Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Поступательный Администрация β-клеток митогенами к неповрежденной островки Mouse doi: 10.3791/54664 Published: November 5, 2016

Abstract

Развитие биоматериалов значительно увеличило потенциал для целенаправленной доставки лекарственных средств к различным тканей и клеток типов, в том числе и панкреатических бета-клеток. Кроме того, биоматериала частицы, гидрогели и каркасы также предоставляют уникальную возможность для введения устойчивой, контролируемой доставки лекарственного средства к бета-клеток в культуре и в пересаженных тканей моделей. Эти технологии позволяют изучение факторов пролиферации кандидат β-клеток с использованием интактные островки и поступательно соответствующую систему. Кроме того, определение эффективности и целесообразности факторов кандидатов для стимуляции пролиферации β-клеток в системе культуры имеет решающее значение , прежде чем двигаться вперед , чтобы модели в естественных условиях. Здесь мы опишем метод совместного культивирования неповрежденные островки мыши с биоразлагаемого соединения , представляющего интерес (ИСП) -loaded поли (молочной-гликолевой кислоты) (PLGA) микросферы с целью оценки влияния устойчивого высвобождения на месте O вF митогенных факторов на пролиферацию β-клеток. Этот метод подробно описывает, как генерировать микросферы PLGA, содержащих нужный груз с использованием коммерчески доступных реагентов. В то время как описанный метод использует рекомбинантный фактор человеческого роста соединительной ткани (rhCTGF) в качестве примера, легко может быть использовано широкое разнообразие ИСП. Кроме того, этот метод использует 96-луночные планшеты для минимизации количества реагентов, необходимых для оценки пролиферации β-клеток. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования альтернативных биоматериалов и другие характеристики эндокринные клетки, такие как выживаемость клеток и статуса дифференцировки.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Панкреатические бета-клетки являются единственными инсулин-продуцирующие клетки в организме и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. В то время как здоровые люди не имеют достаточную массу β-клеток и функционируют надлежащим образом регулировать содержание глюкозы в крови, больных сахарным диабетом характеризуются недостаточной массы β-клеток и / или функции 1,2. Было высказано предположение , что индуцирование пролиферации β-клеток в конечном итоге может увеличить массу β-клеток и восстановление гомеостаза глюкозы у пациентов с диабетом 3. Тем не менее, оценка и проверка потенциальных пролиферативных соединений β-клеток в неповрежденных островках необходимо, прежде чем эффективные методы лечения могут быть разработаны. Трансплантация трупных человеческих островков Into людей с диабетом восстанавливает гомеостаз глюкозы в крови в течение некоторого времени, но наличие и успех этой экспериментальной процедуры затрудняется нехваткой людских островками доступных для трансплантации и смерти -клеток в островках на кормеПересадка эр 4. Даже с открытием факторов , которые стимулируют размножение инсулин-продуцирующие клетки, основной проблемой до сих пор существует в реализации этих факторов на соответствующих сайтах в естественных условиях. Одна из стратегий для длительной местной доставки β-клеточных пролиферативных соединений является поли (молочной-со-гликолевой) кислоты (PLGA). PLGA имеет историю использования в FDA одобрило продукцию для доставки лекарств из - за его высокой безопасности, биоразлагаемости и кинетики с длительным высвобождением 5. В частности, PLGA , представляет собой сополимер лактида и гликолида , который деградирует с помощью гидролиза с водой либо в естественных условиях или в культуре в молочную кислоту и гликолевую кислоту, которые в природе метаболитов в организме. Инкапсулированное лекарственное соединение может выделяться в окружающую среду путем диффузии как и / или механизмов высвобождения деградации под контролем. Инкапсуляция ИСП обеспечивает защиту от ферментативного разложения, повышение биодоступности реагента по сравнению с unencapsulaTed ИСП 5. Мы предполагаем , что PLGA Микросферы могут быть использованы для введения соединений - кандидатов к интактным островками в культуре, и в конечном счете в естественных условиях. Тестирование эффективности PLGA для введения β-клеточные митогены к островки ех естественных условиях имеет решающее значение , прежде чем протоколы трансплантации исследуются.

