Abstract
Utviklingen av biomaterialer har økt betydelig potensial for målrettet medikamentavlevering til en rekke celletyper og vev, inkludert de pankreatiske p-celler. I tillegg biomateriale partikler, hydrogeler og stillasene gir også en unik mulighet til å administrere vedvarende, til kontroller levering av legemidler p-celler i kultur og transplanterte vevet modeller. Disse teknologiene tillater studiet av kandidaten β-celle spredning faktorer ved hjelp av intakte holmer og en translatorisk relevant system. Videre bestemmelse av effektiviteten og gjennomførbarheten av kandidat faktorer for å stimulere β-celleproliferasjon i et kultursystem er kritisk før fremover til in vivo-modeller. Heri beskriver vi en fremgangsmåte for å ko-kultur intakte øyer mus med biologisk nedbrytbart forbindelsen av interesse (COI) -loaded poly (melke-ko-glykolsyre) (PLGA) mikrosfærer for det formål å vurdere virkningene av vedvarende frigivelse in situ of mitogene faktorer på β-celleproliferasjon. Denne teknikken beskriver i detalj hvordan å generere PLGA mikrosfærer som inneholder en ønsket last ved hjelp av kommersielt tilgjengelige reagenser. Mens den beskrevne teknikken bruker rekombinant human Bindevev vekstfaktor (rhCTGF) som et eksempel, kan et bredt spekter av Coi lett anvendes. I tillegg gir denne fremgangsmåten anvender 96-brønners plater for å minimalisere mengden av reagenser som er nødvendig for å vurdere β-celleproliferasjon. Denne protokollen kan lett tilpasses for å benytte alternative biomaterialer og andre endokrine cellekarakteristikker slik som celleoverlevelse og differensiering status.
Introduction
Pankreatiske p-celler er de eneste insulinproduserende celler i kroppen, og er kritisk for å opprettholde blodglukose homeostase. Mens friske mennesker har tilstrekkelig β-cellemasse og funksjon for å regulere blodsukkeret, er personer med diabetes preget av utilstrekkelig β-cellemasse og / eller funksjon 1,2. Det er blitt foreslått å indusere β-celleproliferasjon kan til slutt øke β-cellemasse og gjenopprette glukosehomeostase i individer med diabetes 3. Imidlertid er evaluering og validering av potensielle β-celle proliferative forbindelser i intakte holmer nødvendig før effektive behandlingsformer kan utvikles. Transplantasjon av avdød menneskelige holmer i personer med diabetes gjenoppretter blodsukker homeostase i noen tid, men tilgjengeligheten og suksessen til denne eksperimentelle prosedyren er hindret av mangel på menneskelige holmer tilgjengelig for transplantasjon og ved p-celledød i holmer akterer transplantasjon 4. Selv med oppdagelsen av faktorer som induserer formering av insulinproduserende celler, eksisterer det en stor utfordring fortsatt i å levere disse faktorene til relevante områder in vivo. En strategi for vedvarende lokal levering av β-celle-proliferative forbindelser som er poly (melkesyre-ko-glykol) syre (PLGA). PLGA har en historie med bruk i FDA godkjente stoffet levering produkter på grunn av sin høye sikkerhet, nedbrytbarhet, og forlenget frigjøring kinetikk 5. Nærmere bestemt er PLGA en kopolymer av laktid og glykolid som degraderer via hydrolyse med vann, enten in vivo eller i kultur til melkesyre og glykolsyre, som er naturlig forekommende metabolitter i kroppen. Den innkapslede medikamentforbindelse kan frigjøres i omgivelsene både diffusjon og / eller nedbrytningsstyrt utløsermekanisme. Innkapsling av COI gir beskyttelse mot enzymatisk nedbrytning, noe som forbedrer biotilgjengeligheten av reagenset i forhold til unencapsulated COI 5. Vi foreslår at PLGA mikrosfærer kan anvendes for å administrere kandidatforbindelser til intakte holmer i kultur, og til slutt in vivo. Teste effekten av PLGA å administrere β-celle mitogener til holmer ex vivo er kritisk før transplantasjon protokoller er utforsket.
For tiden er det ingen teknikk for å måle β-celleproliferasjon i levende dyr. Eksperimenter for å vurdere effektiviteten til potensielle proliferative forbindelser in vivo krever derfor at administrering av disse forbindelsene til levende dyr, med etterfølgende disseksjon og prosessering av pankreata for immunolabeling. Slike protokoller er kostbare og arbeidskrevende, og krever at den forbindelse som skal administreres systemisk, uten noen garanti for at de vil nå holmene. Omvendt, flere udødeliggjorte β-cellelinjer er tilgjengelige for studiet av insulinproduserende celler i kultur, men disse cellelinjene mangler holmen arkitektur og miljøvennt funnet i levende organismer 6. Udødeliggjorte β-cellelinjer er også karakterisert ved å ha et mye høyere grad av replikasjon enn endogene P-celler in vivo, og således kompliserer analyse av forbindelser som induserer proliferasjon. I denne studien beskriver vi en protokoll som bruker intakte holmer isolert fra voksne mus. I motsetning til β-cellelinjer, intakte øyer beholde normal holme arkitektur. På samme måte, i motsetning til eksperimenter utført in vivo, administrering av proliferative forbindelser direkte til dyrkede intakte øyer reduserer mengden av reagenser som er nødvendig for å nøyaktig måle β-celleproliferasjon betydelig.
Studien anvender PLGA å administrere en COI, i dette eksempel, rekombinant, humant Connective Tissue Growth Factor (rhCTGF). Metoden er beskrevet her overfører en betydelig fordel i forhold til forvaltning av rå forbindelsen til dyrkede holmer som gjør det mulig for en kontinuerlig frigjøring av forbindelsen til the medier. Spesielt, kan denne analysen modifiseres for å administrere et bredt utvalg av proteiner og antistoffer av interesse å intakte øyer. Effekter på andre endokrine celletyper, inkludert a-celler, kan også bli analysert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med Vanderbilt Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Merking COI med fluorophore (valgfritt)
- Velge et fluorescerende fargestoff som vil reagere med et fritt primært amin (for eksempel, på et proteiner), slik som suksinimidyl-ester eller fluorescein-derivater, for å visualisere mikrosfære last. Oppløs 8x molart overskudd (i forhold til mol COI) av fluoroforen i 200 ul dimetylsulfoksid (DMSO).
- Gjensuspender 50 mg Coi opp til et sluttvolum på 800 pl i en bæreroppløsning (endelig konsentrasjon på 62,5 ng / mL). Kjøretøyet løsning vil variere avhengig av kilden til COI.
MERK: Typisk kjøretøy løsninger omfatter fosfatbufret saltvann (PBS) eller DMSO. - Legg alle fluoroforen / DMSO løsning fra trinn 1.1 og resuspender COI. Vortex natten ved 4 ° C. Alternativt vortex reaksjonsblandingen ved romtemperatur(RT) i 4 timer.
- Etter merkingsreaksjonen, fjerne overflødig fluorofor ved hjelp av en avsaltingskolonne.
- Drenere lagringsbuffer fra avsaltingskolonne og skyll med 16 ml avionisert vann. Kast all flyt gjennom.
- Tilsett fluorescensmerkede COI til avsalting kolonnen. Elueres med 1,2 ml avionisert vann og samle strømningen gjennom.
- Gjenta trinn eluering i ytterligere fire ganger, hver gang å tilsette 1,2 ml av deionisert vann og oppsamling av strømningen gjennom som en separat prøve.
- Fryse all innsamlet strømmen gjennom prøvene ved -80 ° C og lyofilisere i henhold til produsentens instruksjoner for 24 timer.
2. COI belastede mikrokulefremstillingen via vann-i-olje-i-vann-emulsjon Løsningsmiddel-fordampningsmetoden
- Tilsett 1 mg av fluorescensmerkede Coi til 100 pl deionisert vann for å danne den første vannfase (W1).
- Løs opp 65 mg av poly (melke-ko-glykol ACId) (50:50 laktid: glykolid, molekylvekt 54 000 - 69 000) i 750 ul diklormetan i et mikrosentrifugerør. Ultrasonicate for 10 - 30 sek (160 W) for å løse opp PLGA. Dette danner oljefasen (O).
- Legg alle W1 fase generert i trinn 2.1 til O fase i en drop-klok måte. Emulgere ved hjelp av en håndholdt homogenisator ved 20 000 rpm i 30 sekunder for å danne den W1 / O-fase.
- Legge til alle de W1 / O-fase i en dråpevis måte, til 15 ml av en 1% (vekt / volum) vandig poly (vinylalkohol) (PVA) -løsning og emulgere ved hjelp av en håndholdt homogenisator ved 20 000 rpm i 30 sek .
- Overfør all emulsjonen som genereres i trinn 2,4 i en 200 ml rundbunnet kolbe og utsatt for en 635 mm Hg vakuum ved anvendelse av en rotasjonsfordamper i 1 time for å fjerne oppløsningsmidlet, og å generere den vandige fase.
- Alikvote 1 ml av den vandige fase som genereres i trinn 2.5 til fjorten mikrosentrifugerør. Sentrifugering av den vandige oppløsning i mikrosentrifugerør ved 7500x g i 8 min.
NB: I dette trinnet mikrokulene er til stede i den gjenværende vandige oppløsning og konsentreres til bunnen av mikrosentrifugerør. - Fjern forsiktig 900 ul av vandig oppløsning av de mikrosentrifugerør med en mikropipette, pipettering slik som å ikke forstyrre mikrokulene på bunnen av mikrosentrifugerør.
- Vask mikrokuler av overskytende PVA ved å tilsette 1 ml deionisert vann til hver mikrosentrifugerør. Sentrifuger ved 7500 x g i 8 minutter, og igjen forsiktig fjerne 900 pl av vandig oppløsning av de mikrosentrifugerør med en mikropipette, pipettering slik som å ikke forstyrre mikrokulene på bunnen av mikrosentrifugerør.
MERK: De resterende 100 mikroliter vandig oppløsning inneholder de genererte mikrosfærer.
- Vask mikrokuler av overskytende PVA ved å tilsette 1 ml deionisert vann til hver mikrosentrifugerør. Sentrifuger ved 7500 x g i 8 minutter, og igjen forsiktig fjerne 900 pl av vandig oppløsning av de mikrosentrifugerør med en mikropipette, pipettering slik som å ikke forstyrre mikrokulene på bunnen av mikrosentrifugerør.
- Fryse den vandige oppløsningen mikrosfære som genereres i trinn 2.7 ved -80 ° C.
- Lyofilisere sfærer med en lyofiliseringsanordning i henhold til produsentensinstruksjoner og oppbevar ved -20 ° C.
MERK: Mål lasting effektiviteten av COI ved fullstendig oppløsning av PLGA mikrokuler og bestemmelse av proteinkonsentrasjonen i forhold til en standardkurve av den frie proteinet 7. - Som en negativ kontroll, å generere en gruppe av "tomt" mikrokuler (heretter referert til som kontroll-mikrokuler).
MERK: generering av kontroll-mikrokuler er identisk til genereringen av hydrofile COI-ladede mikrokuler, uten COI tilsetning til 800 ul av kjøretøyet oppløsningen i trinn 1.2. Kamp kontroll partikler i massekonsentrasjonen av PLGA forhold til COI-lastet PLGA mikrosfærer for β-celle mitogen analysen.
3. Utarbeidelse av Islet Kultur Media og Pre-analysen Media
- Fremstille 200 ml media for dyrking av intakte øyer mus: RPMI 1640 medium supplert med 11 mM glukose, 10% hesteserum, 100 U / ml penicillin G og 100 ug / ml streptomycin (heretter referert til som den erla kultur media).
NOTE 1: I motsetning til føtalt bovint serum (FBS), mangler hesteserum placenta laktogen, en induktor av β-celle spredning, noe som forundrer analyse i spredning analysen.
NOTE 2: Som PLGA-mikrokulene ikke er sterilisert før bruk, er tilsetning av antibiotika til kulturmediet avgjørende for å unngå mikrobiologisk forurensning. - Fjern 25 ml holme kulturmedier med en elektronisk pipette og plasser i en 50 ml konisk tube. Supplere 25 ml holmen kulturmedium i det 50 ml konisk rør med en endelig konsentrasjon på 0,2 mM EGTA for å danne pre-analysen media.
MERK: Tilsetning av EGTA mildt løsner celle-celle kontakter i holmer uten å endre holme arkitektur. Dette bidrar til å sikre COI kan nå de indre cellene i holmen og bidrar til å hindre nekrose av sentrale holmen.
4. Dyrking av intakte Muse holmer
- Isoler intakte holmer fra et forhåndsvalgt stamme, kjønn age, og genotypen til mus etter en rutine kollagenase fordøyelse i bukspyttkjertelen 8,9. Pool sammen holmer mellom som prøver.
- Alikvoter 40 holmer i én brønn av en 96-brønners vevkulturplate i 200 mL av holmen kulturmedier. Visuelt størrelse-kamp holmer per brønn (en presis vurdering av holmen ekvivalens (IEQ) mellom prøvene er ikke nødvendig). Fylle tomme brønner i umiddelbar nærhet av brønner med holmer med 200 ul sterilt vann for å gi en fordampning buffer. Kultur holmer i medium over natten ved 37 ° C under en atmosfære av 95% luft og 5% CO2.
5. Re-suspensjon av COI-lastet og kontroll PLGA mikrosfære
- Etter over natten holme utvinning, resuspender mikrokuler ved å tilsette pre-assay media til en alikvot av lyofiliserte COI-lastede PLGA mikrokuler, slik at sluttkonsentrasjonen av Coi i mikrosentrifugerør er 10 ng / mL (mengden av COI til stede i en gitt mengde de genererte mikroerpheres ble bestemt i trinn 2.9). Sonikere de resuspenderte COI-ladede mikrokuler i et is-vannbad i 10 minutter ved 160 W med 10 sek lange pulser ved 4 ° C.
- Resuspender kontroll PLGA-mikrokuler ved tilsetning av samme volum av pre-assay media til en lik massen av lyofiliserte kontroll PLGA mikrokuler. Sonikere de resuspenderte kontroll PLGA mikrokuler i et is-vannbad i 10 minutter ved 160 W med 10 sek lange pulser ved 4 ° C.
- Visuelt bekrefte sfærer spres ved å pipettere 2 mL av resuspendert sfærer mellom to dekkglass. Visualiser sfærer med en 40X objektiv på en epifluorescence eller lysfelt mikroskop.
- Dersom betydelig aggregering av mikrosfærer er fortsatt synlig, sonicate i et is-vann-bad i ytterligere 10 minutter ved 160 W med 10 sek lange pulser ved 4 ° C og gjenta visualisering av resuspenderte mikrokuler.
6. Behandling av holmer med COI-lastet eller Kontroll PLGA mikrosfære </ P>
- For hver brønn som skal behandles med COI-ladede mikrokuler, fremstille analysemateriale ved fortynning av 10 ng / ul av de resuspenderte COI mikrokuler med pre-assay media til et sluttvolum på 100 pl og en forutbestemt sluttkonsentrasjon.
NB: Den optimale sluttkonsentrasjonen av protein vil variere for hver COI benyttet i denne analysen. Ideelt sett er en rekke sluttkonsentrasjoner testet. - For hver brønn å bli brukt som en kontroll, fremstille kontrollanalyse media ved fortynning av de resuspenderte styre PLGA mikrokuler som genereres i trinn 5.2 med den samme fortynning volum anvendt for å fortynne COI-ladede mikrokuler i trinn 6.1.
MERK: Øyer ble behandlet i kontroll analysen media vil fungere som en negativ kontroll for å muliggjøre deteksjon av noen effekt de tomme sfærer kan ha på de eksperimentelle resultatene. - Fjern forsiktig 100 ul holme kulturmedier fra hver brønn med en mikropipette, slik at ingen bitene løsner fra brønnene. Tilsett 100 μl av analyse medium eller 100 pl av kontrollanalysen media til hver brønn.
- Inkuber holmer ved 37 ° C under en atmosfære av 95% luft og 5% CO2 i tre dager.
7. Regulerende Intakte holmer ut mot objektglass
- Etter tre dager, kan du bruke en mikropipette å forsiktig fjerne og kast analysemateriale fra alle brønnene for ikke å løsne holmer. Tilsett 200 ul PBS for å holmer å vaske dem av analysemediet. Fjern forsiktig og kast PBS med en mikropipette og vask forsiktig holmer igjen med en ekstra 200 mL PBS.
- Fjern og kast PBS med en mikropipette og tilsett 100 ul av 0,025% trypsin, 2 mM EDTA-løsning. Inkuber ved RT i 3 min. Pipette holmer i trypsin-EDTA-løsning opp og ned hver 2 min til holmer er visuelt bekreftet å være spredt i enkeltceller (merk at noen små klumper av celler kan fortsatt være til stede) ved hjelp av et lysmikroskop. Overfør hele volumet av hver brønn individueltly i labeled- mikrosentrifugerør.
- Tilsett 400 ul av holmen kulturmedium til hvert mikrosentrifugerør for å stoppe trypsin-mediert celle dissosiasjon.
- Sentrifugere prøven 5 minutter ved 100 xg ved 4 ° C for å pelletere øyceller til bunnen av mikrosentrifugerør.
- Fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en mikropipette, og resuspender pellet i 200 mL frisk holme kulturmedier.
- Ved hjelp av en CYTO-sentrifuge, sentrifuger dissosiert holmer ved 140 xg i 3 min på ladede objektglass.
- Air tørre lysbilder på RT i 10 min, deretter tegne en boks rundt dissosierte holmer med en hydrofob tusjpenn.
- Feste cellene med 75 ul 4% paraformaldehyd (PFA) ved RT i 10 min. Fjern 4% PFA og vask forsiktig celler i 75 mL PBS to ganger. Etter vasking, permeabilisere cellene med 75 ul 0,2% Triton X-100 i PBS i 10 min. Deretter vaske celler med 75 mL PBS.
Forsiktig: PFA er kjent for å være allergifremkallende, kreftfremkallende, og giftig. 8. Immunofluorescensanalyse Merking av Spaltet holmer for Insulin og Cell Proliferation Marker, Ki67 - Forbered et fuktighetskammer ved å plassere to våte papirhåndklær i bunnen av en 100 lysbilde kapasitet objektglass boks.
- Place glir flate ned (celler som vender opp) i fuktkammer. Forbered prøvene for merking av aspirering av PBS fra den foregående vasketrinn ved anvendelse av en mikropipette og tilsetning av 75 ul blokkeringsløsning (5% Normal esel Serum (NDS) i PBS) til hvert lysbilde for å blokkere ikke-spesifikk binding av antistoffer mot prøvene. Inkuber objektglass i blokkeringsløsning i 1 time ved RT.
- Forsiktig aspiratet blokkeringsløsning ved anvendelse av en mikropipette og tilsett 75 ul av primær antistoffløsning inneholdende marsvin anti-insulin og kanin-anti-Ki67-antistoffer, ble fortynnet 1 ug / ml i 5% NDS i PBS. Inkuber ved RT i 1 time.
MERK: Alternative markører for celleproliferasjon omfatter prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) og fosfohistone H3 (PH3), - Forsiktig aspirere primær antistoffløsning ved anvendelse av en mikropipette og skylle cellene med 75 ul PBS. Aspirer PBS ved hjelp av en mikropipette og skylle cellene to ganger, hver gang med 75 mL PBS. Inkuber hver prøve med 75 ul anti-marsvin Cy5 sekundært antistoff og anti-kanin-Cy3 sekundært antistoff fortynnet til 2 ug / ml i blokkeringsløsning i 1 time ved RT.
MERK: Ikke bruk sekundære antistoffer merket med samme eller spektralt overlapp fluorophore som allerede ble brukt til å merke sfærer. - Aspirer sekundært antistoff oppløsning ved anvendelse av en mikropipette og inkuber i 75 ul av 300 nM DAPI i PBS i 3 minutter ved romtemperatur. Aspirer DAPI ved hjelp av en mikropipette og skylling i avionisert vann i 5 min.
- Forsiktig aspirer vann fra prøvene ved hjelp av en mikropipette. Spot en dråpe (omtrent 100 ul) av hurtigtørkende monteringsløsning som inneholder antifade reagens på et dekkglass. Snu objektglass prøvesiden ned, onFor monteringsløsning. Trykk forsiktig dekk mot raset ved hjelp av en pipette tips for å fjerne bobler og tørk vekk overflødig væske med en myk vev. Tillat Dekk å tørke over natten ved RT.
- Bruk en epifluorescence mikroskop med et vedlagt kamera for bildeopptak. For hver fluorophore, bestemme optimal eksponeringstiden (typisk 20 ms for DAPI, 40 - 80 ms for insulin, og 250 msek for Ki67). Sørg image oppkjøpet parametere er lik for alle prøvene.
- For hver prøve manuelt telle 3000 insulin-positive celler og av disse telle hvor mange er også Ki67-positive. telle bare insulin-positive celler som har en veldefinert og klart synlig kjerne. Beregn prosentandelen av prolifererende p-celler for hver prøve ved å dividere antall Ki67-positive / insulin-positive celler ved det totale antall insulin-positive celler og multiplisere med 100.
- etter determining andelen av prolifererende p-celler for hver prøve, å bestemme om en statistisk signifikant forskjell i β-celleproliferasjon eksisterer mellom kontroll og eksperimentelle prøver ved å analysere resultatene med en enveis ANOVA ved å bruke kommersielt tilgjengelig statistisk programvare.
9. Image Acquisition og analyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 er en visuell representasjon av mikrokulene som genereres ved hjelp av ovennevnte protokoll. Protokollen er beskrevet her gir rhCTGF-ladede mikrokuler av forskjellig størrelse. Den største fraksjonen av mikrosfærer vil være mellom 1 og 10 um i diameter, selv om noen mikrokuler kan være større (figur 2). Om ønsket kan mikrosfærestørrelsen være innstilt og optimaliseres basert på fabrikasjonsparametre slik som homogenisering hastighet og tid, overflateaktivt middel-konsentrasjon som brukes, og relative volumer av hver vann / olje / vann-fasen 10.
Etter spredning av intakte øyer som ble behandlet med PLGA mikrokuler og påfølgende immunolabeling, er det vanlig å se regioner av prøven uten noen form for merking i mellom cellene (figur 3). Mens mesteparten av mikrokulene som fremdeles er intakt etter dyrkningsbehandlingsperioden erfjernet under vasketrinnet, noe forbli etter at bitene spinnes på objektglassene. Disse mikrosfærer føre til hull-lignende strukturer visualisert under bildebehandling. Disse gjenværende mikrokuler vanligvis ikke forstyrrer påfølgende kvantifisering.
Etter avbildning, kan prosentandelen av Ki67-positive / insulin-positive celler kvantifiseres ved manuelt å telle det totale antall merkede celler, eller ved hjelp av programvare for bildeanalyse. Tidligere har man vist at rekombinant, humant Connective Tissue Growth Factor (rhCTGF) kan stimulere mus β-celleproliferasjon i intakte øyer ex vivo 11. Ved hjelp av den nevnte protokoll, genererte vi PLGA mikrosfærer innehold rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Behandling av intakte øyer med rhCTGF-PLGA mikrokuler i 3 dager resulterte i en tilsvarende økning i β-celle-proliferasjon som tidligere rapportert med den rå protein, noe som viser at proteinet ikke lo SE noen funksjonalitet i løpet av mikrosfære generasjon (figur 4).
Fig. 1: visuell representasjon av PLGA-mikrokuler Ved å innlemme et fluorescerende fargestoff i produksjons-protokollen, kan PLGA mikrosfærer bli visualisert ved hjelp av en epifluorescent mikroskop. Scale bar representerer 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Størrelsesfordeling av PLGA-mikrokuler Selv om størrelsesfordelingen kan variere, vil de fleste mikrokuler være mindre enn 10 mikrometer i diameter.Arget = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Immunofluorescent Visualisering av dispergert Former p-celler Dispergert Øycellene immunolabeled for proliferasjon markør for å markere formerende p-celler Ki67 (rød) og insulin (grønn). Kjerner er merket med DAPI (blå). Piler indikerer Ki67-positive / insulin-positive celler. Stjerne (*) indikerer nedbrutt sfærer. Scale bar representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Kvantifisering og analyse av β-celle-Proproliferation. holmer behandles med forskjellige mengder rhCTGF-PLGA mikrosfærer. Antallet Ki67-positive / insulin-positive celler ble tellet manuelt fra alle prøver og uttrykt som en prosentandel av det totale antall insulin-positive p-celler. X-aksen svarer til den endelige konsentrasjonen av rhCTGF til stede i hver behandling. Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av en enveis ANOVA etterfulgt av Tukey multiple sammenligningstest. Statistisk signifikans ble satt til p ≤ 0,05. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studiet av β-celleproliferasjon i kultur blir vanligvis hemmet av en rekke vanskeligheter. Først blir udødeliggjorte β-cellelinjer, karakterisert ved høyere grad av spredning enn det som er funnet i endogene P-celler i levende øyer. I tillegg er disse udødeliggjorte cellelinjer som mangler den vanlige arkitekturen kritisk for normal β-cellefunksjon. Disse to fakta gjør det vanskelig å avgjøre om resultatene oppnådd ved bruk av udødelig β-cellelinjer vil holde sant når testet in vivo eller i hele holmer. Vår beskrevne protokoll som bruker ferskt isolerte mus intakte øyer, omgår disse problemene som islet arkitekturen opprettholdes og β-celleproliferasjon er sammenlignbar med den som finnes in vivo.
En vesentlig bekymring når dyrkning intakte øyer er det mulighet for at celler i holmen kjernen vil gjennomgå hypoksi-indusert nekrose eller vil ikke bli utsatt for rhCTGF. Av denne grunn, er en endeligkonsentrasjon på 0,1 mM EGTA legges til media for å løsne celle-celle kontakter uten å forstyrre holme arkitektur. Vi har tidligere publisert at tilsetningen av EGTA alene kan øke β-celleproliferasjon, antagelig på grunn av økt tilgang på næringsstoffer og mitogener i mediene til holmen kjernen 12. Økningen i β-celleproliferasjon som respons på EGTA kan også være på grunn av reduksjon i celle-cellekontakt seg 13,14. Mediene som beskrives i denne protokollen er også supplert med hesteserum i stedet for den mer tradisjonelle føtalt bovint serum. Denne substitusjon er gjort på grunn av tilstedeværelsen av placental laktogen i føtalt bovint serum, som kan stimulere β-celle-proliferasjon på egen hånd, noe som kan kompliserer analyse i proliferasjonsanalyse.
Bestemmelse av den relative toksisitet av PLGA mikrokuler (med eller uten den COI) til øyen celler kan bli vurdert ved immunofluorescens-analyse av markers av celledød eller DNA-skader, inkludert TUNEL eller γ-H2AX 15,16. Selv tillegg av PLGA mikrosfærer ikke har vist noen åpenbare skadelige effekter på holmer ex vivo, bør brukerne være klar over effekten mikrokulene kan ha på bildeanalyse. Som vist i figur 3 og nevnt i resultatdelen, kan unedbrutte sfærer være tydelig som mørke flekker i Immunofluorescent bilder, med flere mikrosfærer som vises når økende konsentrasjoner blir utnyttet.
Det bør bemerkes at den beskrevne protokollen er tilpasset til å fungere med isolerte mus holmer. Som sådan, er det uklart om identiske forhold vil samarbeide med holmer høstet fra alternative organismer, slik som rotter og mennesker. Spesielt, holmer høstes fra ulike organismer har ofte forskjellige optimale dyrkningsforhold og ulik grad av β-celle spredning 17,18.
Tallrike biomaterials er potensielt tilgjengelig for å administrere rhCTGF til isolerte øyer, inkludert poly (thioketal-uretan) og poly (propylen sulfid) 19. Vi valgte å fokusere på PLGA grunn av flere kjente kvaliteter som det har. For det første er PLGA en forholdsvis rimelige reagens og mikrokulene kan genereres med standard utstyr (sentrifuge, homogenisator, lyofiliseringsanordning) tilgjengelig på de fleste forskningsinstitusjoner. PLGA er en kunstig polymer som har presedens for vellykket bruk i FDA-godkjente enheter på grunn av dets biokompatibilitet, biodegraderbarhet, og dens evne til å modulere forbindelse frigjøringshastigheter 20. PLGA nedbrytes ved hydrolyse i nærvær av vann, og avgir sin last i prosessen. Den kjemiske sammensetningen av PLGA-partikler som kan skreddersys slik at en forbindelse blir frigjort in vivo over en periode på flere uker. PLGA har også blitt brukt i prekliniske dyreforsøk og kliniske behandlinger til lokalt administrere forbindelser til ulike organer og tissues 21,22. Andre hydrofobe polymerer kan også brukes ved genereringen av biologisk nedbrytbare mikrokuler. Disse polymerer kan reagere på bestemte miljømessige stimuli, slik som pH, temperatur, og nærværet av reaktive oksygenforbindelser 23,24. Derfor bør forskerne nøye vurdere hvilke biomateriale er mest hensiktsmessig for sine studier.
Enhver forsker utnytte PLGA, eller andre biomaterialer, for å studere β-celle spredning ex vivo bør være oppmerksom på mulige forskjeller mellom effektene av innkapslet COI sammenlignet med innkapslet COI. For eksempel, kan levering av rhCTGF via PLGA endre graden av og tidspunktet for β-celleproliferasjon induksjon sammenlignet med behandling med ikke-innkapslet protein. Pågående studier i laboratoriet vårt er for tiden undersøker disse potensielle forskjeller.
Analysen av β-celleproliferasjon i dyrkede øyer er et kraftig modell for identifisering og megchanistic analyse av β-celle-mitogener. Ved hjelp av den analysen som er beskrevet her vi vise en relativt rask og kostnadseffektiv metode for administrering av et COI til isolerte dyrkede øyer med en forlenget frigivelse levering kjøretøy. Denne analysen bør være aktuelt for nesten alle COI av interesse, og vårt valg å fokusere på CTGF er utelukkende basert på sin tidligere utgitt evne til å stimulere β-celle spredning in vivo og ex vivo 11. I tillegg kan denne analysen validere effektiviteten og sikkerheten ved bruk av PLGA som leveringsmåte før fremme til modeller hvor holmer er transplantert i levende organismer. Samlet sett gir den beskrevne protokollen en ny måte å administrere forbindelser til kultur holmer med en bredere betydning for måling av sikkerheten til PLGA til transplant vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
