Abstract
Utveckling av biomaterial har signifikant ökat potentialen för riktad läkemedelstillförsel till en mängd olika cell- och vävnadstyper, inklusive de pankreatiska p-celler. Dessutom biomaterial partiklar, hydrogeler och ställningar ger också en unik möjlighet att administrera ihållande, till kontrollerbar drug delivery p-celler i odling och i transplanterade vävnadsmodeller. Dessa tekniker tillåter studiet av kandidat β-cellproliferationsfaktorer som använder intakta cellöar och ett translationellt relevant systemet. Dessutom bestämma effektiviteten och genomförbarheten av kandidatfaktorer för att stimulera β-celltillväxt i ett odlingssystem är kritisk innan man går vidare till in vivo-modeller. Häri beskriver vi en metod för att samarbeta kultur intakta mus öar med biologiskt nedbrytbar förening av intresse (COI) -loaded poly (mjölksyra-sam-glykolsyra) (PLGA) mikrosfärer i syfte att bedöma effekterna av ihållande in situ frigöring of mitogena faktorer på β-celltillväxt. Denna teknik beskrivs i detalj hur man skapar PLGA-mikrosfärer innehållande en önskad last användning av kommersiellt tillgängliga reagens. Medan den beskrivna tekniken använder rekombinant human bindvävstillväxtfaktor (rhCTGF) som ett exempel, kan ett brett utbud av COI lätt användas. Dessutom utnyttjar denna metod 96-brunnsplattor för att minimera mängden av reagens som är nödvändiga för att bedöma β-cellproliferation. Detta protokoll kan lätt anpassas för att använda alternativa biomaterial och andra endokrina cellegenskaper såsom cellöverlevnad och differentiering status.
Introduction
Pankreatiska p-celler är de enda insulinproducerande celler i kroppen och är kritiska för att upprätthålla blod glukoshomeostas. Även friska individer har tillräcklig β-cellmassan och fungera för att korrekt reglera blodsockret, är individer med diabetes kännetecknas av otillräcklig β-cellmassan och / eller funktion 1,2. Det har föreslagits att inducera β-cellproliferation i slutändan kan öka β-cellmassan och återställa glukoshomeostas hos individer med diabetes 3. Det krävs dock utvärdering och validering av potentiella β-cellproliferativa föreningar i intakta öar innan effektiva behandlingar kan utvecklas. Transplantation av avlidna mänskliga öar i individer med diabetes åter blod glukoshomeostas under en tid, men tillgången och framgången för detta experimentella förfarande hindras av en brist på mänskliga öar tillgängliga för transplantation och p-celldöd i cellöarna akteruter transplantation 4. Även med upptäckten av faktorer som inducerar förökning av insulinproducerande celler, existerar en stor utmaning fortfarande i att leverera dessa faktorer till relevanta ställen in vivo. En strategi för att ihållande lokal tillförsel av β-cellproliferativa föreningar är poly (mjölk-sam-glykol) syra (PLGA). PLGA har tidigare använts i FDA-godkända drug delivery produkter på grund av sin höga säkerhet, nedbrytbarhet och förlängd frisättning kinetik 5. Specifikt är PLGA en sampolymer av laktid och glykolid som degraderar via hydrolys med vatten, antingen in vivo eller i kultur till mjölksyra och glykolsyra, som är naturligt förekommande metaboliter i kroppen. Den inkapslade läkemedelsföreningen kan frigöras i den omgivande miljön genom både diffusion och / eller nedbrytningskontrollerad frisättningsmekanismer. Inkapsling av COI ger skydd mot enzymatisk nedbrytning, att förbättra biotillgängligheten av reagenset jämfört med unencapsulated COI 5. Vi föreslår att PLGA-mikrosfärer kan användas för att administrera kandidatföreningar till intakta cellöar i kultur, och slutligen in vivo. Testa effekten av PLGA att administrera β-cell mitogener att cellöar ex vivo är kritisk innan transplantationsprotokoll utforskas.
För närvarande finns det ingen teknik för att mäta β-cellproliferation med levande djur. Experiment för att utvärdera effekten av potentiella proliferativa föreningar in vivo kräver därför administrering av dessa föreningar till levande djur, med efterföljande dissekering och bearbetning av pancreata för immunmärkningen. Sådana protokoll är dyra och arbetskrävande, och kräver den förening som skall administreras systemiskt, utan någon garanti för att de kommer att nå cellöarna. Omvänt flera immortaliserade β-cellinjer är tillgängliga för studier av insulinproducerande celler i kultur, men dessa cellinjer saknar den lilla ön arkitektur och environment finns i levande organismer 6. Immortaliserade β-cellinjer är också kännetecknas som att ha en mycket högre grad av replikation än endogena p-celler in vivo, vilket således komplicerar analys av föreningar som inducerar proliferation. I denna studie beskriver vi ett protokoll som använder intakta cellöar isolerade från vuxna möss. Till skillnad från β-cellinjer, intakta cellöar behålla normal holme arkitektur. På samma sätt, i motsats till experiment genomförda in vivo, som administrerar proliferativa föreningar direkt till odlade intakta cellöar signifikant minskar mängden av reagens som är nödvändig för att noggrant mäta β-cellproliferation.
Den aktuella studien använder PLGA att administrera en COI, i detta exempel, rekombinant human bindvävstillväxtfaktor (rhCTGF). Den här beskrivna metoden ger en betydande fördel över administrationen av rå förening till odlade cellöar eftersom det möjliggör en kontinuerlig frisättning av förening i pae media. Notably, kan denna analys modifieras för att administrera en stor mängd proteiner och antikroppar av intresse till intakta cellöar. Effekter på andra endokrina celltyper, inkluderande a-celler, kan också analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes och genomförs i enlighet med den Vanderbilt Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Märkning COI med fluoroforen (tillval)
- Välja en fluorescerande färg som kommer att reagera med en fri primär amin (t.ex., på en protein), såsom succinimidylestrar eller fluoresceinderivat, att visualisera mikrosfär last. Lös upp 8x molärt överskott (i förhållande till moler COI) av fluorofor i 200 | il dimetylsulfoxid (DMSO).
- Resuspendera 50 mg COI upp till en slutlig volym av 800 | il i en fordonslösning (slutlig koncentration av 62,5 ng / | il). Vehikellösningen kommer att variera beroende på källan för den COI.
OBS: Typiska fordonslösningar innefattar fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller DMSO. - Lägg alla fluoroforen / DMSO-lösningen från steg 1,1 och suspendera COI. Vortex över natten vid 4 ° C. Alternativt virvel reaktionsblandningen vid rumstemperatur(RT) under 4 timmar.
- Efter märkningsreaktionen, avlägsna överskott fluorofor med hjälp av en avsaltningskolonn.
- Dränera lagringsbuffert från avsaltningskolonn och skölj med 16 ml avjoniserat vatten. Kasta allt flöde genom.
- Tillsätt fluorescerande COI till avsaltningskolonn. Eluera med 1,2 ml avjoniserat vatten och samla flödet genom.
- Upprepa elueringssteg ytterligare fyra gånger, varje gång tillsätta 1,2 ml avjoniserat vatten och uppsamling av flödet genom som ett separat prov.
- Frysa alla samlas flöde genom prover vid -80 ° C och lyofilisera enligt tillverkarens anvisningar för 24 timmar.
2. COI-laddade mikrosfärberedningen via Vatten-i-olja-i-vatten emulsion lösningsmedelsindunstning Metod
- Lägg 1 mg fluorescensmärkt COI till 100 | il av avjoniserat vatten för att bilda den första vattenfasen (W1).
- Lös upp 65 mg av poly (mjölksyra-sam-glykol acid) (50:50 laktid: glykolid, molekylvikt 54.000 - 69.000) i 750 pl diklormetan i ett mikrocentrifugrör. Ultrasonicate för 10-30 sek (vid 160 W) för att fullständigt lösa PLGA. Detta bildar oljefasen (O).
- Lägg alla W1 fas genereras i steg 2,1 till O fasen i en droppvis sätt. Emulgera med användning av en handhållen homogenisator vid 20.000 varv per minut under 30 sek för att bilda den W1 / O fas.
- Lägg alla W1 / O fas i ett droppvis sätt till 15 ml av en 1% (vikt / volym) vatten poly (vinylalkohol) (PVA) -lösning och emulgera med hjälp av en handhållen homogenisator vid 20.000 rpm under 30 sek .
- Överföra alla av emulsionen som genereras i steg 2,4 till en 200 ml rundbottnad kolv och föremål för en 635 mm Hg vakuum under användning av en rotationsindunstare under 1 h för att avlägsna lösningsmedlet och alstra den vattenhaltiga fasen.
- Alikvot 1 ml av den vattenhaltiga fasen som genereras i steg 2,5 till fjorton mikrocentrifugrör. Centrifugering av vattenlösningen i mikrocentrifugrör vid 7500xg under 8 min.
OBS: I detta steg är mikrosfärerna föreligger i den kvarvarande vattenlösningen och är koncentrerad till botten av mikrocentrifugrör. - Försiktigt bort 900 | il vattenlösning från de mikrocentrifugrör med en mikropipett, pipettering för att inte störa mikrosfärerna på botten av mikrocentrifugrör.
- Tvätta mikrosfärer av överskott PVA genom att tillsätta 1 ml avjoniserat vatten till varje mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 7500 x g under 8 min, och återigen försiktigt bort 900 | il vattenlösning från de mikrocentrifugrör med en mikropipett, pipettering för att inte störa mikrosfärerna på botten av mikrocentrifugrör.
OBS: De återstående 100 | il vattenlösning innehåller de genererade mikrosfärerna.
- Tvätta mikrosfärer av överskott PVA genom att tillsätta 1 ml avjoniserat vatten till varje mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 7500 x g under 8 min, och återigen försiktigt bort 900 | il vattenlösning från de mikrocentrifugrör med en mikropipett, pipettering för att inte störa mikrosfärerna på botten av mikrocentrifugrör.
- Frysa den vattenhaltiga mikrosfärlösning som alstras i steg 2,7 vid -80 ° C.
- Lyofilisera mikrosfärer med hjälp av en frystorkning enligt tillverkarensinstruktioner och förvara vid -20 ° C.
OBS: Mät laddningseffektivitet av COI genom att helt lösa upp PLGA-mikrosfärer och bestämning av proteinkoncentrationen i förhållande till en standardkurva av fritt protein 7. - Som en negativ kontroll, generera en sats av "tomma" mikrosfärer (nedan kallade kontrollmikrosfärer).
OBS: Alstring av kontrollmikrosfärer är identisk med genereringen av hydrofila COI-laddade mikrosfärer, utan någon COI tillägg till 800 | il av vehikellösningen i steg 1,2. Match kontrollpartiklar i masskoncentrationen av PLGA i förhållande till COI-laddade PLGA-mikrosfärer för β-cell mitogen analys.
3. Beredning av Islet Kultur Media och Pre-analys Media
- Förbereda 200 ml media för odling av intakta mus cellöar: RPMI 1640-medium kompletterat med 11 mM glukos, 10% hästserum, 100 U / ml penicillin G och 100 | ig / ml streptomycin (hädanefter kallad ärlåt odlingsmedium).
NOT 1: Till skillnad från fetalt bovint serum (FBS), saknar hästserum placentalaktogen, en inducerare av β-cellproliferation, vilket confounds analysen i proliferationsanalysen.
NOT 2: Som de PLGA-mikrosfärer inte är steriliserade före användning, är tillsatsen av antibiotika till odlingsmediet av avgörande betydelse för att undvika mikrobiologisk förorening. - Ta 25 ml av holmen odlingsmedium med en elektronisk pipett och plats i en 50 ml koniska rör. Komplettera de 25 ml av ö-odlingsmedia i 50 ml koniska rör med en slutlig koncentration av 0,2 mM EGTA för att generera den pre-analysmedia.
OBS: Tillägget av EGTA löser milt cell-cell kontakter i öarna utan att ändra holme arkitektur. Detta bidrar till att säkerställa den COI kan nå de inre cellerna i holmen och hjälper till att förhindra nekros av den centrala holmen.
4. Odling av intakt mus Islets
- Isolera intakta cellöar från en i förväg utvald stam, kön, age, och genotypen hos möss efter en rutinmässig kollagenasdigerering i bukspottkörteln 8,9. Pool cellöar tillsammans från liknande prov.
- Alikvot 40 cellöar in i en brunn på en 96-brunnars vävnadsodlingsplatta i 200 | il av ö-odlingsmedier. Visuellt storleks match cellöar per brunn (en exakt bedömning av ö likvärdighet (iEQ) mellan prover är inte nödvändig). Fylla tomma brunnar omedelbart intill brunnar med öar med 200 pl sterilt vatten för att ge en indunstningsanläggning buffert. Kultur cellöar i medium över natten vid 37 ° C under en atmosfär av 95% luft och 5% CO2.
5. resuspension av COI-laddade och kontroll PLGA-mikrosfärer
- Efter över natt islet återhämtning, återsuspendera mikrosfärerna genom att lägga till pre-assay media till en alikvot av lyofiliserade COI-laddade PLGA-mikrosfärer, så att den slutliga koncentrationen av COI i mikrocentrifugrör är 10 ng / ul (mängden COI närvarande i en given mängd av de genererade microssiva bestämdes i steg 2,9). Sonikera de resuspenderade COI-laddade mikrosfärer i ett isvattenbad under 10 minuter vid 160 W med 10 sek långa pulser vid 4 ° C.
- Återsuspendera kontroll PLGA-mikrosfärer genom att lägga till samma volym av pre-analysmedia till en lika stor massa av lyofiliserad kontroll PLGA-mikrosfärer. Sonikera de återsuspenderade kontroll PLGA-mikrosfärer i ett isvattenbad under 10 minuter vid 160 W med 10 sek långa pulser vid 4 ° C.
- bekräfta visuellt mikrosfärer sprids genom att pipettera 2 pl resuspenderade mikrosfärer mellan två glastäck. Visualisera mikrosfärer med hjälp av en 40X objektiv på en epifluorescence eller bright mikroskop.
- Om väsentlig aggregering av mikrosfärer är fortfarande synliga, sonikat i ett isvattenbad under ytterligare 10 min vid 160 W med 10 sek långa pulser vid 4 ° C och upprepa visualisering av återsuspenderade mikrosfärer.
6. Behandling av cellöar med COI-laddade eller kontroll PLGA-mikrosfärer </ P>
- För varje brunn som skall behandlas med COI-laddade mikrosfärer, förbereda analysmedia genom utspädning av 10 ng / | j, l av den återsuspenderade COI mikrosfärer med pre-assay media till en slutlig volym av 100 | j, l och en förutbestämd slutkoncentration.
OBS: Den optimala slutliga koncentrationen av proteinet kommer att variera för varje COI används för denna analys. Helst är en rad slutkoncentrationer testas. - För varje brunn för att användas som en kontroll, förbereda kontrollanalys media genom att späda de återsuspenderade kontroll PLGA-mikrosfärer som genereras i steg 5,2 med samma utspädningsvolym som används för att späda ut de COI-laddade mikrosfärer i steg 6,1.
OBS: cellöar behandlade med kontrollanalys media kommer att fungera som en negativ kontroll för att möjliggöra upptäckt av någon effekt de tomma mikrosfärerna kan ha på de experimentella resultaten. - Försiktigt bort 100 pl holmen odlingsmedia från varje brunn med en mikropipett på sådant sätt att inga öar uttränges från brunnarna. Försiktigt lägga 100 μl av analysmedia eller 100 pl av kontrollanalys media till varje brunn.
- Inkubera cellöar vid 37 ° C under en atmosfär av 95% luft och 5% CO2 under tre dagar.
7. Dispergermedel Intakta cellöar på objektglas
- Efter tre dagar, använd en mikropipett för att försiktigt ta bort och kasta analysmaterial från alla brunnar för att inte rubba holmar. Försiktigt lägga 200 l PBS till öar för att tvätta dem i analysmedia. Försiktigt bort och kasta PBS med en mikropipett och försiktigt tvätta holmar igen med ytterligare 200 pl PBS.
- Ta bort och kasta PBS med en mikropipett och tillsätt 100 pl av 0,025% trypsin, 2 mM EDTA-lösning. Inkubera vid RT i 3 min. Pipett cellöar i trypsin-EDTA-lösning upp och ner varje 2 min tills cellöar är visuellt bekräftat att dispergeras i enstaka celler (observera att vissa små klumpar av celler fortfarande kan finnas närvarande) med användning av ett ljusmikroskop. Överför hela volymen av varje brunn enskildly i labeled- mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 400 pl holmen odlingsmedia till varje mikrocentrifugrör att stoppa trypsin-medierad cell dissociation.
- Centrifugera prover för 5 min vid 100 xg vid 4 ° C för att pelle cellöar till botten av mikrocentrifugrör.
- Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en mikropipett, och återsuspendera pelleten i 200 pl färsk holme odlingsmedier.
- Med hjälp av en cyto-centrifug, dissocierade centrifug öar vid 140 xg under 3 min på laddade objektglas.
- Lufttorka objektglasen vid RT under 10 minuter, sedan rita en ruta runt de dissocierade holmar med en hydrofob märkpenna.
- Fix celler med 75 | j, l 4% paraformaldehyd (PFA) vid RT under 10 min. Ta bort 4% PFA och försiktigt tvätta cellerna i 75 pl PBS två gånger. Efter tvätt, permeabilisera celler med 75 | il 0,2% Triton X-100 i PBS under 10 min. Då, tvätta cellerna med 75 | il PBS.
Försiktighet: PFA är känt för att vara allergiframkallande, cancerframkallande, och toxiskt. 8. Immunofluorescens Märkning av dissocierade cellöar för insulin och cellproliferationen Marker, Ki67 - Förbereda en fuktig kammare genom att placera två våta pappershanddukar i botten av en 100 slide kapacitet objektglas box.
- Plats glider platta ner (celler uppåt) i fuktig kammare. Framställning av prover för märkning genom att aspirera PBS från föregående tvättsteg med användning av en mikropipett och tillsats av 75 | j, l av blockeringslösning (5% Normal Donkey Serum (NDS) i PBS) till varje objektglas för att blockera icke-specifik bindning av antikroppar till proverna. Inkubera objektglasen i blockerande lösningen under 1 h vid RT.
- Försiktigt aspirera blockerande lösningen med användning av en mikropipett och tillsätt 75 pl av primär antikroppslösning innehållande marsvinsantiinsulin och kanin-anti-Ki67-antikroppar, späddes 1 | ig / ml i 5% NDS i PBS. Inkubera vid RT i 1 h.
OBS: Alternativa markörer för celltillväxt inkluderar pcna (PCNA) och fosfohistone H3 (PH3), - aspirera försiktigt primär antikropp lösning med hjälp av en mikropipett och spola cellerna med 75 pl PBS. Aspirera PBS med hjälp av en mikropipett och skölj celler två gånger, varje gång med 75 mikroliter PBS. Inkubera varje prov med 75 | il anti-marsvins-Cy5 sekundär antikropp och anti-kanin-Cy3 sekundär antikropp utspädd till 2 ug / ml i blockeringslösning under 1 h vid RT.
OBS: Använd inte sekundära antikroppar märkta med samma eller spektralt överlappande fluoroforen som redan användes för att märka mikrosfärerna. - Aspirera lösningen sekundär antikropp med användning av en mikropipett och inkubera i 75 | il av 300 nM DAPI i PBS under 3 min vid RT. Aspirera DAPI med användning av en mikropipett och skölj i avjoniserat vatten i 5 min.
- aspirera försiktigt vatten från prover med hjälp av en mikropipett. Spot en droppe (ca 100 l) av snabbtorkande monteringslösning som innehåller antifade reagens på ett täckglas. Invertera objektglas provsidan nedåt, onto monteringslösning. Tryck försiktigt täck mot bilden med hjälp av en pipett spets för att ta bort bubblor och torka bort överflödig vätska med en mjuk rengöringsduk. Låt täck torka över natten vid RT.
- Använd en epifluorescensmikroskop med en bifogad kamera för bildtagning. För varje fluorofor, bestämma den optimala exponeringstiden (vanligtvis 20 ms för DAPI, 40 - 80 ms för insulin, och 250 msek för Ki67). Se till bildupptagningsparametrar är lika för alla prover.
- För varje prov, manuellt räkna 3000 insulin positiva celler och av dem räkna hur många är också Ki67-positiva. Endast räkna insulinpositiva celler som har ett väldefinierat och tydligt kärnan. Beräkna andelen prolifererande p-celler för varje prov genom att dividera antalet Ki67-positiva / insulinpositiva celler genom det totala antalet insulinpositiva celler och multiplicera med 100.
- efter determining andelen prolifererande p-celler för varje prov, bestämma om en statistiskt signifikant skillnad i β-cellproliferation föreligger mellan kontroll- och experimentprover genom att analysera resultat med en envägs ANOVA med användning av kommersiellt tillgänglig statistisk mjukvara.
9. Image Acquisition och analys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 är en visuell representation av mikrosfärerna som genereras med användning av ovanstående protokoll. Protokollet som beskrivs här ger rhCTGF-laddade mikrosfärer av olika storlekar. Den största fraktionen av mikrosfärer kommer att vara mellan 1 och 10 pm i diameter, även om vissa mikrosfärer kan vara större (figur 2). Om så önskas, kan mikrosfärstorleken avstämmas och optimeras baserat på tillverkningsparametrar såsom homogenisering hastighet och tid, koncentrationen av ytaktivt medel som används, och relativa volymer av varje vatten / olja / vattenfasen 10.
Efter spridning av intakta cellöar behandlade med PLGA-mikrosfärer och efterföljande immunomärkning, är det vanligt att se regioner av provet saknar märkning mellan celler (Figur 3). Medan de flesta av de mikrosfärer som fortfarande är intakt efter odlingsbehandlingsperioden äravlägsnas under tvättstegen, en del kvar efter cellöarna spinnes på de objektglas. Dessa mikrosfärer orsaka hål liknande strukturer visualiseras under avbildning. Dessa kvarvarande mikrosfärer typiskt inte stör efterföljande kvantifiering.
Efter bildalstring, kan den procentuella andelen av Ki67-positiva / insulinpositiva celler kvantifieras genom att manuellt räkna det totala antalet märkta celler, eller med hjälp av programvara bildanalys. Tidigare har vi visat att rekombinant human bindvävstillväxtfaktor (rhCTGF) kan stimulera mus β-cellproliferation i intakta cellöar ex vivo 11. Med hjälp av ovan nämnda protokoll, vi genererade PLGA-mikrosfärer innehållande rhCTGF (rhCTGF-PLGA). Behandling intakta öar med rhCTGF-PLGA-mikrosfärer i 3 dagar resulterade i en liknande ökning av β-celltillväxt som tidigare rapporterats med råprotein, vilket visar att proteinet inte lo syns någon funktion under mikrosfär generationen (Figur 4).
Figur 1:. Visuell representation av PLGA-mikrosfärer Genom att införliva ett fluorescerande färgämne i tillverkningsprotokoll, kan PLGA-mikrosfärer visualiseras med hjälp av en epifluorescent mikroskop. Skala stapel representerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Storleksfördelning av PLGA-mikrosfärer Även om storleksfördelning kan variera, kommer de flesta mikrosfärer att vara mindre än 10 pm i diameter.Arget = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Immunofluorescerande Visualisering av dispergerade Prolifererande p-celler Dispergerad cellöar är immunolabeled för proliferationen markören Ki67 (röd) och insulin (grön) för att markera prolifererande p-celler. Kärnor är märkta med DAPI (blå). Pilar indikerar Ki67-positiva / insulinpositiva celler. Asterisk (*) indikerar opåverkade mikrosfärer. Skala stapel representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kvantifiering och analys av β-cell Proliferation. Islets behandlas med olika mängder av rhCTGF-PLGA-mikrosfärer. Antalet Ki67-positiva / insulinpositiva celler manuellt räknas från samtliga prover och uttryckas som en procentandel av det totala antalet insulinpositiva p-celler. X-axeln motsvarar den slutliga koncentrationen av rhCTGF närvarande i varje behandling. Statistisk signifikans bestämdes med användning av en envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest. Statistisk signifikans sattes vid p ≤ 0,05. Felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien av β-cellproliferation i kultur vanligen hämmas av flera svårigheter. Först odödliggjorda β-cellinjer som kännetecknas av en högre grad av proliferation än vad som finns i endogena p-celler i levande öar. Dessutom är dessa immortaliserade cellinjer saknar den normala arkitekturen kritiska för normal β-cellfunktion. Dessa två faktorer gör det svårt att avgöra om erhållna resultat med odödliggjorda β-cellinjer kommer att hålla sant när den testades in vivo eller i hela öar. Vår beskrivna protokollet, som använder färskt isolerade intakta mus öar, kringgår dessa frågor som holmen arkitekturen bibehålls och β-celltillväxt är jämförbar med den som finns in vivo.
En betydande oro när odling intakta cellöar är möjligheten att celler inom den lilla ön kärnan kommer att genomgå hypoxiinducerad nekros eller kommer inte att utsättas för rhCTGF. Av denna anledning, en slutligkoncentration av 0,1 mM EGTA tillsätts till mediet för att lossa cell-cellkontakter utan att störa ö arkitektur. Vi har tidigare publicerats att tillsatsen av EGTA ensam kan öka β-celltillväxt, förmodligen på grund av ökad tillgång av näringsämnen och mitogener i media till holmen kärnan 12. Ökningen av β-cellproliferation som svar på EGTA kan också vara på grund av minskningen i cell-cell-kontakt själv 13,14. Medierna som beskrivs i detta protokoll också kompletteras med hästserum i stället för den mer traditionella fetalt bovinserum. Denna substitution görs på grund av närvaron av placentalaktogen i fetalt bovint serum, vilket kan stimulera β-cellproliferation på egen hand, potentiellt komplicerande analysen i proliferationsanalysen.
Bestämning av den relativa toxiciteten av PLGA-mikrosfärer (med eller utan den COI) och ö-cellerna kan utvärderas genom immunofluorescens-analys av markers av celldöd eller DNA-skador, inklusive TUNEL eller γ-H2AX 15,16. Även tillsats av PLGA-mikrosfärer har inte visat några uppenbara skadliga effekter på holmar ex vivo, bör användare vara medvetna om effekterna mikrosfärerna kan ha på bildanalys. Som visas i figur 3 och som nämns i avsnittet resultat, kan opåverkade mikrosfärer vara uppenbart som mörka fläckar inom immunofluorescerande bilder, med fler mikrosfärer förekommer när ökande koncentrationer utnyttjas.
Det bör noteras att den beskrivna protokoll har skräddarsytts för att arbeta med isolerade mus cellöar. Som sådan, är det oklart om identiska förhållanden kommer att arbeta med öar som skördats från alternativa organismer, såsom råtta och människa. Särskilt holmar skördas från olika organismer har ofta olika optimala odlingsbetingelser och olika grader av β-celltillväxt 17,18.
Numerous biomaterial är potentiellt tillgängliga för att administrera rhCTGF till isolerade cellöar, inklusive poly (tioketal-uretan) och poly (propylen-sulfid) 19. Vi valde att fokusera på PLGA på grund av flera anmärkningsvärda egenskaper som den besitter. För det första är PLGA en relativt prisvärd reagens och mikrosfärerna kan genereras med standardutrustning (centrifug, homogenisator, lyofiliseringsanordning) finns på de flesta forskningsinstitutioner. PLGA är en artificiell polymer som har prejudikat för framgångsrik användning i FDA godkända enheter på grund av sin biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet, och dess förmåga att modulera förening frisättningshastigheter 20. PLGA bryts ned genom hydrolys i närvaro av vatten, avger dess last i processen. Den kemiska sammansättningen av PLGA-partiklar kan skräddarsys så att en förening frisätts in vivo under en period av flera veckor. PLGA har också använts i prekliniska djurförsök och kliniska behandlingar för att lokalt administrera föreningar till olika organ och tissues 21,22. Andra hydrofoba polymerer kan också användas vid alstring av biologiskt nedbrytbara mikrosfärer. Dessa polymerer kan svara på specifika stimuli från omgivningen, såsom pH, temperatur och närvaron av reaktiva syreradikaler 23,24. Därför bör forskare noga överväga vilket biomaterial är mest lämplig för sina studier.
Alla forskare som använder PLGA eller andra biomaterial, för att studera β-celltillväxt ex vivo bör vara medvetna om eventuella skillnader mellan effekterna av inkapslade COI jämfört med icke inkapslat COI. Till exempel, kan leveransen av rhCTGF via PLGA ändra graden av och tidpunkten för β-cellproliferation induktion jämfört med behandling med icke-inkapslat protein. Pågående studier i vårt labb undersöker för närvarande dessa potentiella skillnader.
Analysen av β-celltillväxt i odlade cellöar är en kraftfull modell för identifiering och migchanistic analys av β-cell mitogener. Med användning av testet som beskrivs här visar vi en relativt snabb och kostnadseffektiv metod för att administrera en COI till isolerade odlade cellöar med en förlängd frisättning tillförselvehikel. Denna analys bör tillämpas på nästan alla COI av intresse, och vårt val att fokusera på CTGF är enbart baserat på sin tidigare publicerats förmåga att stimulera β-cell proliferation in vivo och ex vivo 11. Dessutom kan denna analys validera effektiviteten och säkerheten med att använda PLGA som en leveransmetod innan avancera till modeller där öar transplanteras i levande organismer. Sammantaget ger den beskrivna protokollet ett nytt sätt för att administrera föreningar till odlade cellöar med en större inverkan på att mäta säkerheten i PLGA till transplanterbara vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer | ThermoFisher Scientific | O6149 | For labeling COI with fluorophore |
| DMSO Dimethyl Sulfoxide | Fisher BioReagents | BP231-1 | For dissolving fluorophore in step 1 |
| Disposable PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17-0851-01 | Desalting column used in step 1 |
| Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000 | Sigma-Aldrich | 739960 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000 | Sigma-Aldrich | 341584 | Used in generation of microspheres in step 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | For culturing islets |
| Dextrose Anhydrous | Fisher BioReagents | 200-075-1 | Supplement for islet media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Antibiotics for islet media |
| Normal horse serum | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | Supplement for islet media |
| 96-well tissue culture plate | Corning | 3603 | For culturing islets |
| Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | Supplement for pre-assay islet media |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | For spinning cells onto microscope slides |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | For spinning cells onto microscope slides |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher BioReagents | BP118-500 | Used in dissociating islets |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | For fixing cells |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | For permeabilizing cells |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Blocking reagents for immunofluorescence |
| Anti-Ki67 antibody | abcam | ab15580 | For Ki67 immunofluorescence |
| Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin | Dako | A0564 | For insulin immunofluorescence |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | For Ki67 immunofluorescence |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | For insulin immunofluorescence |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | For nuclei visualization in immunofluorescence |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | Fast drying mounting media |
| FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System | Labconco | 7382020 | For lyophilization of microspheres |
References
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823 (2012).
- Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255 (2007).
- Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
- Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
- Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
- Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
- Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
- Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
- Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
- Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
- Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).