В настоящее время не существует метод для измерения пролиферации β-клеток у живых животных. Эксперименты по оценке эффективности потенциальных соединений пролиферативных в естественных условиях , следовательно , требуют введения этих соединений в живых животных, с последующим рассечением и переработке поджелудочных желез для иммунноокрашивания. Такие протоколы являются дорогостоящими и трудоемкими и требуют соединения для вводить системно, без каких-либо гарантий того, что они будут достигать островки. С другой стороны, несколько иммортализованные β-клеточные линии доступны для изучения инсулин-продуцирующих клеток в культуре, но эти клеточные линии не имеют архитектуру островковых и экологичет найдено в живых организмах 6. Иммортализованные β-клеточные линии также характеризуются как имеющие гораздо более высокую степень репликации , чем эндогенных бета-клеток в живом организме , таким образом , затрудняя анализ соединений , которые индуцируют пролиферацию. В данном исследовании мы опишем протокол, который использует интактные островки, выделенные из взрослых мышей. В отличие от β-клеточных линий, неповрежденные островки сохраняют нормальную архитектуру островок. Точно так же, в отличие от экспериментов , проведенных в естественных условиях, которые применяют пролиферативные соединений непосредственно к культивируемым интактные островки значительно уменьшает количество реагентов , которые необходимы для точного измерения пролиферации β-клеток.

Настоящее исследование использует PLGA для администрирования ИСП, в данном примере, рекомбинантный Connective тканевого фактора роста человека (rhCTGF). Описанный здесь метод дает значительное преимущество перед введением сырого соединения к культивируемым островками, поскольку оно позволяет для непрерывного высвобождения соединения в гоэлектронные средства массовой информации. Следует отметить, что этот анализ может быть модифицирован для введения широкого спектра белков и антител, которые представляют интерес для неповрежденных островках. Воздействие на других эндокринных типов клеток, в том числе альфа-клеток, также могут быть проанализированы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры были утверждены и выполнены в соответствии с Institutional Animal Care и использование комитета Вандербильта.

1. Маркировка ИСП с флуорофором (Необязательно)

  1. Выберите флуоресцентный краситель , который будет вступать в реакцию с свободного первичного амина (например, на белок), такие как сложные эфиры или производные сукцинимидиловых флуоресцеина, чтобы визуализировать микросферы груз. Растворите 8х молярный избыток (по отношению к числу молей ИСП) флуорофора в 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
  2. Ресуспендируют 50 мг ИСП до конечного объема 800 мкл в растворе носителя (конечной концентрации 62,5 нг / мкл). Решение транспортного средства будет варьироваться в зависимости от источника ИСП.
    Примечание: Типичное транспортное средство решения включают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) или ДМСО.
  3. Добавьте все решения Флуорофор / ДМСО с шага 1.1 и ресуспендируют ИСП. Вихревые в течение ночи при температуре 4 ° С. В качестве альтернативы, вихревые реакционную смесь при комнатной температуре(КТ) в течение 4 часов.
  4. После реакции мечения, удалить избыток флуорофор с использованием колонки обессоливания.
    1. Слить буфер хранения из колонки обессоливания и промыть 16 мл деионизированной воды. Выбросьте все поток через.
    2. Добавьте флуоресцентно меченого ИСП в колонну обессоливания. Элюировать 1,2 мл деионизированной воды и собирают поток через.
    3. Повторите шаг элюирование еще четыре раза, каждый раз добавляя 1,2 мл деионизированной воды и сбора потока через в качестве отдельного образца.
    4. Заморозить все собранные потока через образцы при -80 ° С и лиофилизации в соответствии с инструкциями изготовителя в течение 24 часов.

