Abstract
biyo gelişimi, pankreas β-hücreleri de dahil olmak, hücre ve doku tiplerinin çeşitli hedeflenen ilaç iletimi için potansiyel önemli ölçüde arttırmıştır. Buna ek olarak, biyomalzeme parçacıklar, hidrojeller ve iskeleleri de eşsiz bir fırsat sunmak sürekli yönetebileceğini için, kontrol ilaç dağıtım ß-hücrelerinin kültür ve nakledilen doku modelleri. Bu teknolojiler sağlam adacıklar ve bir öteleme ilgili sistemini kullanarak aday β-hücre çoğalma faktörleri çalışma izin verir. Ayrıca, bir kültür sistemi içinde β-hücresi çoğalmasının uyarılması için aday faktörlerinin etkinliği ve uygulanabildiğini ortaya in vivo modeller ilerlemeden önce önemlidir. Bu yazıda, ilgi biyobozunur bileşik (ÇÇ) -yüklü poli (laktik-ko-glikolik asit) in situ bırakma o da sürekli etkilerini değerlendirmek amacıyla (PLGA) mikroküreler ile bozulmamış fare adacıklar kültür işbirliği için bir yöntem tarifβ-hücre çoğalması f mitojenik faktörler. Bu teknik, ticari olarak temin edilebilir maddeler kullanarak istediğiniz kargo içeren PLGA mikro küreler oluşturmak için nasıl ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. tarif edilen teknik, bir örnek olarak, rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF) kullanırken, COI çok çeşitli kolaylıkla kullanılabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, β-hücresi çoğalmasını değerlendirmek için gerekli reaktiflerin miktarını en aza indirmek için, 96 gözlü levhalar kullanmaktadır. Bu protokol, hali hazırda alternatif bir biyo materyaller ve hücre yaşamım ve durumu gibi diğer endokrin hücre özelliklerini kullanmak için adapte edilebilir.
Introduction
Pankreas β-hücrelerinin vücuttaki yalnızca insülin üreten hücreler ve kan glukoz homeostazı sürdürmek için önemlidir. Sağlıklı bireylerin yeterli β-hücresi kütlesi ve uygun kan şekeri düzenleme işlevi de, diyabetli kişilerin yeterli β-hücresi kütlesi ve / veya fonksiyonu 1,2 ile karakterize edilmektedir. Β-hücresi çoğalmasını indükleyen sonuçta β-hücresi kütlesini artırmak ve diyabet 3 bireylerde glikoz dengesini geri olabilir önerilmiştir. etkili tedavilerin geliştirilebilir önce ancak, değerlendirme ve bozulmamış adacıklardaki potansiyel β-hücresi proliferatif bileşiklerin doğrulama gereklidir. Diyabetli bireyler haline kadavra insan adacıklar Nakli süredir kan glikoz dengesini geri yükler, ancak kullanılabilirliği ve bu deneysel işlemin başarısı adacıkları kıç nakli için mevcut insan adacık bir sıkıntısı ve ß-hücre ölümüne tarafından engellenirer nakli 4. Hatta insülin üreten hücrelerin çoğalmasını faktörlerin keşfiyle, büyük bir sorun hala in vivo ilgili sitelere bu faktörlerin teslim bulunmaktadır. β-hücresi proliferatif bileşiklerinin sürekli olarak verilmesi için bir strateji, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA). PLGA FDA kullanım öyküsü, yüksek güvenlik, biyolojik olarak parçalanma ve uzatılmış salım kinetik 5 sayesinde ilaç verme ürünlerini onaylı vardır. Özellikle PLGA in vivo ya da vücutta doğal olarak oluşan metabolitlerin laktik asit ve glikolik asit içine kültüründe ya su ile hidroliz ile degrade laktit ve glikolid kopolimeridir. Kapsüllenmiş madde bileşiği, difüzyon ve / veya bozunma kontrollü salım mekanizmalarının her ikisi tarafından çevredeki salınabilir. COI kapsüllenmesi unencapsula göre reaktif biyolojik alınabilirliğini geliştirmek için, enzimatik bozulmaya karşı koruma sağlarted COI 5. Bu PLGA mikro-kültür, bozulmamış adacıklardaki Aday bileşiklerin uygulanması için kullanılan ve edilebilir nihai olarak canlı üzerinde olduğunu göstermektedir. Transplantasyon protokolleri incelenmiştir önce ex vivo adacıklar için β-hücre mitojenler yönetmek için PLGA etkinliğini test önemlidir.
Şu anda, canlı hayvanlarda β-hücresi çoğalmasını ölçmek için herhangi bir teknik yoktur. Deneyler, bu nedenle immunolabeling için Pankreatanın sonraki diseksiyon ve işleme, canlı hayvan bu bileşiklerin tatbikatını gerektiren in vivo potansiyel proliferatif bileşiklerinin etkinliğini değerlendirmek. Bu protokoller, pahalı ve zahmetli olan, ve adacıklar ulaşacak bir garantisi olmadan, sistemik olarak uygulanabilir bileşiğin gerektirir. Bunun aksine, çok ölümsüzleştirilmiş β-hücreleri, kültür insülin üreten hücrelerin çalışma için kullanılabilir, ancak bu hücre hatları adacık mimarisi ve ORTAM eksikliğit organizmalar 6 canlı bulundu. Ölümsüzleştirilmiş β-hücre hatları da, böylece, in vivo endogen β-hücrelerinin daha replikasyon çok daha yüksek bir derecesine sahip proliferasyonunu bileşiklerin analizi komplike olarak karakterize edilir. Bu çalışmada, yetişkin farelerden izole edilen sağlam adacıklar kullanan bir protokol açıklar. β-hücresi çizgileri farklı olarak, bozulmamış adacıklardaki normal adacık mimarisi korur. Benzer şekilde, doğrudan kültür, bozulmamış adacıklardaki proliferatif bileşiklerin uygulanması İn vivo yapılan deneylerde, aksine önemli ölçüde doğru β-hücresi çoğalmasını ölçmek için gerekli olan reaktifler miktarını azaltmaktadır.
Bu çalışma, bu örnekte, bir COI yönetmek için PLGA kullanan rekombinant insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF). Bu inci halinde bileşik sürekli salgılanmasına izin veren burada tarif edilen yöntem, kültürlenmiş adacık ham bileşiğin tatbikat üzerine önemli bir avantaj kazandırane medya. Özellikle, bu deney proteinler ve bozulmamış adacıklardaki ilgi antikorların çeşitli yönetmek için değiştirilebilir. α-hücreleri de dahil olmak üzere başka endokrin hücre tipleri üzerinde etkiler de analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler onaylanmış ve Vanderbilt Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ile uygun olarak yapıldı.
Fluorofor ile 1. Etiketleme COI (İsteğe bağlı)
- Mikroküre kargo görselleştirmek için, örneğin süksinimidil esterlerin ya da floresan türevleri gibi (bir protein ile ilgili, örneğin) bir serbest primer amini ile reaksiyona girecek bir floresan boya, seçin. dimetil sülfoksit 200 ul (DMSO) içinde fluorofor (COI mol göre) 8x mol fazlalığı içinde çözündürülür.
- Süspanse bir taşıt çözeltisi içinde 800 ul'lik nihai bir hacme (62.5 ng / ul nihai konsantrasyona) 'ye kadar COI 50 mg. Araç çözeltisi COI kaynağına bağlı olarak değişiklik gösterecektir.
Not: tipik bir araç çözeltiler, fosfat tamponlu tuz (PBS) veya DMSO içerir. - Adım 1.1 fluorofor / DMSO çözeltisi tüm ekleyin ve ÇÇ'nı tekrar süspansiyon. Vorteks gece boyunca 4 ° C 'de. Seçenek olarak ise, oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı vorteks4 saat (RT).
- etiketleme reaksiyonu takiben, bir tuz giderme kolonu kullanılarak aşırı fluorofor çıkarın.
- tuz giderme kolonundan saklama tamponu boşaltın ve iyonu giderilmiş su 16 ml ile yıkayın. üzerinden tüm akışını atın.
- tuz giderme kolonuna floresan etiketli COI ekleyin. iyonu giderilmiş su, 1.2 ml ile elüte ve akış toplar.
- Tekrar yıkama adımı ek dört kez, her iyonu giderilmiş su, 1.2 ml ilave ve ayrı bir örnek olarak akışı toplamak.
- -80 ° C de örnekler üzerinden toplanan tüm akış dondurma ve 24 saat boyunca üretici talimatlarına göre liyofilize edin.
2. Su-içinde-yağ-içinde-su emülsiyon çözücü buharlaştırma yöntemi ile Mikroküre Hazırlama COI yüklü
- İlk su fazının (W1) oluşturmak için iyonu giderilmiş suyun 100 ul 1 mg floresan etiketli COI ekleyin.
- poli 65 mg çözülür (laktik-ko-glikolik acid) (50:50 laktid: glikolid, molekül ağırlığı 54.000 - bir mikrosantrifüj tüpü içinde, diklorometan içinde 750 ul 69,000). 10 Ultrasonicate - (160 W) 30 sn tamamen PLGA çözmek için. Bu yağ fazı (O) oluşturmaktadır.
- damla damla bir şekilde Ç evresine adım 2.1 oluşturulan W1 faz bütün ekleyin. W1 / O fazı oluşturmak için 30 saniye için 20,000 rpm'de bir elle tutulan homojenleştirici kullanılarak emülsiyon haline.
- 30 saniye için 20,000 rpm'de 1%, 15 ml (ağırlık / hacim), sulu bir poli (vinil alkol) (PVA) solüsyonu, damla damla bir tarzda W1 / O faz her ekleme ve elle tutulan homojenleştirici kullanılarak emülsiyon haline .
- solventi çıkarmak ve sulu fazın üretilmesi için, 1 saat için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak 635 mm Hg vakum için 200 ml yuvarlak tabanlı bir şişe ve konuyu adım 2.4 oluşturulan emülsiyon tüm aktarın.
- Sulu fazın kısım 1 mi adım 2.5 ila on dört mikrosantrifüj tüpleri oluşturulur. 7,500 de mikrosantrifüj tüpleri içinde sulu çözeltinin santrifüj8 dakika için xg.
NOT: Bu adımda, mikro kalan sulu çözelti içinde mevcut olan ve bir mikrosantrifüj tüpüne altına konsantre edilmiştir. - mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde dikkatli bir şekilde, bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın.
- Her bir mikrosantrifüj tüpüne deiyonize su 1 ml eklenerek aşırı PVA'nın mikro küreleri yıkayın. mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde 8 dakika boyunca 7.500 x g'de santrifüj ve yeniden dikkatli bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın.
Not: Geri kalan 100 ul sulu çözelti elde mikro küreler içerir.
- Her bir mikrosantrifüj tüpüne deiyonize su 1 ml eklenerek aşırı PVA'nın mikro küreleri yıkayın. mikrosantrifüj tüpü altındaki mikro küreler rahatsız etmeyecek şekilde 8 dakika boyunca 7.500 x g'de santrifüj ve yeniden dikkatli bir mikropipet ile mikrosantrifüj tüpleri pipetleme sulu çözelti 900 ul çıkarın.
- -80 ° C de aşama 2.7 üretilen sulu bir mikroküre çözelti dondurularak.
- göre bir dondurarak kurutucunun kullanarak Lyophilize mikroküreler üreticinin-20 ° C'de talimatları saklayın.
Not: Tamamen PLGA mikro küreler eritilmesi ve serbest protein 7, standart bir eğriye protein konsantrasyonu görece belirleyerek COI yükleme etkinliğini ölçmek. - Bir negatif kontrol olarak, (bundan sonra kontrol mikro-küreler olarak adlandırılır) "boş" mikro-küreler toplu oluşturur.
Not: Kontrol mikrosferlerin üretimi adım 1.2 araç çözeltisi 800 ul Resim COI eklenmesiyle hidrofilik COI yüklü mikro-üretimi ile aynıdır. β-hücresi mitojen deneyi için COI yüklenmiş PLGA mikro küreler PLGA göreceli kütle konsantrasyonunda maçı kontrol parçacıklar.
Adacık Kültür Medya ve Pre-tahlil Medya 3. hazırlanması
- sağlam fare adacıkları kültür 200 ml ortam hazırlayın: RPMI 11 mM glukoz,% 10 at serumu, 100 U / ml penisilin G ve 100 ug ile desteklenmiş 1640 ortamında ml streptomisin (bundan sonra ise şu şekilde de ifade /) Kültür ortamı sağlar.
Not 1: fetal sığır serumu (FBS) farklı olarak, at serumu plasental laktojen, proliferasyon tahlilinde analiz boşa β-hücresi proliferasyonu, bir indükleyici yoksundur.
NOT 2: PLGA mikroküreler kullanmadan önce sterilize edilmez gibi, kültür ortamına antibiyotik eklenmesi mikrobiyolojik kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. - 50 ml konik tüp içinde bir elektronik pipet ve yer ile adacık kültür ortamı 25 ml çıkarın. ön-deney ortamı oluşturmak için 0.2 mM EGTA bir son konsantrasyon ile 50 ml konik bir tüp içinde doku adacığı kültür ortamı 25 mL Supplement.
NOT: EGTA eklenmesi hafif adacık mimarisi değiştirmeden adacık hücre-hücre kişileri gevşetir. Bu adacık iç hücrelere ulaşabilir ÇÇ'nı sağlamaya yardımcı olur ve merkezi adacığın nekroz önlemeye yardımcı olur.
Bozulmamış Fare Adacık 4. Kültürleme
- önceden seçilen suşu, cinsiyet, ag bozulmamış adacıkları izolePankreas 8,9 rutin bir kolajenaz sindirimi ardından fare E ve genotip. Havuz birlikte örneklerinden gibi gelen adacıklar.
- Kısım adacık kültür ortamı 200 ul, 96 oyuklu bir doku kültür plakasının bir oyuğuna 40 adacıklar. kuyu başına Görme boyut maç adacıklar (numuneler arasındaki adacık denklik (IEQ) kesin bir değerlendirme gerekli değildir). bir buharlaştırma tamponu sağlamak için, 200 ul steril su ile adacıkları ile gözlere hemen bitişik boş kuyu doldurun. Kültür% 95 hava ve% 5 CO2 atmosferi altında bir gece boyunca 37 ° C 'de ortam adacıklar.
COI yüklü ve Kontrol PLGA Mikrokürelerinin 5. Yeniden süspansiyon
- gece boyunca doku adacığı çıktıktan sonra, liyofilize COI yüklü PLGA mikro-bir kısım ön deney ortamı eklenerek tekrar süspansiyon mikro bu mikrosantrifüj tüpü içinde COI nihai konsantrasyonu, 10 ng / ml (belirli bir miktarda COI miktarı, olduğu oluşturulan microspheres adım 2.9) 'de tespit edilmiştir. 4 ° C'de 10 sn uzun puls W 160 ° C'de 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde yeniden süspansiyon haline getirildi COI yüklü mikro küreler sonikasyon.
- Liyofilize kontrol PLGA mikrokürelerin eşit kütlesine öncesi deney ortamı aynı hacimde ekleyerek yeniden süspanse kontrolü PLGA mikroküreler. 4 ° C'de 10 sn uzun puls W 160 ° C'de 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde yeniden süspansiyon haline kontrol PLGA mikro küreleri sonikasyon.
- Görme mikro küreler iki cam lamelleri arasında yeniden süspanse mikroküreler 2 ul pipet ile dağılmış onaylayın. Epifloresans veya aydınlık mikroskop 40X objektif kullanılarak mikroküreler gözünüzde canlandırın.
- mikro-belirgin çekiş hala görünür ise, 4 ° C'de 10 sn uzun bakliyat ve yeniden süspansiyon haline getirilmiş mikro kürelerin tekrar görselleştirme W 160 ° C'de ek bir 10 dakika boyunca bir buzlu su banyosu içinde sonikasyon.
ÇÇ yüklü veya Control PLGA Mikrokürelerinin ile Adacık 6. Tedavi </ P>
- her bir COI yüklü mikro-küreleri ile tedavi edilmesi için, 100 ul'lik bir son hacim ve önceden belirlenmiş bir son konsantrasyona ön-deney ortamı, yeniden süspansiyon haline ÇÇ mikro-10 ng / ul seyrelterek deney ortamı hazırlar.
Not: protein uygun nihai konsantrasyon Bu deney için kullanılan her COI için değişecektir. İdeal olarak, nihai bir konsantrasyon aralığı test edilmiştir. - her bir kontrol olarak kullanılmak üzere, adım 6.1 COI yüklü mikro küreler seyreltilmesi için kullanılan aynı seyreltme hacimde Aşama 5.2'de elde yeniden süspanse kontrol PLGA mikro-seyreltilmesiyle kontrol deneyi ortamı hazırlar.
NOT: Kontrol deney ortamı ile tedavi Adacık boş mikroküreler deneysel sonuçlar üzerine olabilecek etkisi algılanmasını sağlamak için bir negatif kontrol olarak görev yapacak. - Dikkatle Resim adacıklar kuyulardan yerinden olan bu gibi bir mikropipet ile her bir adacık kültür ortamında 100 ul çıkarın. Yavaşça 100 mikron eklemekDeney ortamı veya her bir kontrol deney ortamı 100 ul l.
- Üç gün boyunca% 95 hava ve% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C 'de adacıklar inkübe edin.
7. Mikroskop Slaytlar üzerine Sağlam adacıklar Dispersleme
- Üç gün sonra, adacıklar çıkarmak için değil dikkatli bir şekilde tüm kuyulardan tahlil ortamı çıkarın ve atmak için bir mikropipet kullanın. Yavaşça tahlil medya onları yıkamak için adacıklar PBS ul 200 ekleyin. Dikkatlice çıkarın ve bir mikropipet ile PBS atmak ve yavaşça ilave 200 ul PBS ile tekrar adacıklar yıkayın.
- Çıkarın ve mikropipet ile PBS atmak ve% 0.025 tripsin 100 ul, 2 mM EDTA çözeltisi ekleyin. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Pipetleyin tripsin-EDTA çözeltisi yukarı ve adacıklar görsel tek hücrelere dağılması teyit kadar aşağı her 2 dakikada adacıklar bir ışık mikroskobu kullanılarak (hücre bazı küçük kümeleri hala mevcut olabilir unutmayın). her bir kuyunun bireyin tüm hacmi aktarınly labeled- mikrosantrifüj tüpleri içine.
- Tripsin-aracılı hücre ayrışmasını durdurmak için her mikrosantrifüj tüp adacık kültür ortamı 400 ul ekleyin.
- 4 ° C 'de 100 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri mikrosantrifüj tüplerine altına adacık hücreleri pelet.
- Yavaşça 200 ul taze adacık kültür ortamı bir mikropipet kullanarak süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
- Bir sito-santrifüj kullanarak, santrifüj yüklü mikroskop lamı üzerine 3 dakika boyunca 140 xg'de adacıklar ayrışmış.
- Oda sıcaklığında hava kuru slaytlar 10 dakika, daha sonra bir hidrofobik işaretleme kalemi ile ayrışmış adacıklar etrafında bir kutu çizin.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 75 ul% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin sabitleyin. % 4 PFA çıkarın ve yavaşça PBS 75 ul iki kez yıkama hücreleri. Yıkama işleminden sonra, 75 ul% 0.2 Triton X-100, PBS içinde 10 dakika boyunca hücreler geçirgenliği. Daha sonra, 75 ul PBS ile yıkama hücreleri.
Dikkat: PFA, alerjik karsinojenik ve toksik olduğu bilinmektedir. 8. İmmünofloresan İnsülin için Dissosiye Adacık Etiketleme ve Hücre Çoğalma Marker, Ki67 - 100 slayt kapasiteli mikroskop lamı kutusunun alt iki ıslak kağıt havlu koyarak nemli odasına hazırlayın.
- Yeri nemli odasında aşağı düz (yukarı bakacak şekilde hücreler) slaytlar. bir mikropipet kullanarak, önceki yıkama aşamasından PBS aspire ve bloke etme çözeltisi 75 ul ekleyerek etiketleme için numune hazırlanması (% 5 normal eşek serumu, PBS içinde (NDS)) numuneler için antikorların spesifik olmayan bağlanma bloke her kaydırın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke çözüm slaytlar inkübe edin.
- Yavaşça aspire mikropipet kullanılarak gine domuzu anti-insülin ile ve tavşan anti-Ki 67 antikorları ihtiva eden birincil antikor çözeltisinin 75 ul bloke etme çözeltisi, PBS içinde% 5 NDS 1 ug / ml seyreltilmiştir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
NOT: hücre çoğalması Alternatif belirteçleri hücre nükleer antijeni (PCNA) ve phosph çoğalan içerirohistone H3 (PH3), - Yavaşça bir mikropipet kullanarak birincil antikor çözüm aspire ve 75 ul PBS ile hücreleri yıkayın. PBS aspire bir mikropipet kullanarak ve hücreler iki kez daha, 75 uL PBS ile her zaman yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat için bloke etme çözeltisi 2 ug / ml'ye seyreltilmiş 75 ul anti-kobay Cy5 sekonder antikor ve anti-tavşan Cy3 ikincil antikor ile her bir örnek inkübe edin.
NOT: Zaten mikroküreler etiketlemek için kullanılan aynı ya da spektral örtüşen florofor ile işaretlenmiş sekonder antikorlar kullanmayın. - Mikropipet kullanılarak ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca PBS içinde 300 nM DAPI 75 ul inkübe aspire sekonder antikor çözeltisi. Aspire DAPI bir mikropipet kullanarak ve 5 dakika boyunca iyonu giderilmiş su içinde durulayın.
- Yavaşça bir mikropipet kullanarak numunelerin su aspire. bir damla bir cam lamel antifade reaktifi ihtiva eden hızlı kuruyan monte çözeltisi (yaklaşık 100 ul) nokta. o, aşağı mikroskop lamı örnek tarafı ters çevirinmontaj çözümü nto. Yavaşça kabarcıklarını çıkarmak ve yumuşak bir temizleme dokusu ile aşırı sıvı silip bir pipet ucu kullanılarak slayt karşı lamel basın. lamelleri oda sıcaklığında bir gece boyunca kurumaya bırakılır.
- görüntü elde etmek için ekli kamera ile bir Epifloresans mikroskop kullanın. Her fluorofor için en uygun pozlama süresi (- Ki67 için insülin 80 msn ve 250 msn DAPI için tipik olarak 20 milisaniye, 40) belirler. görüntü elde etme parametreleri tüm örnekler için eşit olduğundan emin olun.
- Her numune için, elle 3,000 insülin pozitif hücrelerin sayısı ve bunların da Ki67 pozitif kaç saymak. Sadece iyi tanımlanmış ve açıkça görülebilir bir çekirdeği insülin-pozitif hücrelerin sayısı. insülin-pozitif hücre sayısı ile Ki67 pozitif / insülin-pozitif hücrelerin sayısını bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile her numune için β-çoğalan hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
- Gün sonraβ-hücresi proliferasyonunda anlamlı bir fark kontrol ve tek yönlü bir varyans analizi ticari olarak temin istatistiksel yazılım kullanarak bu sonuçlara bakarak deney örnekleri arasında mevcut olan, her bir numune için β-hücrelerinin yüzdesinin etermining, belirler.
9. Görüntü Alma ve Analiz
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, yukarıdaki protokol kullanılarak oluşturulan mikro-görsel bir temsilidir. Burada açıklanan protokol çeşitli büyüklüklerde rhCTGF yüklü mikro küreler elde edilir. Bazı mikro daha büyük (Şekil 2) olabilir ancak mikro kürelerin büyük kısmı, çapı 1 um ila 10 olacaktır. Eğer arzu edilirse, mikro küre boyutu ayarlanmış ve homojenizasyon hızı ve süresi, kullanılan yüzey aktif madde konsantrasyonu, ve her bir su / yağ / su fazı 10 nispi hacim olarak üretim parametreleri göre optimize edilebilir.
PLGA mikro-ve daha sonra immunolabeling ile işlemden geçirildi, bozulmamış adacıklardaki yayılmasını takiben, hücreler (Şekil 3) arasında herhangi bir etiketleme yoksun numune bölgeleri görmek için yaygındır. Kültür tedavi sonrasında hala sağlam olan mikro-çoğu birlikteadacıklar mikroskop lamı üzerine bükülmüş sonra yıkama adımları sırasında kaldırıldı, bazıları kalır. Bu mikroküreler görüntüleme sırasında görüntülendi delik benzeri yapılar neden olur. Bu kalıntı mikroküreler genellikle sonraki ölçümü ile karışmaz.
görüntüleme sonra Ki67 pozitif / insülin-pozitif hücrelerin yüzdesi el etiketli hücrelerin toplam sayısının sayılmasıyla, veya yazılım, görüntü analizleri kullanılarak tayin edilebilir. Daha önce, yeniden birleştirici insan bağ dokusu büyüme faktörü (rhCTGF) ex vivo olarak 11, bozulmamış adacıklardaki fare β-hücresi çoğalmasını uyardığını göstermiştir. Söz konusu protokolü kullanarak, rhCTGF (rhCTGF-PLGA) içeren PLGA mikroküreler üretti. 3 gün proteini lo değildi gösteren, daha önce ham protein ile belirtildiği gibi β-hücresi çoğalması olan bir artış ile sonuçlanmıştır için rhCTGF-PLGA mikro küreler ile sağlam adacıklar tedavisi Microsphere nesil (Şekil 4) sırasında herhangi bir işlevsellik se.
Şekil 1:. PLGA Mikrokürelerinin Görsel Temsil üretim protokolüne bir floresan boya birleşmeyle, PLGA mikroküreler bir epifluorescent mikroskop kullanılarak görüntülendi olabilir. Ölçek çubuğu 200 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Boyut dağılımı değişebilir, ancak PLGA mikro kürelerin büyüklükleri dağılımı, en mikro çapı en az 10 um olur.arget = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Dağınık β-hücrelerin çoğalması ve immünofloresan Görselleştirme Dağınık adacıklar β-hücreleri çoğalan işaretlemek için proliferasyon belirteci Ki67 (kırmızı) ve insülin (yeşil) için immunolabeled edilir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile işaretlenmiştir. Oklar Ki67 pozitif / insülin-pozitif hücreler gösterir. Yıldız (*) yıkılamayan mikroküreler gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Β-hücre Pro sayısallaştırılması ve Analiz: Şekil 4üremesinin. rhCTGF-PLGA mikro kürelerden farklı miktarları ile tedavi edilmiş adacıklar. Ki67 pozitif / insülin-pozitif hücre sayısı, el ile tüm numunelerden sayılır ve insülin-pozitif β-hücrelerinin toplam sayısının bir yüzdesi olarak ifade edildi. X-ekseni, her tedavi rhCTGF mevcut nihai konsantrasyona karşılık gelir. İstatistiksel anlamlılık ANOVA Tukey çoklu karşılaştırma testi ile, bir tek-yol kullanılarak belirlenmiştir. İstatistiksel anlamlılık p ≤ 0.05 olarak kabul edildi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kültür içinde β-hücresi çoğalmasının bir çalışma tipik olarak birkaç zorluklar tarafından engellenmiştir. İlk olarak, ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri canlı adacıklar endojen β-hücrelerinde bulunan daha çoğalmasının yüksek derecede karakterize edilir. Buna ek olarak, bu ölümsüz hücre kuşakları, normal β-hücresi fonksiyonu için kritik normal yapısını yoksundur. Bu iki olgu sonuçlar, in vivo ya da bütün adacıklar test edildiğinde de geçerli olacaktır ölümsüzleştirilmiş β-hücresi çizgileri kullanılarak elde eğer tespit etmek zor hale. Adacık mimarisi muhafaza ve β-hücre çoğalması, in vivo olarak bulundu karşılaştırılabilir olduğu gibi taze izole bozulmamış fare adacıkları kullandığı Bizim açıklanan protokol, bu sorunları circumvents.
sağlam adacıklar kültürleme bir önemli endişe adacık çekirdek içindeki hücreler hipoksi kaynaklı nekroz uğrayacak ya da rhCTGF maruz olmayacaktır ihtimaldir. Bu nedenle, nihai0.1 mM EGTA konsantrasyonu adacık mimari zarar vermeden hücre-hücre temas gevşetmek için ortama ilave edilir. Biz daha önce tek başına EGTA eklenmesinin adacık çekirdek 12 medyada besin ve mitogenlerin artan erişimine muhtemelen nedeniyle β-hücre çoğalmasını, artırabilir yayımlanmıştır. EGTA yanıt olarak β-hücresi çoğalmasında artış, hücre-hücre temas kendisi 13,14 azalması nedeniyle olabilir. Bu protokolde belirtilen ortam, aynı zamanda at serumu yerine daha geleneksel cenin sığır serumu ile takviye edilmektedir. Bu değiştirme, olası proliferasyon tahlilinde analiz zorlaştıran, kendi başına β-hücresi çoğalmasını uyarır fetal sığır serumu içinde plasental laktojen varlığında yapılır.
adacık hücreleri (COI ile veya olmadan) PLGA mikrokürelerin göreceli toksisite belirlenmesi ma immünofloresan analizi yoluyla değerlendirilebilirTUNEL veya γ-H2AX 15,16 dahil olmak üzere hücre ölümü veya DNA hasarı rkers. PLGA mikrokürelerin eklenmesi ex vivo adacıklar herhangi bir belirgin zararlı etkileri gösterilmemiştir olmasına rağmen, kullanıcıların mikroküreler görüntü analizi olabilir etkilerinin farkında olmalıdır. Şekil 3'te gösterilmiştir ve sonuç bölümünde de belirtildiği gibi, bozulmamış mikroküreler artan konsantrasyonlar kullanılmaktadır görünmesini daha mikroküreler ile immunofluorescent görüntüler içinde koyu lekeler gibi görünen olabilir.
Açıklanan protokol izole fare adacıkları ile çalışmak için uygun olduğunu belirtmek gerekir. aynı koşullar, fare ve insan gibi alternatif organizmalar, hasat adacık birlikte çalışacak olan Bunun gibi, belli değildir. Farklı organizmalar genellikle farklı optimum kültür koşulları ve β-hücre çoğalmasının 17,18 de¤iflik derecelerde gelen Özellikle, hasat adacıklar.
Çok sayıda BiomMALZEMELERİNİN potansiyel poli (tioketal-üretan) ve poli (propilen sülfit) 19 de dahil olmak üzere izole adacıklar e rhCTGF yönetmek için kullanılabilir. Biz nedeniyle sahip olduğu birçok önemli nitelikleri PLGA odaklanmak seçti. İlk olarak, PLGA nispeten uygun fiyatlı reaktif ve mikroküreler en fazla araştırma kurumlarında mevcut standart ekipman (santrifüj, homojenleştirici, liyofilizerde) ile oluşturulabilir. PLGA onun biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanma ve bileşik bırakma oranları 20 modüle kabiliyeti sayesinde FDA onaylı cihazlarla başarılı kullanımı için emsal sahip yapay bir polimerdir. PLGA işleminde kendi yük serbest suyun varlığında hidroliz bozunur. Bir bileşiğin, birkaç haftalık bir süre boyunca in vivo olarak serbest bırakılacak PLGA parçacıkların kimyasal bileşimi, uygun olabilir. PLGA, yerel olarak, çeşitli organ ve Tissu'nun için bileşiklerin uygulanması klinik öncesi hayvan deneylerinde ve klinik insan tedavilerinde kullanılmıştıres 21,22. Diğer hidrofobik polimerler de biyolojik olarak parçalanabilen mikro-küreler üretilmesinde kullanılabilir. Bu polimerler, pH, sıcaklık ve reaktif oksijen türlerinin 23,24 varlığı gibi belirli çevresel uyaranlara, yanıt verebilir. Böylece, araştırmacılar dikkatli çalışmaları için en uygun olan biyomalzeme düşünmelisiniz.
PLGA veya diğer biomateryaller kullanan herhangi bir araştırmacı, kesilmemiş COI kıyasla kapsüllü COI etkileri arasındaki potansiyel farklılıkların farkında olmalıdır β-hücre çoğalmasını ex vivo çalışmak için. Örneğin, PLGA ile rhCTGF teslim kapsüllenmemiş protein ile tedaviye kıyasla β-hücresi çoğalması indüksiyon derecesi ve zamanlamasını değiştirebilir. laboratuarımızda devam eden çalışmalar halen bu potansiyel farklılıkları inceliyoruz.
kültürlenmiş adacık β-hücresi çoğalması analizi tanımlanması ve benim için güçlü bir modeldirβ-hücresi mitojenlerin chanistic analizi. Bu bir uzun süreli salınımlı uygulama aracı ile izole edilmiş kültürlenmiş adacık bir COI verilmesi için nispeten hızlı ve düşük maliyetli bir yöntem gösterir, burada açıklanan tahlil kullanılarak. Bu tahlil tamamen onun daha önce yayınlanmış in vivo β-hücre çoğalmasını uyardığı yeteneği ve ex vivo 11 dayanmaktadır CTGF'nin odaklanmak için hemen hemen her ilgi COI ve bizim seçim için geçerli olmalıdır. Ayrıca, bu testte adacıklar canlılarda nakledilen modellere geçmeden önce etkinlik ve teslim yöntemi olarak PLGA kullanan güvenliğini doğrulamak. Genel olarak, açıklanan protokol transplante dokuya PLGA güvenliğinin ölçülmesi ile ilgili daha geniş bir etki ile kültürlenmiş adacık için bileşiklerin uygulanması için yeni bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
