Abstract
O desenvolvimento de biomateriais aumentou significativamente o potencial para a entrega de drogas alvo para uma variedade de tipos de células e de tecidos, incluindo as células beta pancreáticas. Além disso, biomateriais partículas, hidrogéis, e andaimes também oferecem uma oportunidade única para administrar sustentada, a entrega de drogas controlável a p-células em cultura e em modelos de tecidos transplantados. Estas tecnologias permitem o estudo de fatores de proliferação de células β candidato usando ilhotas intactas e um sistema de translação relevante. Além disso, determinar a eficácia ea viabilidade de fatores candidatos para estimular a proliferação de células β em um sistema de cultura é fundamental antes de avançar para modelos in vivo. Aqui, nós descrevemos um método para co-cultura ilhotas intactas rato com o composto biodegradável de interesse (COI) poli -loaded (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) com a finalidade de avaliar os efeitos das sustentada in situ release of factores mitogénicos sobre a proliferação de células β. Esta técnica descreve em detalhe como gerar microesferas de PLGA contendo uma carga desejado, utilizando reagentes disponíveis comercialmente. Embora a técnica descrita utiliza factor de crescimento humano recombinante conjuntivo tecido (rhCTGF) como um exemplo, pode ser prontamente utilizada uma ampla variedade de COI. Além disso, este método utiliza placas de 96 poços para minimizar a quantidade de reagentes necessários para avaliar a proliferação de células β. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar biomateriais alternativos e outras características da célula endócrina, tais como a sobrevivência de células e estado de diferenciação.
Introduction
células beta pancreáticas são as únicas células produtoras de insulina no corpo e são essenciais para manter a homeostase da glicose do sangue. Quando os indivíduos saudáveis possuem massa suficiente de células β e funcionar para regular adequadamente a glicose no sangue, indivíduos com diabetes são caracterizados pela insuficiente massa de células β e / ou função de 1,2. Foi proposto que a indução da proliferação de células β em última instância pode aumentar a massa de células β e restaurar a homeostase de glucose em indivíduos com diabetes 3. No entanto, é necessária a avaliação e validação de potenciais compostos de proliferação de células β em ilhotas intactas antes de terapias eficazes podem ser desenvolvidas. O transplante de ilhotas humanas de cadáveres em indivíduos com diabetes restaura a homeostase da glicose no sangue durante algum tempo, mas a disponibilidade e sucesso deste procedimento experimental é dificultada pela escassez de ilhotas humanos disponíveis para transplante e pela morte das células beta nas ilhotas rétransplante er 4. Mesmo com a descoberta de factores que induzem a multiplicação das células produtoras de insulina, um grande desafio ainda existe no fornecimento destes factores a locais relevantes in vivo. Uma estratégia para a entrega local sustentada de compostos proliferativas de células β é ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tem uma história de uso na FDA aprovou produtos de entrega de drogas devido à sua alta segurança, biodegradabilidade, e cinética de libertação prolongada 5. Especificamente, é um copolímero de PLGA de lactido e glicolido que degrada por meio de hidrólise com água in vivo ou em cultura em ácido láctico e ácido glicólico, que são metabolitos que ocorrem naturalmente no corpo. O composto de fármaco encapsulado possa ser libertado no ambiente circundante por ambos difusão e / ou mecanismos de libertação controlada por degradação. A encapsulação de COI proporciona protecção contra a degradação enzimática, melhorar a biodisponibilidade do reagente em relação ao unencapsulated COI 5. Sugerimos que as microesferas de PLGA podem ser usadas para administrar compostos candidatos para ilhotas intactas em cultura, e, finalmente, in vivo. Testar a eficácia de PLGA para administrar agentes mitogénicos de células β para ilhotas ex vivo é crítico antes de protocolos de transplante são exploradas.