2. ИСП загруженным Микросфера Подготовка с помощью воды Вода в масле-в-Emulsion Solvent Испарение Метод

  1. Добавляют 1 мг флуоресцентно меченого ИСП к 100 мкл деионизованной воды с образованием первой водной фазы (W1).
  2. Растворите 65 мг поли (молочной-со-гликолевой ACId) (50:50 лактид: гликолид, молекулярная масса 54000 - 69000) в 750 мкл дихлорметана в микроцентрифужных трубки. Ultrasonicate в течение 10 - 30 секунд (при 160 Вт) для полного растворения PLGA. Это образует масляную фазу (O).
  3. Добавьте все фазы W1, полученной на этапе 2.1 в фазу O в каплям образом. Эмульсию с использованием ручного гомогенизатора при 20000 оборотах в минуту в течение 30 сек с образованием фазы W1 / O.
  4. Добавьте все фазы W1 / O в каплям образом до 15 мл 1% (вес / объем) водного раствора поливинилового спирта (ПВС) раствор (ПВС) и эмульгирования с использованием ручного гомогенизатора при 20000 оборотах в минуту в течение 30 сек ,
  5. Перенести все эмульсии, полученной на этапе 2.4 до 200 мл круглодонную колбу, и с учетом 635 мм ртутного столба вакуума с использованием роторного испарителя в течение 1 часа, чтобы удалить растворитель, и генерировать водную фазу.
  6. Аликвотные 1 мл водной фазы, полученной на этапе 2,5 до четырнадцати микропробирок. Центрифугирование водного раствора в микроцентрифужных пробирках при 7500XG в течение 8 мин.
    Примечание: На этом этапе микросферы присутствуют в оставшемся водном растворе и концентрируют до нижней части трубки микроцентрифужных.
  7. Тщательно удалить 900 мкл водного раствора, поступающего из микропробирок с помощью микропипетки, пипетирования с тем, чтобы не мешать микросферы на нижней части трубки микроцентрифужных.
    1. Промыть микросферы избытка PVA добавлением 1 мл деионизованной воды в каждую пробирку микроцентрифужных. Центрифуга при 7500 х г в течение 8 мин, и снова тщательно удалить 900 мкл водного раствора, поступающего из микропробирок с помощью микропипетки, пипетирования с тем, чтобы не мешать микросферы на нижней части трубки микроцентрифужных.
      Примечание: Оставшиеся 100 мкл водного раствора содержит сгенерированные микросферы.
  8. Замораживание водного раствора микросферы, генерируемой на этапе 2.7 при -80 ° С.
  9. Лиофилизации микросферы с использованием лиофилизатор в соответствии с производителемИнструкции и хранят при -20 ° C.
    Примечание: Измерить эффективность нагружения ИСП путем полного растворения PLGA микросферы и определения концентрации белка по сравнению со стандартной кривой свободного белка 7.
  10. В качестве отрицательного контроля, сформировать партию "пустой" микросферы (далее именуемые контрольными микросферами).
    Примечание: Генерирование контрольных микросферах идентичен генерации гидрофильных ИСП--ных микросфер, без ИСП дополнение к 800 мкл раствора носителя на стадии 1.2. Частицы управления Match в массовой концентрации PLGA по отношению к ИСП--ных микросфер PLGA для β-клеток митогеном анализа.

3. Подготовка Островок медиакультуры и предварительного анализа средств массовой информации

  1. Приготовьте 200 мл среды для культивирования интактные островки мыши: RPMI 1640, дополненной 11 мМ глюкозы, 10% лошадиной сыворотки, 100 ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина (далее какпусть питательные среды).
    Примечание 1: В отличие от эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), лошадиной сыворотки не хватает плацентарного лактогена, индуктор пролиферации β-клеток, который путает анализ в анализе пролиферации.
    Примечание 2: Поскольку микросферы PLGA не стерилизовать перед употреблением, добавление антибиотиков к культуральной среде имеет решающее значение, чтобы избежать микробиологического загрязнения.
  2. Удалить 25 мл островковой культуральной среды с электронным дозаторов и поместите в 50 мл коническую трубку. Дополнение 25 мл островковых культуральной среды в 50-мл коническую трубку с конечной концентрации 0,2 мМ EGTA, чтобы генерировать заранее среде для анализа.
    Примечание: Добавление EGTA слегка ослабнет контакты клетка-клетка в островках, не изменяя островок архитектуры. Это помогает обеспечить ИСП может достигать внутренние клетки островка и помогает предотвратить некроз центрального островка.

4. Культивирование Малонарушенных островки Mouse

  1. Изолировать интактные островки из предварительно выбранного штамма, пола, Agе, и генотип мышей следующиерутины коллагеназы пищеварения поджелудочной железы 8,9. Бассейн вместе с островками как образцов.
  2. Аликвоты 40 островки в одну лунку 96-луночного планшета для культуры ткани в 200 мкл культуральной среды островка. Визуально Островки размера матч на лунку (точная оценка островковой эквивалентности (IEQ) между образцами не требуется). Заполните пустые лунки, непосредственно примыкающих к скважинам с островками с 200 мкл стерильной водой для получения буфера испарения. Культура островки в средствах массовой информации в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха и 5% CO 2.

5. Повторное приостановление ИСП-нагруженных и управления PLGA Микросферы

  1. После ночного восстановления островковых клеток поджелудочной железы, ресуспендируют микросферы путем добавления предварительно среде для анализа в одну аликвоту лиофилизированных ИСП-нагруженных PLGA микросферы, так что конечная концентрация ИСП в микроцентрифужных трубки составляет 10 нг / мкл (количество ИСП, присутствующего в данном количестве генерируемые MICROSpheres была определена на шаге 2.9). Разрушать ультразвуком ресуспензированной ИСП-нагруженные микросфер в водяной бане со льдом в течение 10 мин при 160 Вт с 10 с длинными импульсами при температуре 4 ° С.
  2. управления Ресуспендируют PLGA Микросферы добавлением такого же объема предварительно среде для анализа в равной массе лиофилизированный управления PLGA микросферы. Разрушать ультразвуком ресуспендировали контрольные микросферы PLGA на водно-ледяной бане в течение 10 мин при 160 Вт с 10 с длинными импульсами при температуре 4 ° С.
  3. Визуально подтверждают микросферы диспергируют с помощью пипетки 2 мкл ресуспендировали микросферы между двумя покровные стекла. Визуализируйте микросферы с использованием объектива 40X на эпифлуоресцентной или светлопольному микроскопом.
  4. Если значительное агрегацию микросфер по-прежнему видна, гомогенат в бане с ледяной водой в течение еще 10 мин при 160 Вт с 10 с длинными импульсами при 4 ° С и повторной визуализации ресуспендировали микросферами.

6. Лечение островки с ИСП-нагруженных или управления PLGA Микросферы </ Р>

  1. Для каждой лунки, чтобы лечить с помощью ИСП--ных микросфер, готовят среде для анализа путем разбавления 10 нг / мкл ресуспензированной ИСП микросферы с предварительно среде для анализа до конечного объема 100 мкл и заранее определенной конечной концентрации.
    Примечание: Оптимальная конечная концентрация белка будет варьироваться для каждого ИСП, используемой для этого анализа. В идеале, диапазон конечных концентраций тестируются.
  2. Для каждой лунки, которые будут использоваться в качестве контроля, готовят контрольный среде для анализа путем разбавления ресуспензированной управления PLGA микросферы, генерируемой на этапе 5.2 с таким же объемом разбавления, используемой для разбавления ИСП-микросферами, загруженными на этапе 6.1.
    Примечание: Островки, обработанные для анализа управления СМИ будет служить в качестве отрицательного контроля, чтобы дать возможность обнаружения какого-либо эффекта пустые микросферы могут иметь на экспериментальных результатах.
  3. Тщательно удалите 100 мкл островок культуральной среды из каждой лунки с помощью микропипетки таким образом, чтобы не островки не вытесняют из лунок. Осторожно добавьте 100 мкмл анализа средств массовой информации или 100 мкл аналитического контроля СМИ в каждую лунку.
  4. Выдержите островки при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха и 5% CO 2 в течение трех дней.

7. Диспергирование интактных островки на предметные стекла микроскопа

  1. Через три дня, используйте микропипетки тщательно удалить и выбросить анализа средств массовой информации из всех лунок, чтобы не выбивать островки. Осторожно добавьте 200 мкл PBS с островками, чтобы вымыть их в среде для анализа. Осторожно снимите и выбросьте PBS с микропипетки и осторожно вымыть островки снова с дополнительным 200 мкл PBS.
  2. Удаляют PBS с микропипетки и добавить 100 мкл 0,025% трипсина, 2 мМ раствора ЭДТА. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Пипеткой островки в трипсин-ЭДТА раствором вверх и вниз каждые 2 мин до тех пор, пока островки визуально подтверждено, диспергируют в отдельные клетки (обратите внимание, что некоторые небольшие скопления клеток все еще могут присутствовать) с помощью светового микроскопа. Перенести весь объем каждой скважины индивидуальнойLY в labeled- микропробирок.
  3. Добавить 400 мкл культуральной среды островковых каждому микроцентрифужных трубки, чтобы остановить трипсина-опосредованной клеточной диссоциации.
  4. Центрифуга образцов в течение 5 мин при 100 мкг при 4 ° С, чтобы осадить клетки островка на дно микропробирок.
  5. Осторожно удалите супернатант с помощью микропипетки и ресуспендируют осадок в 200 мкл свежей культуральной среды островок.
  6. Использование цито-центрифуга, Центрифуга диссоциированных островки при 140 мкг в течение 3 мин на заряженных микроскопа.
  7. Воздушные сухие слайды при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем нарисовать прямоугольник вокруг диссоциированных островками с гидрофобным маркером.
  8. Закрепить клетки с 75 мкл 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре в течение 10 мин. Удалить 4% PFA и осторожно промыть клетки в 75 мкл PBS в два раза. После промывки проницаемыми клеток с 75 мкл 0,2% Тритон Х-100 в PBS в течение 10 мин. Затем промыть клетки с 75 мкл PBS.
    Внимание: ПФА, как известно, вызывает аллергических реакций, канцерогенным и токсичным.
  9. 8. Иммунофлуоресценции Этикетировочное диссоциированного островки для инсулина и пролиферации клеток Маркер, Ki67

    1. Приготовьте влажную камеру, помещая два мокрых бумажных полотенец в нижней части емкости предметного стекла микроскопа коробки 100 слайдов.
    2. Место скользит вниз (плоские клетки лицевой стороной вверх) во влажной камере. Подготовка образцов для маркировки с помощью аспирационных PBS с предыдущей стадии промывки с использованием микропипетки и добавлением 75 мкл блокирующего раствора (5% Нормальный Осел сыворотка (НСР) в PBS) для каждого слайда, чтобы блокировать неспецифическое связывание антител к образцам. Инкубируйте слайды в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре.
    3. Аккуратно аспирата блокирующего раствора с помощью микропипетки и добавить 75 мкл раствора первичного антитела, содержащего свинки анти-инсулин и кролика с анти-Ki67 антитела, разбавленный 1 мкг / мл в 5% НСР в PBS. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
      Примечание: Альтернативные маркеры пролиферации клеток, включают ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и phosphohistone H3 (PH3),
    4. Аккуратно аспирата раствор первичного антитела с помощью микропипетки и промыть клетки с 75 мкл PBS. Отберите PBS с использованием микропипетки и прополоскать клеткам еще два раза, каждый раз по 75 мкл PBS. Инкубируйте каждого образца 75 мкл анти-морской свинки Cy5 вторичного антитела и анти-кроличьим Су3 вторичного антитела, разбавленного до концентрации 2 мкг / мл в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте вторичные антитела, меченные же или спектрально перекрывающихся флуорофора, который уже используется для обозначения микросферы.
    5. раствора вторичного антитела Аспирировать с использованием микропипетки и инкубировать в 75 мкл 300 нМ DAPI в PBS в течение 3 мин при комнатной температуре. Отберите DAPI, используя микропипетку и промыть в деионизированной воде в течение 5 мин.
    6. Аккуратно аспирата воду из образцов с использованием микропипетки. Пятно капли (примерно 100 мкл) быстрой сушки монтажного раствора, содержащего antifade реагент на покровного стекла. Обратить сторону микроскопа образца вниз, оNto монтажного раствора. Аккуратно нажмите покровное против скольжения с использованием наконечника пипетки, чтобы удалить пузырьки и вытрите лишнюю жидкость с помощью мягкой ткани для чистки. Разрешить покровные высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.

