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Bioengineering

बरकरार माउस आइलेट्स के लिए β-सेल mitogens की निरंतर प्रशासन doi: 10.3791/54664 Published: November 5, 2016

Abstract

biomaterials के विकास में काफी सेल और ऊतक प्रकार की एक किस्म के लिए लक्षित दवा वितरण के लिए संभावित वृद्धि हुई है, अग्नाशय β-कोशिकाओं को भी शामिल है। निरंतर प्रशासन के अलावा, biomaterial कणों, हाइड्रोजेल, और scaffolds भी एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं चलाया दवा वितरण बीटा कोशिकाओं को संस्कृति में और प्रतिरोपित ऊतक मॉडल में। इन प्रौद्योगिकियों बरकरार टापू है और एक translationally प्रासंगिक प्रणाली का उपयोग उम्मीदवार β-सेल प्रसार कारकों के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक संस्कृति प्रणाली में β-सेल प्रसार उत्तेजक के लिए प्रभावशीलता और उम्मीदवार कारकों की व्यवहार्यता का निर्धारण करने में विवो मॉडल के लिए आगे बढ़ने से पहले महत्वपूर्ण है। इस के साथ साथ, हम ब्याज की biodegradable यौगिक (COI) -loaded पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) (पीएलजीए) सीटू रिहाई ओ में निरंतर के प्रभाव का आकलन करने के प्रयोजन के लिए microspheres के साथ सह-संस्कृति को बरकरार माउस टापू एक विधि का वर्णनβ-सेल प्रसार पर च mitogenic कारकों। इस तकनीक में विस्तार से वर्णन कैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग कर एक वांछित माल युक्त पीएलजीए microspheres उत्पन्न करते हैं। जबकि वर्णित तकनीक एक उदाहरण के रूप में पुनः संयोजक मानव संयोजी ऊतक वृद्धि कारक (rhCTGF) का उपयोग करता है, COI की एक विस्तृत विविधता को आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है। साथ ही, इस विधि β-सेल प्रसार का आकलन करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा को कम करने के लिए 96 अच्छी तरह प्लेटें का इस्तेमाल करता है। इस प्रोटोकॉल आसानी से वैकल्पिक biomaterials और इस तरह के सेल अस्तित्व और भेदभाव स्थिति के रूप में अन्य अंत: स्रावी सेल विशेषताओं का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

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अग्नाशय β-कोशिकाओं को शरीर में केवल इंसुलिन के उत्पादन कोशिकाओं रहे हैं और रक्त ग्लूकोज homeostasis को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। जबकि स्वस्थ व्यक्तियों के लिए पर्याप्त β-कोशिका द्रव्यमान है और ठीक से रक्त ग्लूकोज को विनियमित करने के लिए कार्य करते हैं, मधुमेह के साथ व्यक्तियों अपर्याप्त β-कोशिका द्रव्यमान और / या समारोह 1,2 की विशेषता है। यह प्रस्ताव किया गया है कि β-सेल प्रसार उत्प्रेरण अंततः β-सेल जन बढ़ाने के लिए और मधुमेह के साथ 3 व्यक्तियों में ग्लूकोज homeostasis बहाल कर सकते हैं। हालांकि, मूल्यांकन और बरकरार टापू में संभावित β-सेल proliferative यौगिकों के सत्यापन के लिए आवश्यक से पहले प्रभावी उपचार विकसित किया जा सकता है। मधुमेह के साथ व्यक्तियों में शव का मानव islets के ट्रांसप्लांटेशन कुछ समय के लिए रक्त ग्लूकोज homeostasis पुनर्स्थापित करता है, लेकिन उपलब्धता और इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया की सफलता के पीछे टापू में मानव प्रत्यारोपण के लिए उपलब्ध टापू की कमी से और बीटा कोशिका मृत्यु द्वारा रुकावट हैएर प्रत्यारोपण 4। इससे भी कारक है कि इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं के गुणन को उत्पन्न की खोज के साथ, एक बड़ी चुनौती अभी भी विवो में प्रासंगिक साइटों के लिए इन कारकों पहुंचाने में मौजूद है। β-सेल proliferative यौगिकों के निरंतर स्थानीय वितरण के लिए एक रणनीति पाली (लैक्टिक-सह-glycolic) एसिड (पीएलजीए) है। पीएलजीए एफडीए में उपयोग का एक इतिहास दवा वितरण के उत्पादों को मंजूरी दे दी अपनी उच्च सुरक्षा, biodegradability, और विस्तारित रिलीज कैनेटीक्स 5 के कारण है। विशेष रूप से, पीएलजीए है कि या तो इन विवो में या लैक्टिक एसिड और एसिड है, जो स्वाभाविक रूप से शरीर में उत्पन्न कर रहे हैं चयापचयों में संस्कृति में पानी के साथ हाइड्रोलिसिस के माध्यम से degrades lactide और Glycolide की एक copolymer है। समझाया दवा यौगिक दोनों प्रसार और / या गिरावट नियंत्रित रिलीज तंत्र द्वारा आसपास के वातावरण में जारी किया जा सकता है। COI के encapsulation, एंजाइमी गिरावट के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करता है अभिकर्मक के जैव उपलब्धता में सुधार unencapsula की तुलनाटेड COI 5। हमारा सुझाव है कि पीएलजीए microspheres और संस्कृति में बरकरार टापू को उम्मीदवार यौगिकों प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विवो में अंततः। पीएलजीए की प्रभावकारिता परीक्षण islets के लिए पूर्व vivo β-सेल mitogens प्रशासन के लिए महत्वपूर्ण प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल पता लगाया जाता है से पहले है।

वर्तमान में, वहाँ जीवित पशुओं में β-सेल प्रसार को मापने के लिए कोई तकनीक है। प्रयोगों विवो में संभावित proliferative यौगिकों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इसलिए immunolabeling के लिए बाद में विच्छेदन और Pancreata के प्रसंस्करण के साथ, जानवरों के रहने के लिए इन यौगिकों के प्रशासन की आवश्यकता है। ऐसे प्रोटोकॉल महंगी और श्रमसाध्य हैं, और परिसर की आवश्यकता होती है किसी भी गारंटी नहीं है कि वे टापू तक पहुंच जाएगा, बिना प्रणालीबद्ध प्रशासित किया जाना है। इसके विपरीत, कई अमर β-सेल लाइनों संस्कृति में इंसुलिन के उत्पादन की कोशिकाओं के अध्ययन के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन इन सेल लाइनों आइलेट वास्तुकला और पर्यावरण की कमीटी जीवों 6 रह में पाया। अमर β-सेल लाइनों भी विवो में अंतर्जात β-कोशिकाओं की तुलना में नकल का एक बहुत उच्च डिग्री होने के लिए, इस प्रकार यौगिकों कि प्रसरण का विश्लेषण उलझी रूप में होती हैं। इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल वयस्क चूहों से अलग बरकरार टापू का उपयोग करता है का वर्णन है। β-सेल लाइनों के विपरीत, अक्षत टापू सामान्य आइलेट वास्तुकला बरकरार रहती है। इसी तरह, विवो में किए गए प्रयोगों, सीधे सुसंस्कृत बरकरार टापू को proliferative यौगिकों के प्रशासन के विपरीत काफी अभिकर्मकों की मात्रा सही β-सेल प्रसार को मापने के लिए आवश्यक है कि कम करता है।

वर्तमान अध्ययन में इस उदाहरण में, एक COI प्रशासन के लिए पीएलजीए का इस्तेमाल करता है, पुनः संयोजक मानव संयोजी ऊतक विकास फैक्टर (rhCTGF)। विधि यहाँ वर्णित सुसंस्कृत टापू के लिए कच्चे परिसर के प्रशासन पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान के रूप में यह वीं में परिसर के एक निरंतर जारी करने के लिए अनुमति देता हैई मीडिया। विशेष रूप से, इस परख प्रोटीन और बरकरार टापू के हित के लिए एंटीबॉडी की एक विस्तृत विविधता प्रशासन के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रभाव α-कोशिकाओं सहित अन्य अंत: स्रावी प्रकार की कोशिकाओं पर भी विश्लेषण किया जा सकता है।

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Protocol

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सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और वेंडरबिल्ट संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे।

1. fluorophore साथ लेबल COI (वैकल्पिक)

  1. Microsphere माल कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट रंजक है कि (, जैसे एक प्रोटीन पर) एक नि: शुल्क प्राथमिक अमाइन साथ प्रतिक्रिया होगी ऐसी succinimidyl एस्टर या fluorescein डेरिवेटिव के रूप में, चुनें। 8x दाढ़ अतिरिक्त (DMSO) डाइमिथाइल sulfoxide के 200 μl में की fluorophore (COI की मोल्स के सापेक्ष) भंग।
  2. Resuspend एक वाहन के घोल में एक अंतिम 800 μl की मात्रा (62.5 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता) तक COI के 50 मिलीग्राम। वाहन समाधान COI के स्रोत के आधार पर अलग अलग होंगे।
    नोट: विशिष्ट वाहन समाधान फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या DMSO शामिल हैं।
  3. 1.1 कदम से fluorophore / DMSO के समाधान के सभी जोड़े और COI resuspend। भंवर 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर। वैकल्पिक रूप से, कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया मिश्रण भंवर(आरटी) 4 घंटे के लिए।
  4. लेबलिंग प्रतिक्रिया के बाद, एक desalting स्तंभ का उपयोग अतिरिक्त fluorophore को हटा दें।
    1. desalting स्तंभ से भंडारण बफर नाली और विआयनीकृत पानी की 16 मिलीलीटर के साथ कुल्ला। के माध्यम से सभी प्रवाह त्यागें।
    2. desalting स्तंभ के लिए fluorescently लेबल COI जोड़ें। विआयनीकृत पानी की 1.2 मिलीलीटर के साथ Elute और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा।
    3. दोहराएँ क्षालन कदम के लिए एक अतिरिक्त चार बार, हर बार विआयनीकृत पानी की 1.2 मिलीलीटर जोड़ने और एक अलग नमूना के रूप में के माध्यम से प्रवाह का संग्रह।
    4. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने के माध्यम से सभी एकत्र प्रवाह रुक और 24 घंटे के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार lyophilize।

2. COI से भरी हुई Microsphere तैयारी पानी में तेल-में-पानी पायस विलायक वाष्पीकरण विधि के माध्यम से

  1. विआयनीकृत पानी के 100 μl के लिए 1 मिलीग्राम की fluorescently लेबल COI जोड़े पहले पानी चरण (W1) के रूप में।
  2. पाली के 65 मिलीग्राम भंग (लैक्टिक-सह-glycolic एसीआईघ) (50:50 Lactide: Glycolide, आणविक वजन 54,000 - एक microcentrifuge ट्यूब में क्लोराइड के 750 μl में 69,000)। 10 के लिए Ultrasonicate - 30 सेकंड (160 डब्ल्यू पर) पूरी तरह से पीएलजीए भंग करने के लिए। इस तेल चरण (ओ) रूपों।
  3. एक बूंद-वार ढंग से हे चरण के लिए 2.1 चरण में उत्पन्न W1 चरण के सभी जोड़े। 30 सेकंड के लिए 20,000 rpm पर एक हाथ से आयोजित homogenizer का उपयोग कर के रूप में करने W1 / हे चरण पायसी।
  4. 30 सेकंड के लिए 20,000 rpm पर एक 1% की 15 मिलीलीटर (वजन / मात्रा) जलीय पाली (विनाइल शराब) (PVA) समाधान करने के लिए एक बूंद-वार ढंग से W1 / हे चरण के सभी जोड़े और एक हाथ से आयोजित homogenizer का उपयोग पायसी ।
  5. 2.4 चरण में उत्पन्न पायस के सभी 1 घंटे के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर विलायक हटाने और जलीय चरण उत्पन्न करने के लिए एक 635 ​​मिमी पारा शून्य करने दौर नीचे फ्लास्क और विषय एक 200 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण।
  6. अशेष 1 जलीय चरण की मिलीलीटर 2.5 कदम से चौदह microcentrifuge ट्यूब में उत्पन्न। 7500 में microcentrifuge ट्यूब में जलीय घोल Centrifuging8 मिनट के लिए XG।
    नोट: इस चरण में, microspheres शेष जलीय घोल में मौजूद हैं और microcentrifuge ट्यूब के नीचे केंद्रित कर रहे हैं।
  7. ध्यान से जलीय समाधान के 900 μl microcentrifuge ट्यूब से एक micropipette के साथ, pipetting के रूप में तो microcentrifuge ट्यूब के तल पर microspheres को परेशान नहीं करने के लिए हटा दें।
    1. प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब विआयनीकृत पानी 1 मिलीलीटर जोड़कर अतिरिक्त PVA की microspheres धो लें। 8 मिनट के लिए 7500 XG पर अपकेंद्रित्र, और फिर ध्यान से जलीय समाधान के 900 μl microcentrifuge ट्यूब से एक micropipette के साथ, pipetting के रूप में तो microcentrifuge ट्यूब के तल पर microspheres को परेशान नहीं करने के लिए हटा दें।
      नोट: शेष 100 μl जलीय समाधान उत्पन्न microspheres शामिल हैं।
  8. -80 डिग्री सेल्सियस पर कदम 2.7 में उत्पन्न जलीय microsphere समाधान रुक।
  9. के अनुसार एक lyophilizer का उपयोग कर Lyophilize microspheres निर्मातानिर्देश और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    नोट: COI की लोडिंग क्षमता को मापने के लिए पूरी तरह से पीएलजीए microspheres भंग और निर्धारित मुक्त प्रोटीन 7 की एक मानक वक्र के लिए प्रोटीन एकाग्रता रिश्तेदार द्वारा।
  10. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, "रिक्त" microspheres (इसके बाद नियंत्रण microspheres के रूप में) के एक बैच उत्पन्न करते हैं।
    नोट: नियंत्रण microspheres की पीढ़ी, हाइड्रोफिलिक COI से भरी हुई microspheres की पीढ़ी के लिए समान है 1.2 चरण में वाहन समाधान के 800 μl करने के लिए कोई COI अलावा के साथ। β-सेल माइटोजन परख के लिए COI से भरी हुई पीएलजीए microspheres को पीएलजीए रिश्तेदार की बड़े पैमाने पर एकाग्रता में मैच नियंत्रण कणों।

3. आइलेट संस्कृति, मीडिया और पूर्व परख मीडिया की तैयारी

  1. बरकरार माउस टापू की संस्कृति के लिए 200 मिलीलीटर मीडिया तैयार: 1640 मीडिया 11 मिमी ग्लूकोज, 10% घोड़े सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन जी और 100 माइक्रोग्राम प्रति के साथ पूरक RPMI / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (इसके बाद है के रूप में भेजासंस्कृति मीडिया करते हैं)।
    नोट 1: भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के विपरीत, घोड़े सीरम अपरा lactogen, β-सेल प्रसार, जो प्रसार परख में विश्लेषण घालमेल की एक inducer का अभाव है।
    नोट 2: पीएलजीए microspheres के रूप में उपयोग करने से पहले निष्फल नहीं कर रहे हैं, संस्कृति मीडिया के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा सूक्ष्मजीवविज्ञानी संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. एक इलेक्ट्रॉनिक pipettor और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह के साथ आइलेट संस्कृति मीडिया के 25 मिलीलीटर निकालें। 0.2 मिमी EGTA के अंतिम एकाग्रता के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आइलेट संस्कृति मीडिया के 25 मिलीलीटर अनुपूरक पूर्व परख मीडिया उत्पन्न करते हैं।
    ध्यान दें: EGTA के अलावा हल्का आइलेट वास्तुकला बदलने के बिना टापू में सेल सेल संपर्कों loosens। यह COI सुनिश्चित आइलेट के भीतरी कोशिकाओं तक पहुँच सकते हैं मदद करता है और केंद्रीय आइलेट के नेक्रोसिस को रोकने में मदद करता है।

4. बरकरार माउस आइलेट्स के संवर्धन

  1. एक पूर्व चयनित तनाव, लिंग, एजी से बरकरार टापू अलगई, और अग्न्याशय 8,9 की दिनचर्या collagenase पाचन के बाद चूहों के जीनोटाइप। पूल एक साथ नमूने की तरह से islets।
  2. अशेष आइलेट संस्कृति मीडिया के 200 μl में एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में से एक अच्छी तरह से में 40 टापू। अच्छी तरह से प्रति दिखने में आकार मैच टापू (नमूने के बीच आइलेट समानक (IEQ) का एक सटीक आकलन आवश्यक नहीं है)। खाली कुओं तुरंत 200 μl बाँझ पानी के साथ टापू एक वाष्पीकरण बफर प्रदान करने के साथ कुओं से सटे भरें। संस्कृति 95% हवा और 5% सीओ 2 के माहौल के तहत मीडिया को रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर में islets।

5. COI से भरी हुई है और नियंत्रण पीएलजीए microspheres की फिर से निलंबन

  1. रात भर आइलेट वसूली के बाद, lyophilized COI से भरी हुई पीएलजीए microspheres की एक विभाज्य करने के लिए पूर्व-परख मीडिया जोड़कर resuspend microspheres ऐसी है कि microcentrifuge ट्यूब में COI के अंतिम एकाग्रता 10 एनजी / μl (की दी गई राशि में COI वर्तमान की राशि है माइक्रो उत्पन्नpheres कदम 2.9) में निर्धारित किया गया था। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड लंबा दालों के साथ डब्ल्यू 160 पर 10 मिनट के लिए एक बर्फ नहाने के पानी में resuspended COI से भरी हुई microspheres Sonicate।
  2. lyophilized नियंत्रण पीएलजीए microspheres के बराबर का बड़े पैमाने पर करने के लिए पूर्व-परख मीडिया के एक ही मात्रा जोड़कर Resuspend नियंत्रण पीएलजीए microspheres। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड लंबा दालों के साथ डब्ल्यू 160 पर 10 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी से स्नान में resuspended नियंत्रण पीएलजीए microspheres Sonicate।
  3. दिखने में इस बात की पुष्टि microspheres दो गिलास coverslips के बीच resuspended microspheres की 2 μl pipetting द्वारा बिखरे हैं। एक epifluorescence या brightfield खुर्दबीन पर एक 40x उद्देश्य का उपयोग microspheres कल्पना।
  4. microspheres की महत्वपूर्ण एकत्रीकरण अभी भी दिखाई दे रहा है, तो एक अतिरिक्त 10 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 सेकंड लंबा दालों और resuspended microspheres की दोहराने दृश्य के साथ डब्ल्यू 160 मिनट के लिए एक बर्फ के पानी के स्नान में Sonicate।

6. COI से भरी हुई या नियंत्रण पीएलजीए microspheres के साथ आइलेट्स का उपचार </ P>

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से भरी हुई COI microspheres के साथ इलाज किया जा करने के लिए, और 100 μl के अंतिम मात्रा एक पूर्व निर्धारित अंतिम एकाग्रता के लिए प्री-परख मीडिया के साथ resuspended COI microspheres की 10 एनजी / μl गिराए द्वारा परख मीडिया तैयार करते हैं।
    नोट: प्रोटीन का इष्टतम अंतिम एकाग्रता इस परख के लिए इस्तेमाल प्रत्येक COI के लिए अलग अलग होंगे। आदर्श रूप में, अंतिम सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण कर रहे हैं।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, कदम 6.1 में COI से भरी हुई microspheres को कमजोर करने के लिए इस्तेमाल एक ही कमजोर पड़ने की मात्रा के साथ कदम 5.2 में उत्पन्न resuspended नियंत्रण पीएलजीए microspheres गिराए द्वारा नियंत्रण परख मीडिया तैयार करते हैं।
    नोट: नियंत्रण परख मीडिया के साथ इलाज किया आइलेट्स कोई असर खाली microspheres प्रयोगात्मक परिणामों पर हो सकता है का पता लगाने के लिए सक्षम करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा।
  3. ध्यान से एक micropipette ऐसी है कि कोई टापू कुओं से उखाड़ फेंकना रहे हैं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से आइलेट संस्कृति मीडिया के 100 μl को हटा दें। धीरे 100 μ जोड़नेपरख मीडिया या अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए नियंत्रण परख मीडिया के 100 μl के एल।
  4. तीन दिनों के लिए 95% हवा और 5% सीओ 2 के माहौल के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर टापू सेते हैं।

7. खुर्दबीन स्लाइड पर बरकरार आइलेट्स Dispersing

  1. तीन दिनों के बाद, एक micropipette का उपयोग सावधानी से सभी कुओं से हटाने और परख मीडिया त्यागने के लिए इतनी के रूप में टापू को बेदखल करने के लिए नहीं। धीरे उन्हें परख मीडिया के धोने के लिए टापू 200 पीबीएस μl जोड़ें। ध्यान से निकालें और एक micropipette के साथ पीबीएस त्यागने और धीरे एक अतिरिक्त 200 μl पीबीएस के साथ फिर से टापू धो लें।
  2. निकालें और एक micropipette के साथ पीबीएस त्यागने और 0.025% trypsin के 100 μl, 2 मिमी EDTA समाधान जोड़ें। 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। Pipet trypsin-EDTA समाधान ऊपर और नीचे हर 2 मिनट तक टापू नेत्रहीन एकल कक्षों में बिखरे होने की पुष्टि कर रहे हैं में islets (ध्यान दें कि कोशिकाओं के कुछ छोटे गुच्छों अभी भी मौजूद हो सकता है) एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग। प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्ति की संपूर्ण मात्रा स्थानांतरणLy labeled- microcentrifuge ट्यूबों में।
  3. ट्रिप्सिन की मध्यस्थता सेल हदबंदी को रोकने के लिए प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब आइलेट संस्कृति मीडिया के 400 μl जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 XG पर 5 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र microcentrifuge ट्यूबों के नीचे करने के लिए आइलेट गोली कोशिकाओं।
  5. धीरे 200 μl ताजा आइलेट संस्कृति मीडिया में एक micropipette का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला, और resuspend गोली निकालें।
  6. एक cyto-सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करना, सेंट्रीफ्यूज का आरोप लगाया खुर्दबीन स्लाइड पर 3 मिनट के लिए 140 XG पर टापू अलग।
  7. आरटी पर शुष्क हवा स्लाइड 10 मिनट के लिए, तो एक हाइड्रोफोबिक अंकन कलम के साथ अलग टापू के चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित।
  8. 10 मिनट के लिए आरटी पर 75 μl 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। 4% पीएफए ​​निकालें और धीरे कोशिकाओं 75 μl में पीबीएस दो बार धो लो। धोने के बाद, 10 मिनट के लिए 75 μl 0.2% ट्राइटन X-100 पीबीएस के साथ कोशिकाओं permeabilize। फिर, 75 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    सावधानी: पीएफए, allergenic कैंसर, और विषाक्त हो जाता है।
  9. इंसुलिन के लिए Dissociated आइलेट्स की 8. immunofluorescence लेबलिंग और सेल प्रसार मार्कर, Ki67

    1. एक 100 स्लाइड क्षमता खुर्दबीन स्लाइड बॉक्स के नीचे में दो गीला कागज तौलिये रखकर एक नम कक्ष तैयार करें।
    2. जगह फ्लैट नीचे नम कक्ष में (सामना करना पड़ रहा कोशिकाओं) स्लाइड। एक micropipette का उपयोग पिछले धोने कदम से पीबीएस aspirating और अवरुद्ध समाधान के 75 μl जोड़कर लेबलिंग के लिए नमूने तैयार (5% सामान्य गधा सीरम (पीबीएस में एनडीएस)) के नमूनों के लिए एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए प्रत्येक स्लाइड के लिए। आरटी पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में स्लाइड्स सेते हैं।
    3. धीरे महाप्राण अवरुद्ध समाधान एक micropipette का उपयोग और प्राथमिक एंटीबॉडी गिनी पिग विरोधी इंसुलिन और खरगोश विरोधी Ki67 एंटीबॉडी युक्त समाधान के 75 μl जोड़ने के लिए, पीबीएस में 5% एनडीएस में 1 माइक्रोग्राम / एमएल पतला। 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
      नोट: सेल प्रसार के वैकल्पिक मार्कर सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) और phosph proliferating शामिलohistone H3 (PH3),
    4. धीरे से एक micropipette का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालना और 75 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं कुल्ला। महाप्राण पीबीएस एक micropipette का उपयोग और कोशिकाओं दो बार, 75 μL पीबीएस के साथ हर बार कुल्ला। 75 μl विरोधी गिनी पिग Cy5 माध्यमिक एंटीबॉडी और विरोधी खरगोश Cy3 माध्यमिक एंटीबॉडी आरटी पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में 2 माइक्रोग्राम / एमएल पतला के साथ प्रत्येक नमूने सेते हैं।
      नोट: एक ही है या प्रेतसंबंधी ओवरलैपिंग fluorophore कि पहले से ही microspheres लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग न करें।
    5. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए एक micropipette का उपयोग और आरटी पर 3 मिनट के लिए पीबीएस में 300 एनएम DAPI के 75 μl में सेते हैं। महाप्राण DAPI एक micropipette का उपयोग और 5 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी में कुल्ला।
    6. धीरे से एक micropipette का उपयोग नमूनों से पानी निकालना। एक बूंद तेजी से सूखने बढ़ते समाधान एक गिलास coverslip पर antifade अभिकर्मक युक्त (लगभग 100 μl) हाजिर। खुर्दबीन स्लाइड नमूना नीचे की ओर पलटना, ओNto बढ़ते समाधान। धीरे बुलबुले को दूर करने और एक नरम सफाई ऊतक के साथ अतिरिक्त तरल दूर पोंछने के लिए एक pipet टिप का उपयोग कर स्लाइड के खिलाफ coverslip दबाएँ। coverslips आरटी पर रातोंरात सूखे की अनुमति दें।

    9. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण

    1. छवि अधिग्रहण के लिए एक संलग्न कैमरा के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। प्रत्येक fluorophore के लिए, निर्धारित इष्टतम जोखिम समय (DAPI लिए आम तौर पर 20 मिसे, 40 - Ki67 के लिए इंसुलिन के लिए 80 मिसे, और 250 मिसे)। सुनिश्चित करें छवि अधिग्रहण मापदंडों के सभी नमूनों के लिए बराबर हैं।
    2. प्रत्येक नमूने के लिए, मैन्युअल 3,000 इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं की गिनती और उन लोगों की गिनती कितने भी Ki67 पॉजिटिव हैं। केवल इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं एक अच्छी तरह से परिभाषित किया है और स्पष्ट रूप से दिखाई नाभिक है कि गिनती। इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं की कुल संख्या से Ki67 पॉजिटिव / इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को विभाजित और 100 से गुणा करके प्रत्येक नमूना के लिए β-कोशिकाओं proliferating के प्रतिशत की गणना।
    3. डी के बादप्रत्येक नमूना के लिए β-कोशिकाओं proliferating का प्रतिशत etermining, निर्धारित करती है कि β-सेल प्रसार में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नियंत्रण और एक तरह से एनोवा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के साथ परिणामों का विश्लेषण करके प्रयोगात्मक नमूनों के बीच मौजूद है।

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Representative Results

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चित्रा 1 ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पन्न microspheres के एक दृश्य प्रतिनिधित्व है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल पैदावार विभिन्न आकार के rhCTGF से भरी हुई microspheres। Microspheres का सबसे बड़ा अंश व्यास में 1 और 10 माइक्रोन के बीच हो सकता है, हालांकि कुछ microspheres बड़ा (चित्रा 2) हो सकता है। अगर वांछित, microsphere आकार देखते और इस तरह के homogenization गति और समय, surfactant इस्तेमाल किया एकाग्रता, और प्रत्येक पानी / तेल / पानी चरण में 10 के सापेक्ष संस्करणों के रूप में निर्माण मानकों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता।

पीएलजीए microspheres और बाद immunolabeling के साथ इलाज बरकरार टापू के प्रसार के बाद, यह नमूना कोशिकाओं (चित्रा 3) के बीच में किसी भी लेबलिंग से रहित के क्षेत्रों को देखने के लिए आम है। जबकि microspheres है कि अभी भी संस्कृति उपचार की अवधि के बाद बरकरार हैं का सबसे रहे हैंधोने के चरणों के दौरान हटा दिया, कुछ के बाद टापू खुर्दबीन स्लाइड पर घूमती हैं रहते हैं। ये microspheres इमेजिंग के दौरान कल्पना की छेद संरचनाओं की तरह कारण। ये अवशिष्ट microspheres आमतौर पर बाद में मात्रा का ठहराव के साथ हस्तक्षेप नहीं करते।

इमेजिंग के बाद, Ki67 पॉजिटिव / इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत मैन्युअल लेबल कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना, या सॉफ्टवेयर छवि विश्लेषण का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इससे पहले, हम दिखा दिया है कि पुनः संयोजक मानव संयोजी ऊतक विकास फैक्टर (rhCTGF) बरकरार टापू में पूर्व vivo 11 माउस β-सेल प्रसार को प्रोत्साहित कर सकते हैं। ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम rhCTGF (rhCTGF-पीएलजीए) युक्त पीएलजीए microspheres उत्पन्न। rhCTGF-पीएलजीए microspheres के साथ बरकरार टापू इलाज 3 दिन के लिए β-सेल प्रसार में एक समान वृद्धि पहले से कच्चे प्रोटीन के साथ सूचना के रूप में हुई, प्रदर्शन है कि प्रोटीन लो नहीं किया microsphere पीढ़ी (चित्रा 4) के दौरान किसी भी कार्यक्षमता se।

आकृति 1
चित्रा 1:। पीएलजीए microspheres के दृश्य प्रतिनिधित्व विनिर्माण प्रोटोकॉल में एक फ्लोरोसेंट रंजक को शामिल करके, पीएलजीए microspheres एक epifluorescent माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखे जा सकते हैं। स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। पीएलजीए microspheres के आकार के वितरण हालांकि आकार के वितरण भिन्न हो सकते हैं, सबसे microspheres व्यास में कम से कम 10 माइक्रोन होना होगा।arget = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। बिखरे β कोशिकाओं proliferating की Immunofluorescent दृश्य बिखरे टापू प्रसार मार्कर Ki67 (लाल) और इंसुलिन (हरा) β-कोशिकाओं proliferating को चिह्नित करने के लिए immunolabeled रहे हैं। नाभिक DAPI (नीला) के साथ लेबल रहे हैं। तीर Ki67 पॉजिटिव / इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं से संकेत मिलता है। तारों (*) undegraded microspheres संकेत मिलता है। स्केल बार 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: मात्रा और विश्लेषण की β-सेल प्रोliferation। rhCTGF-पीएलजीए microspheres के विभिन्न मात्रा के साथ इलाज किया टापू। Ki67 पॉजिटिव / इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या में स्वयं सभी नमूनों से गिना जाता है और इंसुलिन पॉजिटिव β-कोशिकाओं की कुल संख्या का एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। एक्स अक्ष प्रत्येक उपचार में rhCTGF वर्तमान के अंतिम एकाग्रता से मेल खाती है। सांख्यिकीय महत्व एक तरह से एनोवा Tukey एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद का उपयोग कर निर्धारित किया गया था। सांख्यिकीय महत्व पी ≤ 0.05 पर स्थापित किया गया था। त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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संस्कृति में β-सेल प्रसार के अध्ययन के लिए आम तौर पर कई कठिनाइयों आड़े आती है। सबसे पहले, अमर β-सेल लाइनों क्या लाइव टापू में अंतर्जात β-कोशिकाओं में पाया जाता है की तुलना में प्रसार के उच्च डिग्री की विशेषता है। इसके अतिरिक्त, इन अमर सेल लाइनों सामान्य वास्तुकला सामान्य β सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण कमी है। इन दोनों तथ्यों यह मुश्किल है, तो परिणाम अमर β-सेल लाइनों का उपयोग कर सच का आयोजन करेगा जब विवो में या पूरे टापू में परीक्षण प्राप्त निर्धारित करने के लिए बनाते हैं। हमारे वर्णित प्रोटोकॉल है, जो हौसले से पृथक बरकरार माउस टापू का उपयोग करता है, इन मुद्दों में गतिरोध उत्पन्न के रूप में आइलेट वास्तुकला बनाए रखा है और β-सेल प्रसार विवो में पाया गया कि के बराबर है।

एक महत्वपूर्ण चिंता का विषय है जब बरकरार टापू संवर्धन संभावना है कि आइलेट कोर के भीतर कोशिकाओं हाइपोक्सिया प्रेरित नेक्रोसिस से गुजरना होगा या rhCTGF को उजागर नहीं किया जाएगा। इस कारण से, एक अंतिम0.1 मिमी EGTA की एकाग्रता आइलेट वास्तुकला में खलल न डालें बिना सेल सेल संपर्कों को ढीला करने के लिए मीडिया को जोड़ा जाता है। हम पहले से प्रकाशित किया है कि अकेले EGTA के अलावा β-सेल प्रसार, शायद आइलेट कोर 12 के लिए मीडिया में पोषक तत्वों और mitogens की वृद्धि की पहुँच के कारण बढ़ा सकते हैं। EGTA के जवाब में β-सेल प्रसार में वृद्धि भी सेल सेल संपर्क खुद 13,14 में कमी के कारण हो सकता है। मीडिया इस प्रोटोकॉल में वर्णित भी घोड़े सीरम के बजाय और अधिक परंपरागत भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक है। इस प्रतिस्थापन भ्रूण गोजातीय सीरम में अपरा lactogen की उपस्थिति है, जो अपने दम पर β-सेल प्रसार को प्रोत्साहित कर सकते हैं, संभावित प्रसार परख में विश्लेषण उलझी के कारण बना है।

आइलेट कोशिकाओं को पीएलजीए microspheres (के साथ या बिना COI) के रिश्तेदार विषाक्तता का निर्धारण एमए की immunofluorescence विश्लेषण के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकताTUNEL या γ-H2AX 15,16 सहित कोशिका मृत्यु या डीएनए की क्षति के rkers। हालांकि पीएलजीए microspheres के अलावा टापू पूर्व vivo करने के लिए किसी भी स्पष्ट हानिकारक प्रभाव नहीं दिखाया गया है, उन प्रभावों microspheres छवि विश्लेषण पर हो सकता है के बारे में पता होना चाहिए। के रूप में चित्रा 3 में प्रदर्शन किया और परिणाम अनुभाग में उल्लेख किया है, undegraded microspheres immunofluorescent छवियों के भीतर काले धब्बे, और अधिक बढ़ रही है जब सांद्रता का उपयोग किया जाता दिखाई दे रहा microspheres के साथ के रूप में स्पष्ट हो सकता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वर्णित प्रोटोकॉल पृथक माउस टापू के साथ काम करने के लिए अनुरूप किया गया है। जैसे, यह यदि समान स्थिति ऐसी चूहा और मनुष्य के रूप में विकल्प जीवों से काटा टापू के साथ काम करेंगे स्पष्ट नहीं है। विशेष रूप से, काटा विभिन्न जीवों अक्सर विभिन्न इष्टतम संवर्धन की स्थिति और β-सेल प्रसार 17,18 के भिन्न डिग्री से टापू।

कई biomaterials संभावित पाली (thioketal-urethane) और पाली (प्रोपलीन सल्फाइड) 19 सहित अलग-थलग टापू, को rhCTGF प्रशासन के लिए उपलब्ध हैं। हम जानते हैं कि यह पास कई उल्लेखनीय गुणों के कारण पीएलजीए पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुना है। सबसे पहले, पीएलजीए एक अपेक्षाकृत सस्ती अभिकर्मक है और microspheres मानक उपकरण (सेंट्रीफ्यूज, homogenizer, lyophilizer) सबसे अधिक अनुसंधान संस्थानों में उपलब्ध है के साथ उत्पन्न किया जा सकता है। पीएलजीए एक कृत्रिम बहुलक इसकी biocompatibility, biodegradability, और मिश्रित रिहाई दर 20 मिलाना करने की क्षमता के कारण एफडीए को मंजूरी दी उपकरणों में सफल प्रयोग के लिए मिसाल है कि है। पीएलजीए पानी की उपस्थिति में हाइड्रोलिसिस द्वारा degrades, इस प्रक्रिया में अपनी कार्गो जारी है। पीएलजीए कणों की रासायनिक संरचना इस तरह के अनुरूप किया जा सकता है कि एक यौगिक कई सप्ताह की अवधि में इन विवो में जारी की है। पीएलजीए भी करने के लिए preclinical पशु परीक्षणों और मानव नैदानिक ​​चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है स्थानीय स्तर पर विभिन्न अंगों और Tissu को यौगिकों प्रशासनतों 21,22। अन्य हाइड्रोफोबिक पॉलिमर भी biodegradable microspheres की पीढ़ी में इस्तेमाल किया जा सकता है। इन पॉलिमर ऐसे पीएच, तापमान, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 23,24 की उपस्थिति के रूप में विशिष्ट पर्यावरण उत्तेजनाओं, का जवाब कर सकते हैं। इस प्रकार, शोधकर्ताओं ध्यान से विचार करना चाहिए जो biomaterial अपनी पढ़ाई के लिए सबसे उपयुक्त है।

किसी भी शोधकर्ता पीएलजीए, या अन्य biomaterials के उपयोग, β-सेल प्रसार पूर्व vivo अध्ययन करने के लिए unencapsulated COI की तुलना में समझाया COI के प्रभाव के बीच संभावित मतभेद के बारे में पता होना चाहिए। उदाहरण के लिए, पीएलजीए के माध्यम से rhCTGF की डिलीवरी β-सेल प्रसार प्रेरण की डिग्री की और समय बदल सकता है unencapsulated प्रोटीन के साथ उपचार की तुलना में। हमारी प्रयोगशाला में चल रही पढ़ाई वर्तमान में इन संभावित मतभेद जांच कर रहे हैं।

सुसंस्कृत टापू में β-सेल प्रसार के विश्लेषण की पहचान और मेरे लिए एक शक्तिशाली मॉडल हैβ-सेल mitogens की chanistic विश्लेषण। परख यहाँ वर्णित हम एक विस्तारित रिलीज डिलीवरी वाहन के साथ पृथक सुसंस्कृत टापू को एक COI प्रशासन के लिए एक अपेक्षाकृत जल्दी और लागत प्रभावी तरीका दिखाने का उपयोग करना। यह विशुद्ध रूप से परख विवो में β-सेल प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए अपने पहले प्रकाशित करने की क्षमता और पूर्व vivo 11 पर आधारित है ब्याज के लगभग किसी भी COI, और हमारे चुनाव के लिए लागू CTGF पर ध्यान केंद्रित करने के लिए होना चाहिए। साथ ही, इस परख मॉडल जहां टापू रहने वाले जीवों में प्रतिरोपित कर रहे हैं करने के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रभावशीलता और पीएलजीए एक वितरण पद्धति के रूप में प्रयोग की सुरक्षा को मान्य कर सकते हैं। कुल मिलाकर, वर्णित प्रोटोकॉल transplantable ऊतकों को पीएलजीए की सुरक्षा को मापने पर एक व्यापक प्रभाव के साथ सुसंस्कृत टापू को यौगिकों प्रशासन के लिए एक उपन्यास तरीका देता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer ThermoFisher Scientific O6149 For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl Sulfoxide Fisher BioReagents BP231-1 For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01 Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 Sigma-Aldrich 739960 Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 Sigma-Aldrich 341584 Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640 Thermo Scientific 11879-020 For culturing islets
Dextrose Anhydrous Fisher BioReagents 200-075-1 Supplement for islet media
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotics for islet media
Normal horse serum Jackson ImmunoResearch 008-000-121 Supplement for islet media
96-well tissue culture plate Corning 3603 For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 For spinning cells onto microscope slides
EZ Single Cytofunnel Thermo Scientific A78710020 For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BioReagents BP118-500 Used in dissociating islets
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 For fixing cells
Triton  X-100 Fisher BioReagents BP151 For permeabilizing cells
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibody abcam ab15580 For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin Dako A0564 For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152 For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig Jackson ImmunoResearch 706-175-148 For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher Scientific D1306 For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-Mount Lerner Laboratories 13800 Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System Labconco 7382020 For lyophilization of microspheres

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References

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बरकरार माउस आइलेट्स के लिए β-सेल mitogens की निरंतर प्रशासन<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; Biodegradable पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) microspheres का उपयोग
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Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).More

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).

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