Actualmente, não existe uma técnica para medir a proliferação de células β em animais vivos. Experimentos para avaliar a eficácia de compostos potenciais de proliferação in vivo, portanto, requerem administração destes compostos a animais vivos, com dissecção posterior e processamento de pancreata para imunomarcação. Tais protocolos são caros e laborioso, e requer o composto a ser administrada sistemicamente, sem qualquer garantia de que eles vão atingir as ilhotas. Por outro lado, várias linhas de células imortalizadas β estão disponíveis para o estudo de células produtoras de insulina em cultura, mas estas linhas de células têm a arquitectura dos ilhéus e ENVIRONMENt encontrada em organismos vivendo 6. Linhas de células imortalizadas β são também caracterizados como tendo um grau muito mais elevado de replicação de células beta endógeno in vivo, complicando, assim, a análise dos compostos que induzem a proliferação. Neste estudo, descrevemos um protocolo que utiliza ilhotas intactas isoladas a partir de ratinhos adultos. Ao contrário de linhas de células-β, ilhotas intactas reter arquitetura normal das ilhotas. Do mesmo modo, em contraste com experiências realizadas in vivo, a administração de compostos proliferativas directamente para ilhotas intactas em cultura reduz significativamente a quantidade de reagentes que é necessário para medir com precisão a proliferação de células β.
O estudo actual utiliza PLGA para administrar um COI, neste exemplo, crescimento de tecido conectivo do Factor humano recombinante (rhCTGF). O método aqui descrito confere uma vantagem significativa sobre a administração do composto em bruto de ilhotas de cultura, uma vez que permite uma libertação contínua do composto em the meios de comunicação. Notavelmente, este ensaio pode ser modificado para administrar uma ampla variedade de proteínas e anticorpos de interesse para ilhotas intactas. Efeitos sobre outros tipos de células endócrinas, incluindo células-ct, também podem ser analisados.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados e executados em conformidade com o Comité de Cuidados e Uso do Vanderbilt Institucional Animal.
1. Rotulagem COI com Fluoróforo (Opcional)
- Escolha um corante fluorescente que irá reagir com uma amina primária livre (por exemplo, numa proteína), tal como ésteres de succinimidilo ou derivados de fluoresceína, para visualizar microesfera de carga. Dissolve-se um excesso molar de 8X (em relação a moles de COI) de fluoróforo em 200 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Ressuspender 50 mg de COI até um volume final de 800 ul de uma solução de veículo (concentração final de 62,5 ng / ul). A solução de veículo irá variar dependendo da fonte do COI.
NOTA: veículo típico incluem soluções tampão de fosfatos salino (PBS) ou DMSO. - Adicionar toda a solução de fluoróforo / DMSO do passo 1.1 e ressuspender o COI. Vortex durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, vortex a mistura de reacção à temperatura ambiente(TA) durante 4 h.
- Após a reacção de marcação, remover o excesso de fluoróforo usando uma coluna de dessalinização.
- Escorra tampão de armazenamento da coluna de dessalinização e lavar com 16 ml de água deionizada. Descarte todo o fluxo através.
- Adicionar o COI marcado de forma fluorescente para a coluna de dessalinização. Elui-se com 1,2 ml de água desionizada e recolher o fluxo através.
- Repetir passo de eluição mais quatro vezes, cada vez que a adição de 1,2 ml de água desionizada e recolhendo o fluxo através de uma amostra em separado.
- Congelar todo o fluxo coletados através de amostras a -80 ° C e liofilizar de acordo com as instruções do fabricante para 24 horas.
2. COI-carregado Preparação de Microesferas através da água-água-em óleo-em-emulsão usada solvente método de evaporação
- Adicionar 1 mg de COI marcado por fluorescência a 100 ul de água desionizada para formar a primeira fase de água (W1).
- Dissolve-se 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactido: glicolido de peso molecular 54000 - 69000) em 750 mL de diclorometano num tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate para 10 - 30 segundos (a 160 W) para dissolver completamente o PLGA. Isto forma a fase de óleo (o).
- Adicionar toda a fase W1 gerado no passo 2.1 para a fase S de uma forma gota a gota. Emulsionar usando um homogeneizador de mão a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar a fase W1 / S.
- Adicionar toda a fase W1 / S de uma maneira gota a gota a 15 ml de um 1% (peso / volume) de poli aquoso (álcool vinílico) de solução (PVA) e emulsionar usando um homogeneizador de mão a 20.000 rpm durante 30 seg .
- Transferir todo da emulsão gerado no passo 2.4 para um 200 ml frasco de fundo redondo e sob um vácuo de 635 milímetros de Hg utilizando um evaporador rotativo durante 1 hora para remover o solvente e gerar a fase aquosa.
- Alíquotas de 1 ml da fase aquosa gerado no passo 2.5 a catorze tubos de microcentrífuga. A centrifugação da solução aquosa no interior dos tubos de microcentrífuga a 7500xg durante 8 minutos.
NOTA: Nesta etapa, as microesferas estão presentes na solução aquosa restante e concentrou-se para o fundo do tubo de microcentrífuga. - Cuidadosamente remover 900 ml de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga.
- Lavam-se as microesferas de PVA em excesso por adição de 1 ml de água desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 x g durante 8 min, e remover de novo cuidadosamente 900 ul de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga.
NOTA: A solução aquosa restante 100 ul contém as microesferas gerados.
- Lavam-se as microesferas de PVA em excesso por adição de 1 ml de água desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 x g durante 8 min, e remover de novo cuidadosamente 900 ul de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga.
- Congelar a solução aquosa de microesferas gerado no passo 2.7 a -80 ° C.
- microesferas liofilizar num liofilizador utilizando de acordo com o fabricante doinstruções e armazenar a -20 ° C.
NOTA: medir a eficiência de carregamento do COI dissolvendo completamente as microesferas de PLGA e a determinação da concentração de proteínas em relação a uma curva padrão de proteína livre 7. - Como controlo negativo, gerar um lote de microesferas "em branco" (doravante referidas como microesferas de controle).
NOTA: A geração de microesferas de controlo é idêntica à geração de microsferas hidrófilas COI-carregados, sem adição de ICO a 800 ul da solução de veículo no passo 1.2. partículas de controlo de jogo em concentração em massa de PLGA em relação ao microesferas de PLGA COI-carregados para o ensaio mitogénio de células-β.
3. Preparação de Ilhota Meios de Cultura e Mídia Pré-ensaio
- Preparar 200 ml de meio de cultura de ilhotas intactas rato: meio RPMI 1640 suplementado com glucose 11 mM, soro de cavalo a 10%, 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina (daqui em diante referido como estádeixe meios de cultura).
NOTA 1: Ao contrário de soro fetal de bovino (FBS), soro de cavalo carece lactogénio placentário, um indutor de proliferação de células β, que confunde análise no ensaio de proliferação.
NOTA 2: À medida que as microesferas de PLGA não são esterilizados antes da utilização, a adição de antibióticos ao meio de cultura é crucial para evitar a contaminação microbiológica. - Retirar 25 ml de meio de cultura ilhéu com uma pipeta eletrônico e coloque em um tubo de 50 ml. Suplemento de 25 ml de meio de cultura ilhota no tubo de 50 ml com uma concentração final de 0,2 mM de EGTA para gerar o meio de pré-ensaio.
NOTA: A adição de EGTA solta suavemente contatos célula-célula nas ilhotas sem alterar a arquitetura da ilhota. Isto ajuda a garantir o COI pode atingir as células internas da ilhota e ajuda a prevenir a necrose da ilhota central.
4. Cultura de Intact mouse Ilhotas
- Isolar ilhotas intactas a partir de uma estirpe de pré-selecionado, o sexo, AGE, e genótipo de murganhos após uma digestão com colagenase a 8,9 rotina de pâncreas. Piscina juntos ilhotas de como amostras.
- Aliquota de 40 ilhéus em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços em 200 ul de meio de cultura das ilhotas. Visualmente ilhotas tamanho-fósforo por poço (uma avaliação precisa da equivalência das ilhotas (IEQ) entre as amostras não é necessário). Encha os poços vazios imediatamente adjacentes aos poços com ilhotas com 200 mL de água estéril para fornecer um buffer de evaporação. Cultura ilhotas em meios durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO 2.
5. Re-suspensão de microesferas de controle de PLGA COI-carregados e
- Após a recuperação da ilhota dia para o outro, microesferas ressuspender por adição de meio de pré-ensaio de uma alíquota de liofilizados microesferas de PLGA COI-carregado de tal modo que a concentração final de ICO no tubo de microcentrífuga é de 10 ng / ul (a quantidade de COI presentes numa dada quantidade de os micros geradospheres foi determinado no passo 2.9). Sonicar as microesferas ressuspensas COI-carregados em um banho de água gelada durante 10 minutos a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C.
- Ressuspender controlo microesferas de PLGA por adição do mesmo volume de meio de pré-ensaio para um volume igual de controlo liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar os ressuspensos microesferas de PLGA de controlo num banho de água gelada durante 10 minutos a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C.
- Visualmente confirmar microsferas são dispersas por pipetagem 2 ul de microesferas ressuspensas entre duas lamelas de vidro. Visualize microesferas utilizando uma objectiva de 40x em um epifluorescência ou brightfield microscópio.
- Se agregação significativa das microsferas é ainda visível, sonicado num banho de água gelada por mais 10 minutos adicionais a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C e repetição visualização de microesferas ressuspenso.
6. Tratamento de Ilhotas com controle de PLGA Microesferas COI-carregados ou </ P>
- Para cada cavidade a ser tratada com microesferas carregadas COI-, preparar meio de ensaio por diluição a 10 ng / ul de microesferas de COI ressuspensas em meio de pré-ensaio para um volume final de 100 ul e uma concentração final pré-determinada.
NOTA: A concentração final óptima da proteína vai variar para cada COI utilizado para este ensaio. Idealmente, uma gama de concentrações finais são testadas. - Para cada cavidade a ser usada como um controlo, preparar controlo de meio de ensaio por diluição das microesferas de PLGA de controlo ressuspensos gerados no passo 5.2 com o mesmo volume de diluição utilizada para diluir as microesferas COI-carregados no passo 6.1.
NOTA: As ilhotas tratadas com meio de ensaio de controlo irá servir como um controlo negativo para permitir a detecção de qualquer efeito das microesferas em branco pode ter sobre os resultados experimentais. - remover cuidadosamente 100 ul de meio de cultura ilhotas de cada poço com uma micropipeta de tal modo que não há ilhotas são desalojadas dos poços. Delicadamente adicionar 100 μl de meio de ensaio ou 100 ul de meio de ensaio de controlo a cada poço.
- Incubar ilhotas a 37 ° C sob uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 durante três dias.
7. A dispersão ilhotas intactas Onto lâminas de microscópio
- Após três dias, usar uma micropipeta cuidadosamente para remover e descartar meio de ensaio de todos os poços, de modo a não deslocar ilhotas. Delicadamente adicionar 200 mL PBS para ilhotas de lavá-los do meio de ensaio. Remova cuidadosamente e elimine PBS com uma micropipeta e lavar cuidadosamente ilhotas novamente com uma 200 ul adicionais PBS.
- Remova e descarte PBS com uma micropipeta e adicione 100 ml de 0,025% de tripsina, a solução 2 mM EDTA. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Pipetar ilhotas na solução de tripsina-EDTA cima e para baixo a cada 2 min até ilhotas são visualmente confirmada a ser dispersos em células individuais (note que alguns pequenos aglomerados de células pode ainda estar presente) utilizando um microscópio de luz. Transferir todo o volume de cada poço individualLY em tubos de microcentrífuga labeled-.
- Adicionar 400 ul de meio de cultura de ilhotas a cada tubo de microcentrífuga para parar a dissociação de células mediada por tripsina.
- Centrifugar as amostras durante 5 minutos a 100 xg, a 4 ° C para sedimentar as células das ilhotas para o fundo de tubos de microcentrífuga.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta, e pellet ressuspender em 200 meios de cultura ilhéu ul fresco.
- Usando uma cito-centrífuga, centrífuga dissociada ilhotas a 140 xg por 3 min em lâminas de microscópio carregadas.
- Ar lâminas secar à temperatura ambiente durante 10 min, em seguida, desenhar uma caixa em torno das ilhotas dissociadas com uma caneta de marcação hidrofóbico.
- Fixar as células com 75 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) a TA durante 10 min. Remover PFA 4% e lavar cuidadosamente as células em 75 ul PBS duas vezes. Após a lavagem, permeabilizar as células com 75 uL de 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min. Em seguida, lavar as células com 75 ul de PBS.
Cuidado: PFA é conhecido por ser alergénicos, cancerígenos, e tóxico. 8. Imunofluorescência Rotulagem de Dissociated Ilhotas de insulina ea proliferação celular Marker, Ki67 - Preparar uma câmara úmida, colocando duas toalhas de papel molhado no fundo de uma caixa de slides capacidade microscópio 100 slide.
- Colocar as lâminas planas para baixo (células voltadas para cima) em câmara úmida. Preparar as amostras para rotulagem por aspiração do PBS do passo de lavagem anterior, utilizando uma micropipeta e a adição de 75 ul de solução de bloqueio (5% normal asno soro (NDS) em PBS) a cada diapositivo para bloquear a ligação não específica de anticorpos contra os espécimes. Incubar as lâminas em solução de bloqueio durante 1 h à TA.
- Delicadamente aspirado bloqueio solução usando uma micropipeta e adicionar 75 ul de solução de anticorpo primário contendo de cobaia anti-insulina de coelho e os anticorpos anti-Ki67, diluiu-se 1 ug / ml em 5% de NDS em PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
NOTA: marcadores alternativos de proliferação celular incluem proliferando antigénio da célula nuclear (PCNA) e fosfohistone H3 (PH3), - Aspirar cuidadosamente solução de anticorpo primário utilizando uma micropipeta e lavar as células com 75 ul de PBS. Aspirar PBS utilizando uma micropipeta e lavar as células mais duas vezes, cada vez com 75 ul de PBS. Incubar cada amostra com 75 ul de anticorpo secundário anti-cobaia de Cy5 e Cy3 anticorpo secundário anti-coelho diluída a 2 ug / ml em solução de bloqueio durante 1 h à TA.
NOTA: Não use anticorpos secundários marcados com o mesmo ou espectralmente sobreposição fluoróforo que já foi usado para rotular as microesferas. - A solução de anticorpo secundário aspirado utilizando uma micropipeta e incuba-se 75 ul de 300 nM DAPI em PBS durante 3 min a RT. Aspirar DAPI utilizando uma micropipeta e enxaguar em água desionizada, durante 5 min.
- Gentilmente aspirar água de amostras utilizando uma micropipeta. Detectar uma gota (cerca de 100 L) de solução de montagem de secagem rápida contendo antifade reagente sobre uma lamela de vidro. Inverta o lado do microscópio amostra deslizar para baixo, onto a solução de montagem. Pressione suavemente as lamelas contra a lâmina utilizando uma ponta de pipeta para remover as bolhas e limpe o excesso de líquido com um tecido de limpeza macio. Permitir lamelas secar durante a noite à TA.
- Use um microscópio de epifluorescência com uma câmera acoplada para aquisição de imagem. Para cada fluoróforo, determinar o tempo de exposição óptimo (tipicamente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para insulina, e 250 mseg de Ki67). Certifique-se de parâmetros de aquisição de imagem são iguais para todas as amostras.
- Para cada amostra, contar manualmente 3.000 células de insulina-positivos e dos que contar quantos são também Ki67-positivas. Quantidade de apenas as células de insulina positivas que têm um núcleo bem definida e claramente visíveis. Calcula-se a percentagem de proliferação de células-p para cada amostra dividindo o número de células de Ki67-positivas / insulina-positivo pelo número total de células de insulina positivas e multiplicando por 100.
- Depois determining a percentagem de proliferação de células-p, para cada amostra para determinar se uma diferença estatisticamente significativa na proliferação de células β existe entre o controlo e amostras experimentais por análise de resultados com um ANOVA de uma via utilizando o software estatístico disponível comercialmente.
9. Aquisição de Imagem e Análise
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Representative Results
A Figura 1 é uma representação visual das microesferas geradas utilizando o protocolo anterior. O protocolo aqui descrito proporciona microesferas rhCTGF-carregada de vários tamanhos. A maior fracção de microsferas vai situar-se entre 1 e 10 um de diâmetro, embora algumas microsferas que podem ser maiores (Figura 2). Se desejado, o tamanho de microsferas pode ser ajustada e optimizada com base em parâmetros de fabrico, tais como velocidade de homogeneização e tempo, a concentração de agente tensioactivo utilizado e os volumes relativos de cada fase de água / óleo / água 10.
Após a dispersão das ilhotas intactas tratadas com microesferas de PLGA e de imunomarcação subsequente, é comum ver regiões da amostra desprovida de qualquer rotulagem entre células (Figura 3). Enquanto a maioria das microesferas que ainda estão intactos depois do período de tratamento são a culturaremovido durante os passos de lavagem, alguns permanecem depois das ilhotas são girados sobre as lâminas de microscópio. Estas microesferas fazer com que as estruturas de buraco-visualizadas como durante o exame. Estas microesferas residuais tipicamente não interfere com a quantificação subsequente.
Após a imagiologia, a percentagem de células Ki67-positivas / insulina-positivo pode ser quantificada por contagem manual o número total de células marcadas, ou utilizando software de análise de imagem. Anteriormente, nós demonstramos que conjuntivo recombinante Factor Tecidual de crescimento humano (rhCTGF) pode estimular a proliferação de células β rato em ilhotas intactas ex vivo 11. Usando o protocolo acima referido, geramos microesferas de PLGA contendo rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Tratar ilhotas intactas com microesferas de PLGA-rhCTGF durante 3 dias resultou num aumento similar na proliferação de células β como relatado anteriormente com a proteína em bruto, o que demonstra que a proteína não Lo if qualquer funcionalidade durante a produção de microesferas (Figura 4).
Figura 1:. Uma representação visual de PLGA As microesferas por incorporação de um corante fluorescente no protocolo de fabrico, as microesferas de PLGA podem ser visualizadas utilizando um microscópio de epifluorescência. Barra de escala representa 200 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Distribuição de Tamanho de PLGA As microesferas Embora a distribuição de tamanho pode variar, a maioria das microesferas vai ser menor do que 10 um de diâmetro.arget = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Visualização imunofluorescência de Dispersed proliferação células beta Dispersos ilhotas são immunolabeled para o marcador de proliferação Ki67 (vermelho) e insulina (verde) para marcar a proliferar células beta. Os núcleos são marcadas com DAPI (azul). As setas indicam células Ki67-positivas / insulina-positiva. Asteriscos (*) indicam microesferas não degradada. Barra de escala representa 100 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação e Análise de células β Proproliferação. ilhotas tratadas com quantidades diferentes de microesferas de PLGA-rhCTGF. O número de células de Ki67-positivas / insulina-positiva foi contado manualmente a partir de todas as amostras e expresso como uma percentagem do número total de células beta do tipo insulina positivo. Eixo dos X corresponde à concentração final de rhCTGF presente em cada tratamento. A significância estatística foi determinada utilizando um ANOVA de uma via seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey. A significância estatística foi estabelecido em p ≤ 0,05. As barras de erro representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O estudo da proliferação de células β em cultura é normalmente prejudicada por várias dificuldades. Em primeiro lugar, as linhas de células imortalizadas β são caracterizados por níveis mais elevados de proliferação do que o que é encontrado em células beta em ilhéus endógenos vivo. Além disso, estas linhas de células imortalizadas não têm a arquitetura normal crítico para a função das células β normal. Estes dois factos fazem com que seja difícil para determinar se os resultados obtidos utilizando linhas de células imortalizadas β será verdade quando testados in vivo ou in ilhotas inteiros. Nosso protocolo descrito, que utiliza ilhéus intactos isolada de fresco de rato, evita estes problemas como a arquitectura ilhéu é mantida e a proliferação de células β é comparável ao observado in vivo.
Uma preocupação significativa quando a cultura ilhotas intactas é a possibilidade de que as células no interior do núcleo de ilhotas irá sofrer necrose induzida por hipoxia ou não será exposto a rhCTGF. Por esta razão, uma últimaconcentração de EGTA 0,1 mM é adicionado aos meios de comunicação para soltar contatos célula-célula sem perturbar a arquitetura da ilhota. Foi anteriormente publicado que a adição de EGTA sozinho pode aumentar a proliferação de células β, presumivelmente devido ao maior acesso de nutrientes e mitogénios nos meios de comunicação para o núcleo 12 da ilhota. O aumento da proliferação de células em resposta a β EGTA também poderia ser devido à diminuição do contacto célula-célula em si 13,14. Os meios descritos neste protocolo é também suplementado com soro de cavalo, em vez do soro fetal bovino mais tradicional. Esta substituição é feita devido à presença de lactogénio placentário em soro fetal bovino, que pode estimular a proliferação de células β por si só, potencialmente dificultando a análise no ensaio de proliferação.
Determinação da toxicidade relativa das microesferas de PLGA (com ou sem o COI) para as células de ilhéus podem ser avaliados através de uma análise de imunofluorescência de markers de morte celular ou danos no DNA, incluindo TUNEL ou γ-H2AX 15,16. Embora a adição de microesferas de PLGA não demonstrou quaisquer efeitos negativos evidentes para ilhotas ex vivo, os usuários devem estar cientes dos efeitos das microesferas pode ter em análise de imagem. Como demonstrado na Figura 3 e mencionado na seção de resultados, as microesferas não degradadas pode ser aparente como manchas escuras dentro de imagens de imunofluorescência, com mais microesferas que aparecem quando as concentrações crescentes são utilizados.
Deve notar-se que o protocolo descrito foi adaptado para trabalhar com ilhéus isolados de rato. Como tal, não é claro se as condições idênticas funcionará com ilhotas colhidas a partir de organismos alternativos, tais como o rato e os humanos. Notavelmente, as ilhotas colhido a partir de diferentes organismos, muitas vezes têm diferentes condições óptimas de cultura e diferentes graus de proliferação de células β 17,18.
numerosos Biomateriais estão potencialmente disponíveis para administrar rhCTGF de ilhotas isoladas, incluindo poli (uretano-tiocetal) e poli (propileno-sulfureto) 19. Nós escolhemos focar PLGA devido a várias qualidades notáveis que ele possui. Em primeiro lugar, PLGA é um reagente relativamente acessível e as microesferas podem ser gerados com equipamento de série (centrífugas, homogeneizador, liofilizador) disponível na maioria das instituições de pesquisa. PLGA é um polímero artificial que tem precedente para utilização com sucesso em dispositivos aprovados pela FDA, devido à sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, e a sua capacidade para modular as taxas de libertação composto 20. PLGA degrada-se por hidrólise, na presença de água, libertando a sua carga no processo. A composição química das partículas de PLGA pode ser adaptada de tal modo que um composto é libertada in vivo durante o período de várias semanas. PLGA também tem sido utilizada em ensaios pré-clínicos em animais e terapias clínicos humanos para administrar localmente os compostos para vários órgãos e tissues 21,22. Outros polímeros hidrofóbicos podem também ser utilizados na geração de microesferas biodegradáveis. Estes polímeros podem responder aos estímulos ambientais específicas, tais como pH, temperatura, e a presença de espécies de oxigénio reactivas 23,24. Assim, os pesquisadores devem considerar cuidadosamente quais biomaterial é mais adequado para os seus estudos.
Qualquer pesquisador utilizando PLGA ou outros biomateriais, para estudar a proliferação de células β ex vivo deve estar ciente dos potenciais diferenças entre os efeitos do COI encapsulados em comparação com COI não encapsulado. Por exemplo, a entrega de rhCTGF através PLGA poderia alterar o grau de temporização e de indução da proliferação de células β comparação com o tratamento com a proteína não encapsulado. Estudos em andamento em nosso laboratório estão actualmente a examinar estas diferenças potenciais.
A análise da proliferação de células cultivadas em ilhotas β é um poderoso modelo para a identificação e meanálise chanistic de mitógenos de células β. Utilizando o ensaio descrito aqui vamos mostrar um método relativamente rápido e de baixo custo para a administração de uma COI para ilhotas cultivadas isoladas com um veículo de entrega de libertação prolongada. Este ensaio deve ser aplicado a quase qualquer COI de interesse, e nossa escolha para focar CTGF é puramente baseado em sua capacidade publicado anteriormente para estimular a proliferação de células β in vivo e ex vivo 11. Além disso, este ensaio pode validar a eficácia e segurança do uso de PLGA como um método de entrega antes de avançar para modelos onde ilhotas transplantadas em organismos vivos. Em geral, o protocolo descrito proporciona uma nova forma de administrar compostos para ilhotas cultivadas com um maior impacto na medição da segurança de PLGA para tecidos transplantáveis.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
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