    9. Получение изображения и анализ

    1. Используйте эпифлуоресцентной микроскоп с подключенной камеры для получения изображения. Для каждого флуорофора, определить оптимальное время экспозиции (обычно 20 мс для DAPI, 40 - 80 мс для инсулина и 250 мс для Ki67). Убедитесь, что параметры захвата изображений одинаковы для всех образцов.
    2. Для каждого образца вручную подсчитывать 3000 инсулин-позитивных клеток и тех, сосчитать, сколько также Ki67-положительными. Только рассчитывать инсулин-позитивных клеток, которые имеют четко определенную и четко видимое ядро. Рассчитывают процент пролиферирующих -клеток для каждого образца путем деления числа Ki67-положительных / инсулин-позитивных клеток на общее количество инсулина-положительных клеток и умножением на 100.
    3. После того, как гetermining процент пролиферирующих бета-клеток для каждого образца, определить, есть ли статистически значимая разница в пролиферации β-клеток существует между контролем и экспериментальных образцов на основе анализа результатов с односторонним ANOVA с использованием коммерчески доступного статистического программного обеспечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рисунок 1 представляет собой визуальное представление микросферах , полученных с использованием вышеуказанного протокола. Протокол, описанный здесь, дает rhCTGF--ных микросфер различного размера. Самая большая часть микросфер будет находиться в диапазоне от 1 до 10 мкм в диаметре, хотя некоторые микросферы могут быть больше (рисунок 2). При желании размер микросферы могут быть настроены и оптимизированы на основе параметров изготовления , таких как скорость гомогенизации и времени, концентрации поверхностно -активного вещества , используемого и относительных объемов каждой фазы 10 вода / масло / вода.

После рассредоточения неповрежденных островков , обработанных PLGA микросферы и последующего иммунноокрашивания, обычно видеть участки образца , лишенного какой - либо маркировки между ними клеток (рисунок 3). В то время как большинство из микросфер, которые остаются нетронутыми после периода лечения культураудален во время стадий стирки, некоторые из них остаются после того, как островки вращают на предметные стекла микроскопа. Эти микросферы вызывают дырочноподобной структуры визуализируются во время съемки. Эти остаточные микросферы обычно не мешают последующей количественной оценке.

После того, как изображения, процент Ki67-положительных / инсулин-позитивных клеток может быть определена количественно с помощью ручного подсчета общего количества маркированных клеток, или с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Ранее мы показали , что рекомбинантный Connective тканевого фактора роста человека (rhCTGF) может стимулировать пролиферацию мыши β-клеток в неповрежденных островках ех естественных условиях 11. Используя вышеупомянутый протокол, мы получили микросферы PLGA, содержащих rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Лечение нетронутыми островки с rhCTGF-PLGA микросферы в течение 3 дней приводило к аналогичному увеличению пролиферации β-клеток, как сообщалось ранее с сырого протеина, демонстрируя, что белок не сделал ло се любую функциональность при генерации микросферы (Рисунок 4).

Рисунок 1
Рисунок 1:. Визуальное представление PLGA Микросферы Путем включения флуоресцентного красителя в протокол производства, PLGA микросферы могут быть визуализированы с помощью эпифлуоресцентной микроскопа. Шкала бар представляет собой 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Размер Распределение PLGA Микросферы Хотя распределение по размерам может варьироваться, большинство микросферы будет меньше , чем 10 мкм в диаметре.Arget = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Иммунофлуоресцентного Визуализация дисперсных пролиферирующих бета-клетки разметали островки immunolabeled для маркера пролиферации Ki67 (красный) и инсулин (зеленый) , чтобы отметить пролиферирующих бета-клеток. Ядра помечены DAPI (синий). Стрелки указывают Ki67-положительных / инсулин-позитивных клеток. Звездочки (*) указывают на undegraded микросферы. Шкала бар составляет 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Количественный и анализ β-клеток Proпролиферацию. островки обрабатывают различными количествами rhCTGF-PLGA микросферами. Число Ki67-положительных / инсулин-позитивных клеток вручную рассчитывали из всех образцов и выражали в процентах от общего количества инсулина-положительных -клеток. Ось Х соответствует конечной концентрации rhCTGF в каждой обработке. Статистическая значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим многократным сравнительного теста Тьюки. Статистическая значимость была установлена ​​на уровне р ≤ 0,05. Усы представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Исследование пролиферации β-клеток в культуре, как правило, мешает несколько трудностей. Во-первых, иммортализованные β-клеточные линии характеризуются более высокими степенями пролиферации, чем то, что находится в эндогенных бета-клеток в живых островками. Кроме того, эти линии иммортализованных клеток не хватает нормальной архитектуры критической для нормальной функции β-клеток. Эти два факта делают его трудно определить , если результаты , полученные с использованием иммортализованных линий β-клеток будут справедливы при испытании в естественных условиях или в целом островки. Наш Описанный протокол, который использует свежеизолированных нетронутыми островки мыши, обходит эти вопросы , как архитектура островок поддерживается и пролиферации β-клеток сравнима с таковой найден в естественных условиях.

Одним из важных фактором при культивировании неповрежденные островки вероятность того, что клетки в пределах ядра островковой будут проходить гипоксия-индуцированного некроза или не будет подвергаться воздействию rhCTGF. По этой причине, окончательныйконцентрации 0,1 мМ EGTA, добавляют в средствах массовой информации, чтобы ослабить межклеточных контактов, не нарушая островок архитектуры. Ранее мы уже опубликовали , что добавление EGTA в одиночку может увеличить пролиферацию β-клеток, предположительно из - за расширения доступа питательных веществ и митогены в средствах массовой информации на островок сердцевины 12. Увеличение пролиферации β-клеток в ответ на EGTA также может быть связано с уменьшением самого 13,14 межклеточного контакта. Сред, описанных в данном протоколе также дополнена лошадиной сывороткой вместо более традиционной эмбриональной телячьей сыворотки. Эта замена производится за счет наличия плацентарного лактогена в эмбриональной бычьей сыворотки, который может стимулировать пролиферацию β-клеток по себе, потенциально усложняя анализ в анализе пролиферации.

Определение относительной токсичности микросферы PLGA (с или без ИСП) к островковых клеток можно оценить с помощью иммунофлуоресцентного анализа маrkers клеточной гибели или повреждения ДНК, в том числе TUNEL или гамма-H2AX 15,16. Хотя добавление PLGA микросфер не показал каких - либо очевидных вредных эффектов на островках ех естественных условиях, пользователи должны быть осведомлены о последствиях микросферы могут иметь на анализе изображений. Как показано на рисунке 3 и упоминается в разделе результатов, undegraded микросферы могут быть очевидными в виде темных пятен в пределах иммунофлуоресцентных изображений, с более микросферы , появляющихся , когда используются возрастающие концентрации.

Следует отметить, что описанный протокол был специально для работы с изолированными островками мыши. Таким образом, остается неясным, если одинаковые условия будут работать с островками добываемых из альтернативных организмов, таких как крысы и человека. Следует отметить, что островки собирают из разных организмов часто имеют различные условия оптимальной культивирования и различной степени пролиферации β-клеток 17,18.

Многочисленные BIOMaterials потенциально доступны для администрирования rhCTGF для выделенных островках, в том числе поли (тиокеталь-уретана) и поли (пропилен сульфид) 19. Мы решили сосредоточиться на PLGA из-за нескольких заметных качеств, которыми он обладает. Во-первых, PLGA является относительно доступным реагентом и микросферы могут быть получены с помощью стандартного оборудования (центрифуг, гомогенизатор, лиофилизующем) доступны в большинстве научно-исследовательских институтов. PLGA представляет собой искусственный полимер , который имеет прецедент для успешного использования в FDA утвержденных устройств благодаря своей биосовместимости, биоразлагаемости и его способности модулировать скорости 20 высвобождения соединения. ПЛГА деградирует путем гидролиза в присутствии воды, выпуская его груз в процессе. Химический состав частиц PLGA может быть адаптирована таким образом, что соединение высвобождается в естественных условиях в течение периода от нескольких недель. ПЛГА также используется в доклинических испытаниях на животных и клинической терапии человека в локально введение соединений в различных органах и Tissuэс 21,22. Другие гидрофобные полимеры также могут быть использованы при генерации биоразлагаемых микросфер. Эти полимеры могут реагировать на специфические стимулы окружающей среды, таких как рН, температуры и наличия активных форм кислорода 23,24. Таким образом, исследователи должны тщательно рассмотреть, какие биоматериала является наиболее подходящим для своих исследований.

Любой исследователь , с использованием PLGA или других биоматериалов, для изучения β-клеток пролиферации ех естественных условиях должны быть осведомлены о потенциальных различиях между эффектами инкапсулированного ИСП по сравнению с неинкапсулированной ИСП. Например, поставка rhCTGF через PLGA может изменить степень и сроки индукции пролиферации β-клеток по сравнению с лечением с неинкапсулированной белком. Текущие исследования в нашей лаборатории в настоящее время изучают эти потенциальные различия.

Анализ пролиферации β-клеток в культуре островками является мощным модель для идентификации и меняchanistic анализ β-клеток митогенами. С помощью анализа, описанного здесь мы показываем относительно быстрый и экономически эффективный способ введения ИСП к изолированным культивируемых островками с расширенным транспортным средством доставки релиз. Этот анализ должен быть применим к почти любой ИСП интерес, и наш выбор , чтобы сосредоточиться на CTGF основывается исключительно на его ранее опубликованной способности стимулировать пролиферацию β-клеток в естественных условиях и бывших естественных условиях 11. Кроме того, этот анализ может подтвердить эффективность и безопасность использования PLGA в качестве способа доставки, прежде чем перейти к моделям, где островки трансплантируют в живых организмах. В целом, описанный протокол обеспечивает новый способ введение соединений в культивируемые островками с более широким воздействием на измерении безопасности PLGA в перевиваемых ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer ThermoFisher Scientific O6149 For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl Sulfoxide Fisher BioReagents BP231-1 For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01 Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 Sigma-Aldrich 739960 Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 Sigma-Aldrich 341584 Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640 Thermo Scientific 11879-020 For culturing islets
Dextrose Anhydrous Fisher BioReagents 200-075-1 Supplement for islet media
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Antibiotics for islet media
Normal horse serum Jackson ImmunoResearch 008-000-121 Supplement for islet media
96-well tissue culture plate Corning 3603 For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378 Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300003 For spinning cells onto microscope slides
EZ Single Cytofunnel Thermo Scientific A78710020 For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acid Fisher BioReagents BP118-500 Used in dissociating islets
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 For fixing cells
Triton  X-100 Fisher BioReagents BP151 For permeabilizing cells
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibody abcam ab15580 For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin Dako A0564 For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152 For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig Jackson ImmunoResearch 706-175-148 For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher Scientific D1306 For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-Mount Lerner Laboratories 13800 Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System Labconco 7382020 For lyophilization of microspheres

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15, (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (7), 007823 (2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161, (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27, (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8, (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3, (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64, (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55, (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20, (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56, (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119, (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22, (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19, (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16, (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3, (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114, (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9, (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
Поступательный Администрация β-клеток митогенами к неповрежденной островки Mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Использование Биоразлагаемые поли (молочной-гликолевой кислоты) микросферы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).More

Pasek, R. C., Kavanaugh, T. E., Duvall, C. L., Gannon, M. A. Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres. J. Vis. Exp. (117), e54664, doi:10.3791/54664 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter