pozzi vuoti immediatamente adiacenti ai pozzi con isolotti con 200 ml di acqua sterile per fornire un buffer di evaporazione. Culture isolotti in mezzi notte a 37 ° C in atmosfera di 95% CO aria e 5% 2.
5. risospensione del COI-caricati e Controllo PLGA microsfere
- Dopo il recupero isolotto overnight, microsfere risospendere aggiungendo supporti pre-test per un'aliquota di liofilizzati microsfere di PLGA COI caricati tale che la concentrazione finale del COI nella provetta è di 10 ng / ml (la quantità di COI presente in una data quantità di le micro generatiatmosfere sono stati determinati in fase 2.9). Sonicare le microsfere COI-caricati risospeso in un bagno di acqua ghiacciata per 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C.
- controllo Risospendere PLGA microsfere aggiungendo lo stesso volume di supporti pre-test per un'uguale massa di controllo liofilizzato microsfere di PLGA. Sonicare i risospesa microsfere di controllo PLGA in un bagno di acqua ghiacciata per 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C.
- Visivamente confermano microsfere sono dispersi pipettando 2 ml di microsfere risospese tra due vetrini. Visualizza microsfere utilizzando un obiettivo 40X su un microscopio a epifluorescenza o campo chiaro.
- Se significativa aggregazione delle microsfere è ancora visibile, ultrasuoni in un bagno di acqua ghiacciata per altri 10 minuti a 160 W con impulsi lunghi 10 sec a 4 ° C e la visualizzazione di ripetizione di microsfere risospesa.
6. Il trattamento di isolotti con COI-caricati o controllo PLGA microsfere </ P>
- Per ciascun pozzetto da trattare con microsfere COI-caricati, preparare supporti dosaggio diluendo il 10 ng / ml di microsfere COI risospesa con mezzi di pre-test per un volume finale di 100 microlitri e una concentrazione finale predeterminata.
NOTA: La concentrazione finale ottimale della proteina può variare per ogni COI impiegato per questo dosaggio. Idealmente, un intervallo di concentrazioni finali sono testati. - Per ogni bene per essere usato come controllo, preparare il controllo dei media dosaggio diluendo il controllo microsfere risospesa PLGA generati al passo 5.2 con lo stesso volume di diluizione utilizzato per diluire le microsfere COI-caricati al punto 6.1.
NOTA: Isolotti trattati con mezzi saggio di controllo serviranno come controllo negativo per consentire l'individuazione di eventuali effetti delle microsfere vuote possono avere sui risultati sperimentali. - Rimuovere con cautela 100 ml di terreni di coltura isolotto da ogni pozzetto con una micropipetta tale che non isolotti sono sloggiati dai pozzi. Delicatamente aggiungere 100 μl di mezzi di analisi o 100 ml di mezzi saggio di controllo in ciascun pozzetto.
- Incubare isolotti a 37 ° C in atmosfera di 95% CO aria e 5% 2 per tre giorni.
7. Dispersione Isolotti intatte Onto vetrini da microscopio
- Dopo tre giorni, utilizzare una micropipetta per rimuovere con attenzione e gettare i media saggio da tutti i pozzetti in modo da non rimuovere isolotti. Delicatamente aggiungere 200 ml di PBS a isolotti di lavarle dei mezzi di test. Rimuovere con cautela e scartare PBS con una micropipetta e lavare delicatamente isolotti di nuovo con altri 200 ml di PBS.
- Rimuovere e gettare PBS con una micropipetta e aggiungere 100 ml di 0,025% tripsina, 2 mM EDTA soluzione. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Pipettare isolotti nella soluzione tripsina-EDTA su e giù ogni 2 minuti fino a quando isolotti sono confermati visivamente di essere disperso nelle singole cellule (si noti che alcuni piccoli grumi di cellule possono essere ancora presenti) utilizzando un microscopio ottico. Trasferire l'intero volume di ciascun pozzetto singolamente in microprovette labeled-.
- Aggiungere 400 ml di terreni di coltura isolotto a ciascuna provetta per fermare la dissociazione delle cellule tripsina-mediata.
- campioni di centrifugazione per 5 min a 100 xg a 4 ° C a pellet cellule insulari al fondo dei tubi microcentrifuga.
- Rimuovere delicatamente il surnatante con una micropipetta, e risospendere pellet in 200 terreni di coltura isolotto ml fresca.
- Utilizzando un cito-centrifuga, centrifuga dissociato isolotti a 140 xg per 3 minuti su vetrini da microscopio cariche.
- Air diapositive a secco a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi disegnare una casella intorno agli isolotti dissociate con un pennarello idrofoba.
- Fissare le cellule con 75 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere 4% PFA e lavare delicatamente le cellule in 75 ml di PBS due volte. Dopo il lavaggio, permeabilize cellule con 75 microlitri 0,2% Triton X-100 in PBS per 10 min. Quindi, lavare le cellule con 75 ml di PBS.
Attenzione: PFA è noto per essere allergenico, cancerogeno e tossico. 8. immunofluorescenza Etichettatura di dissociato isolotti per l'insulina e la proliferazione cellulare Marker, Ki67 - Preparare una camera umida posizionando due asciugamani di carta bagnata sul fondo di una scatola vetrino da microscopio capacità 100 diapositiva.
- Collocare i vetrini piatto verso il basso (cellule verso l'alto) in camera umida. Preparare i campioni per l'etichettatura aspirando il PBS dalla fase di lavaggio precedente utilizzando una micropipetta e l'aggiunta di 75 ml di soluzione bloccante (5% Normal Donkey Serum (NDS) in PBS) per ogni diapositiva per bloccare legame non specifico di anticorpi contro i campioni. Incubare i vetrini in soluzione bloccante per 1 ora a RT.
- Delicatamente aspirato soluzione bloccante utilizzando una micropipetta e aggiungere 75 ml di soluzione di anticorpo primario contenente cavia anti-insulina e coniglio anticorpi anti-Ki67, diluito 1 mg / ml a 5% NDS in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
NOTA: gli indicatori alternativi di proliferazione delle cellule proliferanti includono l'antigene nucleare delle cellule (PCNA) e phosphohistone H3 (PH3), - Aspirare delicatamente soluzione di anticorpo primario con una micropipetta e lavare le cellule con 75 ml di PBS. Aspirare PBS usando una micropipetta e lavare le cellule due volte, ogni volta con 75 ml di PBS. Incubare ciascun campione con l'anticorpo secondario 75 microlitri anti-guinea pig Cy5 e anti-rabbit Cy3 anticorpo secondario diluito a 2 ug / ml in soluzione bloccante per 1 ora a RT.
NOTA: non utilizzare anticorpi secondari marcati con lo stesso o spettralmente sovrapposizione fluoroforo che è stato già utilizzato per etichettare le microsfere. - soluzione di anticorpo secondario Aspirare utilizzando una micropipetta e incubare in 75 ml di 300 nM DAPI in PBS per 3 minuti a RT. Aspirare DAPI utilizzando una micropipetta e sciacquare in acqua deionizzata per 5 min.
- Aspirare delicatamente l'acqua da campioni utilizzando una micropipetta. Spot una goccia (circa 100 ml) di soluzione di montaggio rapida essiccazione contenente antifade reagente su un vetrino di vetro. Invertire il lato del microscopio del campione scivolo verso il basso, onto la soluzione di montaggio. Premere delicatamente il vetrino contro il vetrino con una punta di pipetta per rimuovere le bolle e spazzare via il liquido in eccesso con un panno di pulizia morbido. Lasciare coprioggetto asciugare per una notte a temperatura ambiente.
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con una fotocamera collegata per l'acquisizione delle immagini. Per ogni fluoroforo, determinare il momento ottimale di esposizione (in genere 20 msec per DAPI, 40 - 80 msec per l'insulina, e 250 msec per Ki67). Assicurarsi parametri di acquisizione delle immagini sono uguali per tutti i campioni.
- Per ogni campione, contare manualmente 3.000 cellule insulino-positive e di quelle contare quante sono anche Ki67-positivi. contare soltanto cellule insulino-positive che hanno un nucleo ben definito e ben visibile. Calcolare la percentuale di proliferazione cellule beta per ogni campione dividendo il numero di cellule Ki67-positive / insulino-positive per il numero totale di cellule insulino-positive e moltiplicando per 100.
- dopo determining la percentuale di proliferazione cellule beta per ciascun campione, determinare se una differenza statisticamente significativa nella proliferazione delle cellule β-esiste tra controllo e campioni sperimentali, analizzando i risultati con un one-way ANOVA utilizzando il software statistico disponibile in commercio.
9. Acquisizione di immagini e analisi
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Representative Results
La figura 1 è una rappresentazione visiva delle microsfere generate utilizzando il protocollo di cui sopra. Il protocollo qui descritto produce microsfere rhCTGF-caricati di varie dimensioni. La frazione più grande di microsfere sarà compreso tra 1 e 10 micron di diametro, anche se alcune microsfere possono essere più grandi (Figura 2). Se lo si desidera, dimensioni microsfere può essere sintonizzato ed ottimizzato sulla base di parametri di fabbricazione quali velocità omogeneizzazione e tempo, concentrazione di tensioattivo utilizzato, e relativi volumi di ciascuna fase acqua / olio / acqua 10.
Dopo la dispersione di isolotti intatti trattati con microsfere di PLGA e successiva immunomarcatura, è comune che le regioni del campione privo di etichettatura tra cellule (Figura 3). Mentre la maggior parte delle microsfere ancora intatte dopo il periodo di trattamento coltura sonorimosso durante le fasi di lavaggio, alcuni rimangono dopo gli isolotti sono filate sui vetrini da microscopio. Queste microsfere causano le strutture del foro-come visualizzati durante l'imaging. Queste microsfere residue in genere non interferiscono con successiva quantificazione.
Dopo l'imaging, la percentuale di cellule Ki67-positive / insulina-positivo può essere quantificata contando manualmente il numero totale di cellule marcate, o utilizzando l'analisi dell'immagine software. In precedenza, abbiamo dimostrato che il fattore ricombinante umano del tessuto connettivo della crescita (rhCTGF) in grado di stimolare la proliferazione del mouse β-cellule in isolotti intatti ex vivo 11. Utilizzando il protocollo di cui sopra, abbiamo generato microsfere di PLGA contenenti rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Trattare isolette intatte con microsfere rhCTGF-PLGA per 3 giorni hanno comportato un aumento simile nella proliferazione delle cellule β-come precedentemente riportato con la proteina grezza, a dimostrazione che la proteina non ha lo SE qualsiasi funzionalità durante la generazione di microsfere (Figura 4).
Figura 1:. Visiva Rappresentazione di PLGA Microsfere Incorporando un colorante fluorescente nel protocollo di fabbricazione, microsfere di PLGA può essere osservata con un microscopio epifluorescente. Barra della scala rappresenta 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Dimensione Distribuzione di PLGA Microsfere Sebbene distribuzione delle dimensioni possono variare, la maggior parte delle microsfere sarà inferiore a 10 micron di diametro.Arget = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Visualizzazione immunofluorescente di disperso in proliferazione beta cellule disperse isolotti sono immunolabeled per il marcatore di proliferazione Ki67 (rosso) e insulina (verde) per marcare proliferazione cellule beta. I nuclei sono etichettati con DAPI (blu). Le frecce indicano le cellule Ki67-positivo / insulino-positivo. Asterischi (*) indicano microsfere non alterate. Barra della scala rappresenta 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione e analisi della β-cellule Proproliferazione. isolotti trattata con diverse quantità di microsfere rhCTGF-PLGA. Il numero di cellule Ki67-positive / insulino-positive è stato contato manualmente da tutti i campioni ed espresso come percentuale del numero totale di cellule beta insulino-positive. Asse X corrisponde alla concentrazione finale di rhCTGF presente in ogni trattamento. La significatività statistica è stata determinata usando un one-way ANOVA seguita dal test di confronto multiplo di Tukey. La significatività statistica è stata fissata a p ≤ 0,05. Barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo studio della proliferazione β-cellule in coltura è tipicamente ostacolato da diverse difficoltà. In primo luogo, le linee β-cellule immortalati sono caratterizzati da elevati livelli di proliferazione di quello che si trova in endogene cellule beta nelle isole dal vivo. Inoltre, queste linee cellulari immortalizzate mancano della normale architettura critica per la normale funzione β-cellule. Questi due fatti rendono difficile determinare se i risultati ottenuti utilizzando immortalati linee β-cellule terrà vero durante il test in vivo o in isolette intere. Il nostro protocollo descritto, che utilizza appena isolate isole di topo intatte, elude questi problemi come l'architettura isolotto è mantenuta e la proliferazione β-cellula è paragonabile a quello trovato in vivo.
Una preoccupazione significativo quando la coltura isolotti intatti è la possibilità che le cellule all'interno del nucleo isolotto saranno sottoposti necrosi indotta da ipossia o non saranno esposti a rhCTGF. Per questo motivo, una finaleconcentrazione di 0,1 mM EGTA viene aggiunto al supporto per allentare contatti cellula-cellula senza interrompere architettura isolotto. Abbiamo precedentemente pubblicato che l'aggiunta di EGTA solo può aumentare la proliferazione β-cellule, presumibilmente a causa di un maggiore accesso di nutrienti e mitogeni in media al nucleo isolotto 12. L'incremento della proliferazione β-cellule in risposta a EGTA potrebbe anche essere dovuta alla diminuzione in contatto cellula-cellula stessa 13,14. I mezzi di comunicazione descritte in questo protocollo è inoltre integrato con siero di cavallo al posto del più tradizionale siero fetale bovino. Questa sostituzione viene effettuata per la presenza di lattogeno placentare in siero fetale bovino, che può stimolare la proliferazione β-cellule da solo, potenzialmente complicando analisi nel saggio di proliferazione.
Determinazione della tossicità relativa delle microsfere di PLGA (con o senza il COI) verso le cellule insulari può essere valutata mediante immunofluorescenza di markers di morte cellulare o di danni al DNA, tra cui TUNEL o γ-H2AX 15,16. Anche se l'aggiunta di microsfere di PLGA non ha dimostrato alcun effetto negativo evidenti isolotti ex vivo, gli utenti dovrebbero essere consapevoli degli effetti delle microsfere possono avere sulla analisi delle immagini. Come mostrato nella Figura 3 e menzionato nella sezione risultati, microsfere non degradati possono essere evidente come macchie scure presenti immagini di immunofluorescenza, con più microsfere che appaiono quando le concentrazioni crescenti vengono utilizzati.
Va notato che il protocollo descritto è stato adattato per funzionare con isole isolate di topo. Come tale, non è chiaro se le condizioni identiche lavoreranno con isolotti raccolte da organismi alternativi, quali ratti e gli esseri umani. In particolare, isolotti raccolte da organismi diversi hanno spesso diverse condizioni ottimali di coltura e diversi gradi di proliferazione delle cellule β-17,18.
numerosi BIOMateriali sono potenzialmente disponibili per amministrare rhCTGF di isole isolate, tra cui poli (tiochetale-uretano) e poli (propilene solfuro) 19. Abbiamo scelto di concentrarsi su PLGA a causa di diverse qualità importanti che possiede. In primo luogo, PLGA è un reagente relativamente abbordabile e le microsfere possono essere generati con equipaggiamento standard (centrifuga, omogeneizzatore, liofilizzatore) disponibile presso la maggior parte degli istituti di ricerca. PLGA è un polimero artificiale che ha precedente per uso con successo in dispositivi approvati FDA per la sua biocompatibilità, biodegradabilità, e la sua capacità di modulare tassi di rilascio compound 20. PLGA degrada per idrolisi in presenza di acqua, rilasciando il suo carico nel processo. La composizione chimica delle particelle PLGA può essere adattato in modo tale che un composto è rilasciata in vivo nel periodo di diverse settimane. PLGA è stato utilizzato anche in studi preclinici su animali e terapie cliniche umane per amministrare localmente composti a vari organi e Tissues 21,22. Altri polimeri idrofobi possono anche essere usati nella generazione di microsfere biodegradabili. Questi polimeri possono rispondere a specifici stimoli ambientali, come il pH, la temperatura, e la presenza di specie reattive dell'ossigeno 23,24. Così, i ricercatori dovrebbero considerare attentamente quali biomateriale è più appropriato per i loro studi.
Ogni ricercatore utilizzando PLGA, o di altri biomateriali, per studiare la proliferazione delle cellule β-ex vivo dovrebbero essere consapevoli dei potenziali differenze tra gli effetti di incapsulato COI rispetto ai non incapsulata COI. Ad esempio, l'erogazione di rhCTGF con PLGA potrebbe cambiare il grado di temporizzazione e di β-cellule induzione proliferazione rispetto al trattamento con la proteina incapsulata. Gli studi in corso nel nostro laboratorio stanno attualmente esaminando queste differenze di potenziale.
L'analisi della proliferazione β-cellule in coltura isolotti è un potente modello di identificazione e meanalisi chanistic di mitogeni β-cellule. Utilizzando il test descritto qui vi mostriamo un metodo relativamente rapido e conveniente per la gestione di un COI a isolate isolotti in coltura con un veicolo di consegna a rilascio prolungato. Questo test dovrebbe essere applicabile a quasi tutte le COI di interesse, e la nostra scelta di concentrarsi su CTGF è puramente basato sulla sua capacità precedentemente pubblicato di stimolare la proliferazione delle cellule β-in vivo e ex vivo 11. Inoltre, questo test può convalidare l'efficacia e la sicurezza di utilizzare PLGA come un metodo di consegna prima di passare a modelli in cui isolotti vengono trapiantate negli organismi viventi. Nel complesso, il protocollo descritto fornisce un nuovo modo per somministrare composti a isolotti coltivate con un ampio impatto sul misurando la sicurezza del PLGA al tessuto transplantable.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
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