Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

إدارة مستدامة للMitogens β-خلية لالفشوت ماوس سليمة doi: 10.3791/54664 Published: November 5, 2016

Abstract

تطوير المواد الحيوية قد زاد بشكل كبير من إمكانية تسليم المخدرات تستهدف مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة أنواع، بما في ذلك β خلايا البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، توفر أيضا جزيئات بيولوجية، الهلاميات المائية، والسقالات فرصة فريدة لإدارة مستدامة وتقديم الأدوية يمكن السيطرة على بيتا خلايا في الثقافة وفي نماذج الأنسجة المزروعة. تسمح هذه التقنيات لدراسة العوامل انتشار مرشح β-الخلية باستخدام الجزر سليمة ونظام ذات الصلة translationally. وعلاوة على ذلك، تحديد فعالية وجدوى من العوامل مرشح لتحفيز انتشار β خلايا في نظام الثقافة أمر بالغ الأهمية قبل المضي قدما إلى نماذج في الجسم الحي. هنا، نحن تصف طريقة للمشاركة في ثقافة الجزر الماوس سليمة مع مجمع للتحلل من الفائدة (هيئة النزاهة) بولي -loaded (حمض اللبنيك-ك-الجليكوليك) (PLGA) المجهرية لغرض تقييم آثار مستمرة في الموقع الافراج سالعوامل مولد للتفتل و على انتشار β-الخلية. توضح هذه التقنية بالتفصيل كيفية توليد المجهرية PLGA التي تحتوي على البضائع المطلوب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا. في حين تستخدم تقنية الموضحة عامل المؤتلف الإنسان الضامة نمو الأنسجة (rhCTGF) على سبيل المثال، يمكن بسهولة أن تستخدم مجموعة واسعة من النزاهة. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة تستخدم لوحات 96-جيدا لتقليل كمية من المواد الكيميائية اللازمة لتقييم انتشار خلايا بيتا. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام المواد الحيوية البديلة وغيرها من الخصائص خلية الغدد الصماء مثل بقاء الخلية وحالة التمايز.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

البنكرياس β-الخلايا هي الوحيدة الخلايا المنتجة للانسولين في الجسم وحاسمة للحفاظ على مستوى السكر في الدم التوازن. بينما الأفراد الأصحاء لديها ما يكفي من الكتلة β خلايا وتعمل على تنظيم مستوى السكر في الدم بشكل صحيح، وتتميز الأفراد مع مرض السكري عن طريق عدم كفاية كتلة β خلايا و / أو وظيفة 1،2. وقد اقترح أن يحفز انتشار β خلايا يمكن أن تزيد في نهاية المطاف كتلة خلايا بيتا واستعادة توازن الجلوكوز في الأشخاص الذين يعانون من مرض السكري 3. ومع ذلك، وتقييم والتحقق من المركبات التكاثري β خلايا المحتملة في الجزر سليمة ضروري قبل علاجات فعالة يمكن تطويرها. زرع الجزر الإنسان المتوفين دماغيا في الأفراد الذين يعانون من مرض السكري يعيد السكر في الدم التوازن لبعض الوقت، ولكن يكبح توافر ونجاح هذا الإجراء التجريبي بسبب النقص في الجزر البشرية المتاحة للزرع وفاة بيتا خلية في الخلف الجزرزرع إيه 4. حتى مع اكتشاف العوامل التي تحفز على تكاثر الخلايا المنتجة للأنسولين، تحديا كبيرا لا يزال موجودا في تقديم هذه العوامل إلى المواقع ذات الصلة في الجسم الحي. استراتيجية واحدة للتسليم المحلي المستدام من β خلايا المركبات التكاثري هي بولي (اللبنيك-ك-الجليكوليك) حامض (PLGA). لديها PLGA تاريخ استخدام في ادارة الاغذية والعقاقير وافق تسليم المنتجات المخدرات بسبب سلامتها عالية، التحلل البيولوجي، وحركية الافراج عن 5 ممتدة. على وجه التحديد، PLGA هو كوبوليمر من lactide وglycolide أن يحط عن طريق التحلل بالماء إما في الجسم الحي أو في الثقافة إلى حمض اللاكتيك وحمض الجليكوليك، والتي تحدث بشكل طبيعي التمثيل الغذائي في الجسم. مجمع المخدرات مغلفة يمكن أن تنطلق في البيئة المحيطة من قبل كل من نشر و / أو آليات الافراج التي تسيطر عليها تدهور. التغليف من هيئة النزاهة يوفر الحماية ضد تدهور الأنزيمية، وتحسين التوافر البيولوجي للكاشف مقارنة unencapsulaتيد هيئة النزاهة 5. نقترح المجهرية PLGA يمكن استخدامها لإدارة المركبات مرشح لجزر سليمة في الثقافة، وفي نهاية المطاف في الجسم الحي. اختبار فعالية PLGA لإدارة mitogens خلايا بيتا في جزر المجراة سابقا من الأهمية بمكان قبل أن يتم استكشاف بروتوكولات الزرع.

حاليا، ليس هناك تقنية لقياس انتشار خلايا بيتا في الحيوانات الحية. التجارب لتقييم فعالية مركبات التكاثري المحتملة في الجسم الحي وبالتالي تتطلب إدارة هذه المركبات للعيش الحيوانات، مع تشريح لاحق وتجهيز بنكرياسات لimmunolabeling. هذه البروتوكولات هي مكلفة وشاقة، وتتطلب مجمع على أن تدار بشكل منتظم، دون أي ضمانات بأنهم سوف تصل إلى الجزر. على العكس، هي عدة خطوط خلايا بيتا خلد المتاحة لدراسة الخلايا المنتجة للأنسولين في الثقافة، ولكن هذه خطوط الخلايا تفتقر إلى بنية جزيرة والبيئة ...ر الموجودة في الكائنات الحية 6. تتميز خلد خطوط خلايا بيتا أيضا وجود درجة أعلى بكثير من النسخ من الذاتية β خلايا في الجسم الحي، مما يعقد تحليل المركبات التي تحفز على انتشار الأسلحة النووية. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول يستخدم الجزر سليمة معزولة من فئران بالغة. على عكس خطوط β خلايا، الجزر سليمة تحتفظ العمارة جزيرة طبيعية. وبالمثل، على النقيض من التجارب التي أجريت في الجسم الحي، وإدارة المركبات التكاثري مباشرة إلى الجزر سليمة مثقف يقلل بشكل كبير من كمية من الكواشف ما هو ضروري لقياس بدقة انتشار خلايا بيتا.

الدراسة الحالية تستخدم PLGA لإدارة هيئة النزاهة، في هذا المثال، الضامة عامل نمو الأنسجة البشري المؤتلف (rhCTGF). الطريقة الموصوفة هنا يمنح تفوقا كبيرا على إدارة مجمع الخام إلى الجزر مثقف لأنها تسمح لاطلاق سراح المستمر من المركب إلى عشروسائل الإعلام الإلكترونية. والجدير بالذكر أن هذا الاختبار يمكن تعديلها لإدارة مجموعة واسعة من البروتينات والأجسام المضادة التي تهم الجزر سليمة. الآثار على أنواع الخلايا في الغدد الصماء الأخرى، بما في ذلك α خلايا، ويمكن أيضا أن تحلل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد وافق جميع الإجراءات وتنفيذ وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية فاندربيلت.

1. التعريف هيئة النزاهة مع Fluorophore (اختياري)

  1. اختيار صبغة الفلورسنت التي سوف تتفاعل مع أمين الابتدائي المجاني (على سبيل المثال، على بروتين)، مثل استرات succinimidyl أو المشتقات فلوريسئين، لتصور البضائع microsphere. حل فائض المولي بقوة 8x (نسبة إلى مولات هيئة النزاهة) من fluorophore إلى 200 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]).
  2. و resuspend 50 ملغ من هيئة النزاهة تصل إلى الحجم النهائي من 800 ميكرولتر في حل السيارة (تركيز النهائي من 62.5 نانوغرام / ميكرولتر). فإن الحل مركبة تختلف تبعا لمصدر من هيئة النزاهة.
    وتشمل السيارة النموذجية حلول الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو DMSO: ملاحظة.
  3. إضافة كل من الحل fluorophore / DMSO من الخطوة 1.1 و resuspend هيئة النزاهة. دوامة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك، دوامة خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة(RT) لمدة 4 ساعة.
  4. وبعد رد فعل وضع العلامات، وإزالة fluorophore الزائدة باستخدام عمود تحلية.
    1. استنزاف عازلة التخزين من عمود تحلية وشطف مع 16 مل من الماء منزوع الأيونات. تجاهل كل التدفق من خلال.
    2. إضافة النزاهة fluorescently المسمى إلى العمود تحلية. أزل مع 1.2 مل من الماء منزوع الأيونات وجمع التدفق من خلال.
    3. كرر الخطوة شطف وأربع مرات إضافية، في كل مرة إضافة 1.2 مل من الماء منزوع الأيونات وجمع تدفق من خلال كعينة منفصلة.
    4. تجميد جميع تدفق التي تم جمعها من خلال العينات في -80 درجة مئوية، ويجفد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لمدة 24 ساعة.

2. النزاهة محملة إعداد Microsphere عن طريق الماء، الماء في الزيت في ومستحلب المذيبات التبخر الطريقة

  1. إضافة 1 وصفت ملغ من fluorescently هيئة النزاهة إلى 100 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات لتشكيل المرحلة المياه الأولى (W1).
  2. حل 65 ملغ من بولي (ACI اللبنيك-ك-الجليكوليكد) (50:50 Lactide: Glycolide، الوزن الجزيئي 54000 - 69000) في 750 ميكرولتر من ثنائي كلورو ميثان في أنبوب microcentrifuge. Ultrasonicate عن 10-30 ثانية (160 W) لإذابة تماما PLGA. وهذا يشكل مرحلة النفط (O).
  3. إضافة كل مرحلة W1 إنشاؤه في الخطوة 2.1 إلى مرحلة O بطريقة الإفلات من الحكمة. يستحلب باستخدام الخالط باليد في 20000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لتشكيل المرحلة W1 / O.
  4. إضافة كل مرحلة / O W1 بطريقة الإفلات من الحكمة أن 15 مل من 1٪ (وزن / حجم) بولي مائي (الفينيل الكحول) حل (بولي) ويستحلب باستخدام الخالط باليد في 20000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية .
  5. نقل كل من مستحلب إنشاؤه في الخطوة 2.4 إلى 200 مل قارورة جولة القاع وتخضع ل635 ملم زئبق فراغ باستخدام المبخر الدوار لمدة 1 ساعة لإزالة المذيبات وتوليد المرحلة المائية.
  6. قسامة 1 مل من المرحلة المائية ولدت في الخطوة 2.5 إلى أربعة عشر أنابيب microcentrifuge. الطرد المركزي في محلول مائي في أنابيب microcentrifuge في 7500x ج لمدة 8 دقائق.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، المجهرية موجودة في محلول مائي المتبقية وتتركز في الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
  7. إزالة بعناية 900 ميكرولتر من محلول مائي من أنابيب microcentrifuge مع micropipette، pipetting لوذلك لعدم إزعاج المجهرية على الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
    1. غسل المجهرية من فائض بولي بإضافة 1 مل منزوع الأيونات الماء إلى كل أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي في 7500 x ج لمدة 8 دقائق، ومرة ​​أخرى إزالة بعناية 900 ميكرولتر من محلول مائي من أنابيب microcentrifuge مع micropipette، pipetting لوذلك لعدم إزعاج المجهرية على الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
      ملاحظة: 100 محلول مائي ميكرولتر المتبقية يحتوي المجهرية التي تم إنشاؤها.
  8. تجميد الحل microsphere مائي إنشاؤه في الخطوة 2.7 في -80 درجة مئوية.
  9. المجهرية يجفد باستخدام مجفاد وفقا لالصانعتعليمات ومخزن في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: قياس كفاءة التحميل من هيئة النزاهة عن طريق إذابة تماما المجهرية PLGA وتحديد تركيز البروتين بالنسبة لمنحنى مستوى البروتين مجانا 7.
  10. ونتيجة لسيطرة سلبية، وتوليد مجموعة من المجهرية "على بياض" (يشار إليها فيما المجهرية السيطرة).
    ملاحظة: الجيل المجهرية تحكم مطابق لجيل من ماء المجهرية تحميل هيئة النزاهة، مع عدم وجود بالإضافة هيئة النزاهة إلى 800 ميكرولتر من الحل مركبة في الخطوة 1.2. الجسيمات إدارة المباريات في تركيز كتلة PLGA نسبة إلى المجهرية PLGA تحميل هيئة النزاهة لفحص β خلايا mitogen.

3. إعداد جزيرة الثقافة وسائل الإعلام وسائل الإعلام قبل الفحص

  1. إعداد 200 مل سائل الإعلام لثقافة الجزر الماوس سليمة: RPMI 1640 وسائل الإعلام تستكمل مع 11 ملي الجلوكوز، و 10٪ مصل الحصان، 100 U / مل البنسلين G و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (المشار إليه فيما هودعونا سائل الإعلام والثقافة).
    ملاحظة 1: على عكس الجنين المصل البقري (FBS)، مصل الحصان يفتقر إلى محفز الإلبان المشيمي، وهو محفز الانتشار β-الخلية، والتي يفند التحليل في فحص انتشار الأسلحة النووية.
    ملاحظة 2: كما لا يتم تعقيم المجهرية PLGA قبل استخدامها، إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام والثقافة أمر حاسم لتجنب التلوث الميكروبيولوجي.
  2. إزالة 25 مل من وسائل الإعلام ثقافة الجزيرة مع pipettor الإلكترونية ومكان في أنبوب مخروطي 50 مل. استكمال 25 مل من وسائل الإعلام ثقافة الجزيرة في 50 مل أنبوب مخروطي مع تركيز النهائي من 0.2 ملي EGTA لتوليد وسائل الإعلام قبل الفحص.
    ملاحظة: إضافة EGTA يحل أقل ما يقال الاتصالات خلية خلية في الجزر دون تغيير بنية جزيرة. هذا يساعد على ضمان النزاهة يمكن أن تصل إلى الخلايا الداخلية للجزيرة ويساعد على منع نخر للجزيرة المركزية.

4. التثقيف من الجزر ماوس سليمة

  1. عزل الجزر سليمة من سلالة مختارة مسبقا، الجنس، AGه، وراثى من الفئران بعد الهضم كولاجيناز الروتيني من 8،9 البنكرياس. تجمع الجزر معا من مثل العينات.
  2. قسامة 40 الجزر في بئر واحدة من لوحة 96-جيدا زراعة الأنسجة في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الجزيرة. بصريا الجزر حجم مباراة لكل بئر (تقييم دقيق للمعادلة جزيرة (IEQ) بين العينات ليست ضرورية). ملء الآبار الفارغة المجاورة على الفور إلى الآبار مع الجزر مع 200 ميكرولتر الماء المعقم لتوفير عازلة التبخر. ثقافة الجزر في وسائل الإعلام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية تحت جو من 95٪ الجوية و 5٪ CO 2.

5. إعادة تعليق النزاهة تحميل والجزئي تحكم PLGA

  1. بعد الشفاء جزيرة بين عشية وضحاها، المجهرية و resuspend عن طريق إضافة وسائل الاعلام قبل الاختبار لقسامة واحدة من المجهرية PLGA مجفف بالتجميد هيئة النزاهة تحميلها من هذا القبيل أن تركيز النهائي من هيئة النزاهة في أنبوب microcentrifuge هو 10 نانوغرام / ميكرولتر (كمية هيئة النزاهة الحاضر في كمية معينة من لميكرو ولدتتم تحديد pheres في الخطوة 2.9). يصوتن معلق المجهرية تحميل هيئة النزاهة في حمام ماء مثلج لمدة 10 دقيقة في 160 W مع نبضات طويلة 10 ثانية في 4 درجات مئوية.
  2. السيطرة و resuspend المجهرية PLGA بإضافة نفس الحجم من وسائل الإعلام ما قبل الاختبار لكتلة مساوية من السيطرة مجفف بالتجميد المجهرية PLGA. يصوتن المجهرية السيطرة PLGA معلق في حمام ماء مثلج لمدة 10 دقيقة في 160 W مع نبضات طويلة 10 ثانية في 4 درجات مئوية.
  3. تأكيد بصريا ينتشر المجهرية من قبل pipetting 2 ميكرولتر من المجهرية معلق بين اثنين coverslips الزجاج. تصور المجهرية باستخدام الهدف 40X على epifluorescence أو brightfield المجهر.
  4. إذا تجميع كبير من المجهرية لا تزال واضحة، يصوتن في حمام ماء مثلج لمدة 10 دقيقة إضافية في 160 W مع نبضات طويلة 10 ثانية في 4 درجات مئوية، وتكرار التصور المجهرية معلق.

6. العلاج من الجزر مع هيئة النزاهة تحميلها أو تحكم PLGA الجزئي </ P>

  1. لكل بئر في أن يعامل معاملة المجهرية تحميل هيئة النزاهة، إعداد وسائل الاعلام فحص عن طريق تمييع 10 نانوغرام / ميكرولتر من المجهرية هيئة النزاهة معلق مع وسائل الإعلام قبل الفحص إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر وتركيز النهائي محدد مسبقا.
    ملاحظة: التركيز النهائي الأمثل للبروتين تختلف عن كل هيئة النزاهة المستخدمة لهذا الاختبار. من الناحية المثالية، ويتم اختبار مجموعة من تركيزات النهائية.
  2. لكل بئر لاستخدامها كعنصر تحكم، وإعداد وسائل الاعلام مراقبة الفحص عن طريق تمييع السيطرة المجهرية PLGA معلق إنشاؤه في الخطوة 5.2 مع حجم التخفيف نفس المستخدمة لتخفيف المجهرية تحميل هيئة النزاهة في خطوة 6.1.
    ملاحظة: سوف الفشوت تعامل مع وسائل الإعلام السيطرة فحص بمثابة سيطرة سلبية لتمكين الكشف عن أي تأثير قد يكون المجهرية فارغة على النتائج التجريبية.
  3. إزالة بعناية 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة جزيرة من كل بئر مع micropipette بحيث لا الجزر وطردهم من الآبار. إضافة بلطف 100 μلتر من وسائل الاعلام فحص أو 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام سيطرة فحص كل بئر.
  4. احتضان الجزر عند 37 درجة مئوية تحت جو من 95٪ الجوية و 5٪ CO 2 لمدة ثلاثة أيام.

7. تشتيت الفشوت سليمة على مجهر الشرائح

  1. بعد ثلاثة أيام، واستخدام micropipette لإزالة بعناية وتجاهل وسائل الإعلام فحص من جميع الآبار حتى لا طرد الجزر. إضافة بلطف 200 ميكرولتر PBS إلى الجزر لغسلها من وسائل الإعلام الفحص. إزالة بعناية وتجاهل برنامج تلفزيوني مع micropipette وغسل بلطف الجزر مرة أخرى مع 200 ميكرولتر إضافية في برنامج تلفزيوني.
  2. إزالة والتخلص برنامج تلفزيوني مع micropipette وإضافة 100 ميكرولتر من 0.025٪ التربسين، 2 مم EDTA الحل. في احتضان RT لمدة 3 دقائق. الماصة الجزر في حل التربسين-EDTA صعودا وهبوطا كل دقيقة 2 حتى تأكدت الجزر بصريا لتكون مشتتة في الخلايا واحد (لاحظ أن بعض كتل صغيرة من الخلايا قد تكون لا تزال موجودة) باستخدام المجهر الضوئي. نقل كامل حجم كل فرد بشكل جيدلاي في أنابيب microcentrifuge labeled-.
  3. إضافة 400 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الجزيرة إلى كل أنبوب microcentrifuge لوقف تفكك خلية بوساطة التربسين.
  4. عينات الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 100 x ج في 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا خلايا البنكرياس إلى أسفل أنابيب microcentrifuge.
  5. إزالة بلطف طاف باستخدام micropipette، وبيليه resuspend في 200 وسائل الإعلام ثقافة جزيرة جديدة ميكرولتر.
  6. باستخدام خلوي الطرد المركزي، فصل أجهزة الطرد المركزي الجزر في 140 x ج لمدة 3 دقائق على الشرائح المجهر المشحونة.
  7. الشرائح الجافة الهواء في RT لمدة 10 دقيقة، ثم رسم مربع حول الجزر نأت بالقلم بمناسبة مسعور.
  8. إصلاح الخلايا مع 75 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في RT لمدة 10 دقيقة. إزالة 4٪ PFA وغسل بلطف الخلايا في 75 ميكرولتر PBS مرتين. بعد الغسيل، permeabilize الخلايا مع 75 ميكرولتر 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. ثم، وغسل الخلايا مع 75 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
    ومن المعروف PFA لتكون حساسية، مسببة للسرطان، وسمية: الحذر.
  9. 8. المناعي وصفها من فصل الفشوت للأنسولين وخلية انتشار ماركر، Ki67

    1. إعداد غرفة رطبة عن طريق وضع اثنين من المناشف الورقية الرطبة في الجزء السفلي من مربع شريحة قدرة المجهر 100 الشرائح.
    2. مكان شرائح مسطحة إلى أسفل (خلايا مواجهة) في غرفة رطبة. تحضير العينات لوضع العلامات بواسطة الشفط برنامج تلفزيوني من الخطوة غسل السابقة باستخدام micropipette وإضافة 75 ميكرولتر من عرقلة الحل (5٪ عادي حمار المصل (NDS) في PBS) إلى كل شريحة لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة للعينات. احتضان الشرائح في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT.
    3. بلطف منع نضح الحل باستخدام micropipette وإضافة 75 ميكرولتر من حل الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على خنزير غينيا مكافحة الأنسولين والأرنب أضداد Ki67، المخفف 1 ميكروغرام / مل في 5٪ NDS في برنامج تلفزيوني. في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: علامات بديلة لتكاثر الخلايا وتشمل تنتشر مستضد النووي للخلايا (بكنا) وphosphohistone H3 (PH3)،
    4. نضح بلطف حل الأجسام المضادة الأولية باستخدام micropipette وشطف الخلايا مع 75 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. نضح PBS باستخدام micropipette وشطف الخلايا مرتين أخريين، في كل مرة مع 75 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. احتضان كل عينة مع 75 ميكرولتر المضادة للخنزير غينيا Cy5 الأجسام المضادة الثانوية والمضادة للأرنب و Cy3 الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى 2 ميكروغرام / مل في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة على RT.
      ملاحظة: لا تستخدم الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع fluorophore نفس أو تداخل طيفيا الذي تم استخدامه بالفعل لتسمية المجهرية.
    5. نضح الأجسام المضادة الثانوية حل باستخدام micropipette واحتضان في 75 ميكرولتر من 300 نانومتر دابي في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقائق على RT. نضح دابي باستخدام micropipette وشطف في الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
    6. نضح بلطف المياه من العينات باستخدام micropipette. اكتشاف قطرة (حوالي 100 ميكرولتر) من الحل المتصاعدة بسرعة تجفيف تحتوي على antifade كاشف على ساترة الزجاج. عكس الجانب المجهر عينة الانزلاق، سn إلى حل في تصاعد مستمر. اضغط بلطف ساترة ضد الشريحة باستخدام طرف الماصة لإزالة الفقاعات ويمسح السائل الزائد بمنديل التنظيف الناعمة. السماح coverslips لتجف بين عشية وضحاها في RT.

    9. الحصول على الصور وتحليل

    1. استخدام المجهر epifluorescence مع كاميرا مثبتة على الحصول على الصور. لكل fluorophore، وتحديد الوقت الأمثل التعرض (عادة 20 ميللي ثانية للدابي، 40 - 80 ميللي ثانية للأنسولين، و 250 ميللي ثانية لKi67). ضمان المعلمات الحصول على الصور متساوية لجميع العينات.
    2. لكل عينة، يدويا الاعتماد 3000 الخلايا الأنسولين الإيجابي وتلك عد كم هي أيضا Ki67 إيجابية. الاعتماد فقط خلايا الأنسولين الإيجابي التي لها نواة واضحة المعالم واضحة للعيان. حساب النسبة المئوية للتكاثر خلايا بيتا لكل عينة بقسمة عدد الخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الأنسولين من قبل عدد من الخلايا الانسولين إيجابي وضرب من قبل 100.
    3. بعد دetermining نسبة الانتشار β خلايا لكل عينة، تحديد ما إذا كان فروق ذات دلالة إحصائية في انتشار β خلايا موجودة بين السيطرة والعينات التجريبية من خلال تحليل النتائج مع اتجاه واحد أنوفا باستخدام البرامج الإحصائية المتاحة تجاريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الرقم 1 هو تمثيل مرئي للالمجهرية المولدة باستخدام بروتوكول أعلاه. بروتوكول الموصوفة هنا غلة المجهرية تحميل rhCTGF من مختلف الأحجام. وأكبر جزء من المجهرية أن يكون بين 1 و 10 ميكرون في القطر، وعلى الرغم من بعض المجهرية قد يكون أكبر (الشكل 2). إذا رغبت في ذلك، حجم microsphere يمكن ضبطها والأمثل استنادا إلى معايير تلفيق مثل سرعة التجانس والوقت، والتركيز السطحي المستخدمة، وكميات النسبية لكل مرحلة المياه / النفط / الماء (10).

وبعد تشتت الجزر سليمة تعامل مع المجهرية PLGA وimmunolabeling لاحقا، فمن الشائع أن نرى مناطق العينة خالية من أي وضع العلامات في بين الخلايا (الشكل 3). في حين أن معظم المجهرية التي لا تزال على حالها بعد فترة العلاج الثقافة هيإزالة خلال خطوات الغسيل، لا تزال بعض بعد نسج الجزر على شرائح المجهر. هذه المجهرية تتسبب في هياكل تشبه ثقب تصور أثناء التصوير. هذه المجهرية المتبقية عادة لا تتداخل مع الكمي لاحق.

بعد التصوير، والنسبة المئوية للخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الأنسولين يمكن أن يكون كميا عن طريق العد يدويا العدد الكلي للخلايا المسمى، أو باستخدام تحليل صورة البرنامج. سابقا، لقد أثبتنا أن الضامة عامل نمو الأنسجة البشري المؤتلف (rhCTGF) يمكن أن تحفز انتشار الماوس β خلايا في الجزر سليمة خارج الحي 11. باستخدام بروتوكول المذكور، ولدت لنا المجهرية PLGA التي تحتوي على rhCTGF (rhCTGF-PLGA). علاج الجزر سليمة مع المجهرية rhCTGF-PLGA لمدة 3 أيام أسفرت عن زيادة مماثلة في انتشار β-خلية كما ذكرت سابقا مع البروتين الخام، مما يدل على أن البروتين لم يكن لو حد ذاتها أي وظيفة خلال جيل microsphere (الشكل 4).

شكل 1
الشكل 1: التمثيل المرئي للPLGA الجزئي من خلال دمج صبغة الفلورسنت في بروتوكول التصنيع، المجهرية PLGA يمكن تصور باستخدام مجهر epifluorescent. يمثل شريط مقياس 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: حجم توزيع PLGA الجزئي على الرغم من أن حجم التوزيع قد تختلف، ومعظم المجهرية سيكون أقل من 10 ميكرون في القطر.arget = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
وimmunolabeled التصور مناعي من فرقت المتكاثرة خلايا بيتا فرقت الجزر للعلامة انتشار Ki67 (الحمراء)، والانسولين (الأخضر) للاحتفال تنتشر خلايا بيتا: الرقم 3. وصفت نوى مع دابي (الأزرق). السهام تشير الخلايا Ki67 إيجابية / الإيجابي المعتمد على الأنسولين. النجمة (*) تشير المجهرية undegraded. يمثل شريط مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: الكمي وتحليل β خلايا بروliferation. الجزر تعامل مع كميات مختلفة من المجهرية rhCTGF-PLGA. وقد أحصى عدد الخلايا Ki67 إيجابية / إيجابي الانسولين يدويا من جميع العينات وكنسبة مئوية من إجمالي عدد β-خلايا الأنسولين الإيجابي. X-محور يتوافق مع تركيز النهائي من rhCTGF موجودة في كل معاملة. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام باتجاه واحد يتبع أنوفا من التجارب المقارنة متعددة توكي و. تم تعيين دلالة إحصائية عند P ≤ 0.05. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وعادة ما يعرقل دراسة انتشار β خلايا في الثقافة من قبل العديد من الصعوبات. أولا، تتميز خلد خطوط β-الخلية درجات أعلى من انتشار من ما هو موجود في الذاتية β-الخلايا في الجزر الحية. بالإضافة إلى ذلك، هذه خطوط الخلايا خلد تفتقر إلى بنية طبيعية حاسمة لوظيفة عادية β-الخلية. هاتين الحقيقتين تجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام خطوط β خلايا خلدت سيعقد صحيح عند اختباره في الجسم الحي أو في الجزر كلها. لدينا بروتوكول وصفها، والذي يستخدم المعزولة حديثا الجزر الماوس سليمة، وتلتف هذه القضايا كما يتم الحفاظ على العمارة جزيرة وانتشار β-خلية مماثلة لتلك الموجودة في الجسم الحي.

واحد قلق كبير عند زراعة الجزر سليمة هو احتمال أن الخلايا داخل نواة جزيرة سيخضع نخر الناجم عن نقص الأكسجة أو لن تتعرض لrhCTGF. لهذا السبب، نهائييضاف تركيز 0.1 ملي EGTA إلى وسائل الإعلام لتخفيف الاتصالات خلية خلية دون تعطيل العمارة جزيرة. نشرنا سابقا أن إضافة EGTA وحدها يمكن أن تزيد من انتشار خلايا بيتا، ويرجع ذلك يفترض أن زيادة فرص وصول المواد الغذائية وmitogens في وسائل الإعلام حتى النخاع جزيرة 12. ويمكن أيضا أن يكون راجعا إلى انخفاض في خلية خلية الاتصال نفسه 13،14 الزيادة في انتشار β خلايا ردا على EGTA. وتستكمل وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول أيضا مع مصل الحصان بدلا من أكثر تقليدية الجنين المصل البقري. يتم هذا الاستبدال بسبب وجود محفز الإلبان المشيمي في المصل البقري الجنين، والتي يمكن أن تحفز تكاثر خلايا بيتا من تلقاء نفسها، ويحتمل أن يعقد التحليل في فحص انتشار الأسلحة النووية.

تحديد سمية النسبية للالمجهرية PLGA (مع أو بدون هيئة النزاهة) إلى الخلايا جزيرة يمكن تقييمه من خلال تحليل المناعي أماهrkers من موت الخلايا أو التلف في الحمض النووي، بما في ذلك النفق أو γ-H2AX 15،16. على الرغم من أن إضافة المجهرية PLGA لم تظهر أي آثار ضارة واضحة إلى الجزر المجراة سابقا، يجب أن يكون المستخدمون على بينة من الآثار التي يمكن أن تترتب على المجهرية تحليل الصور. كما هو موضح في الشكل (3) والمذكورة في قسم النتائج، يمكن المجهرية undegraded يكون واضحا كما البقع الداكنة في الصور مناعي، مع مزيد المجهرية التي تظهر عندما يتم استخدام تركيزات متزايدة.

وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول وصف وجرى تصميم للعمل مع الجزر الماوس معزولة. على هذا النحو، فإنه من غير الواضح إذا كانت الظروف متطابقة ستعمل مع الجزر تحصد من الكائنات بديلة، مثل الفئران والبشر. والجدير بالذكر أن الجزر تحصد من الكائنات الحية المختلفة في كثير من الأحيان ظروف مختلفة زراعة الأمثل وبدرجات متفاوتة من β خلايا انتشار 17،18.

العديد biomالمقيدين تتوفر لإدارة rhCTGF إلى جزر معزولة، بما في ذلك بولي (thioketal يوريتان) وبولي (البروبيلين كبريتيد) 19 محتملة. اخترنا التركيز على PLGA بسبب عدة الصفات البارزة التي تملكها. أولا، PLGA هو كاشف بأسعار معقولة نسبيا والمجهرية يمكن أن تتولد مع المعدات القياسية (الطرد المركزي، الخالط، مجفاد) متوفرة في معظم المؤسسات البحثية. PLGA هو البوليمر الاصطناعية التي لديها سابقة للاستخدام الناجح في الأجهزة المعتمدة ادارة الاغذية والعقاقير نظرا لتوافق مع الحياة، التحلل البيولوجي، وقدرتها على تعديل معدلات الانبعاث مركب 20. PLGA يحط من قبل التحلل المائي في وجود الماء، والإفراج عن البضائع في هذه العملية. التركيب الكيميائي للجزيئات PLGA يمكن أن تكون مصممة بحيث يتم الإفراج عن مركب في الجسم الحي على مدى عدة أسابيع. كما تم استخدام PLGA في التجارب على الحيوانات قبل السريرية والعلاجات السريرية الإنسان محليا إدارة المركبات لمختلف الأجهزة وTISSUوفاق 21،22. ويمكن أيضا البوليمرات مسعور أخرى يمكن استخدامها في توليد المجهرية القابلة للتحلل. ويمكن لهذه البوليمرات يستجيب للمؤثرات بيئية محددة، مثل درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، ووجود أنواع الاكسجين التفاعلية 23،24. وبالتالي، يجب على الباحثين أن ينظر بعناية مادة بيولوجية هو الأنسب لدراستهم.

أي باحث الاستفادة PLGA، أو المواد الحيوية الأخرى، لدراسة انتشار خلايا بيتا خارج الحي يجب أن يكون على بينة من الخلافات المحتملة بين آثار النزاهة مغلفة مقارنة unencapsulated هيئة النزاهة. على سبيل المثال، يمكن تسليم rhCTGF عبر PLGA تغيير درجة وتوقيت β خلايا انتشار تحريض مقارنة مع العلاج مع البروتين unencapsulated. الدراسات الجارية في مختبرنا وتدرس حاليا هذه الاختلافات المحتملة.

تحليل انتشار β خلايا في الجزر مثقف هو نموذج قوي لتحديد وليتحليل chanistic من mitogens β-الخلية. باستخدام مقايسة الموصوفة هنا نعرض طريقة سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لإدارة لجنة النزاهة في الجزر مثقف معزولة مع وسيلة الافراج عن تسليم طويلة. وينبغي أن يكون هذا الاختبار ينطبق على أي نحو النزاهة من الفائدة، وخيارنا للتركيز على CTGF يستند فقط على قدرة نشرت سابقا لتحفيز تكاثر خلايا بيتا في الجسم الحي وخارج الحي 11. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الفحص صحة فعالية وسلامة استخدام PLGA كوسيلة من وسائل إيصال قبل التقدم إلى نماذج حيث يتم زرع الجزر في الكائنات الحية. وعموما، يوفر بروتوكول وصف طريقة جديدة لإدارة المركبات في الجزر مثقف مع تأثير أوسع على قياس سلامة PLGA إلى الأنسجة استنساخها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer ThermoFisher Scientific O6149 For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl Sulfoxide Fisher BioReagents BP231-1 For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01 Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 Sigma-Aldrich 739960 Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 Sigma-Aldrich 341584 Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640 Thermo Scientific 11879-020 For culturing islets
Dextrose Anhydrous Fisher BioReagents 200-075-1 Supplement for islet media
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotics for islet media
Normal horse serum Jackson ImmunoResearch 008-000-121 Supplement for islet media
96-well tissue culture plate Corning 3603 For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 For spinning cells onto microscope slides
EZ Single Cytofunnel Thermo Scientific A78710020 For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BioReagents BP118-500 Used in dissociating islets
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 For fixing cells
Triton  X-100 Fisher BioReagents BP151 For permeabilizing cells
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibody abcam ab15580 For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin Dako A0564 For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152 For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig Jackson ImmunoResearch 706-175-148 For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher Scientific D1306 For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-Mount Lerner Laboratories 13800 Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System Labconco 7382020 For lyophilization of microspheres

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15, (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (7), 007823 (2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161, (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27, (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8, (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3, (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64, (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55, (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20, (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56, (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119, (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22, (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19, (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16, (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3, (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114, (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9, (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
إدارة مستدامة للMitogens β-خلية لالفشوت ماوس سليمة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; عن طريق تحلل بولي (حامض اللبنيك في-ك-الجليكوليك) الجزئي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).More

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter