Protocol
Noot: Procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Temperatuur gecontroleerde incubators worden gebruikt om de temperaturen voor vlieg opfok te behouden en kruisen, tenzij anders vermeld.
1. Voorbereidingen
- Bereid Flies.
- Prometafase verrijkt eicel collecties.
- Clear volwassen vliegt van gezonde, jongvee of cross culturen. Leeftijd flessen gedurende twee dagen bij 25 ° C.
OPMERKING: algemeen twee gezonde flessen worden volstaan, hoewel meer nodig kunnen zijn voor sommige kruis culturen. - Na twee dagen, laat ~ 100 tot 300 vrouwen (die 0-2 dagen op dit punt) van de flessen. De vrouwtjes hoeven geen maagd te zijn. Voeg een schar van gistpasta aan de zijkant van een flesje en plaats 30 vrouwen en 10 tot 15 mannetjes elk in de gegiste flesjes. Leeftijd flesjes gedurende twee dagen bij 25 ° C.
- Clear volwassen vliegt van gezonde, jongvee of cross culturen. Leeftijd flessen gedurende twee dagen bij 25 ° C.
- Metaphase verrijkt Oocyte Collecties.
- Verzamel ~ 100 tot 300 vrouwen uit voorraad of cross cultures. Voeg een schar van gist plakken aan de zijkant van een flacon en plaats 30 vrouwen per stuk (zonder mannetjes toegevoegd) in de gegiste flesjes. Leeftijd flesjes voor 3-5 dagen bij 25 ° C.
- Prometafase verrijkt eicel collecties.
- Bereid Solutions.
Opmerking: Oplossingen kunnen onbeperkt worden bewaard bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld.- Prepare Gemodificeerd Robb Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sucrose, 275 mM natriumacetaat, 200 mM kaliumacetaat, 50 mM glucose, 6 mM magnesiumchloride en 5 mM calciumchloride. Gebruik 10 N 11: 8 natriumhydroxide: kaliumhydroxide om de pH op 7,4 te brengen. Steriliseren door filtratie; niet autoclaaf. Bewaar bij -20 ° C. Ontdooien als nodig is om voor te bereiden ~ 200 ml 1x Robb's per eicel prep.
- Fixatie Solutions.
- Optie # 1: Bereid formaldehyde / heptaan fixatie. Bereid Fixatie buffer: 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) plus 150 mM sucrose. Om gebruik te maken, maken fris met 687,5 ul Fixatie Buffer en 312,5 ul 16% formaldehydeper eicel prep.
LET OP: Draag handschoenen tijdens het gebruik van formaldehyde oplossingen in een zuurkast. Verwijdering van afval volgens de institutionele richtlijnen. - Optie # 2: Bereid formaldehyde / cacodylate fixatie. Bereid Fix Mix: 250 mM sucrose, 100 mM kaliumacetaat (pH 7,5), 25 mM natriumacetaat (pH 7,0) en 25 mM EGTA (pH 8,0). Om gebruik te maken, maken fris met 400 ul Fix Mix, 100 ul kalium cacodylate (1 M, pH 7,2) en 500 ul 16% formaldehyde per eicel prep.
LET OP: Kalium cacodylate bevat arsenicum.
- Optie # 1: Bereid formaldehyde / heptaan fixatie. Bereid Fixatie buffer: 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) plus 150 mM sucrose. Om gebruik te maken, maken fris met 687,5 ul Fixatie Buffer en 312,5 ul 16% formaldehydeper eicel prep.
- Bereid PBS / Triton X-100: 1x PBS plus 1% of 0,05% Triton X-100. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid PBS-Tween 20-runderserumalbumine (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w / v) en 0,1% Tween-20. Kan ongeveer één week bewaard bij 4 ° C.
- Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) Solutions.
- Bereid 20X natriumchloride-natriumcitraat (SSC): 3 M natriumchloride en 0,3 M natriumcitraat.
- Bereid 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% Tween-20. Maak verse, ~ 20 ml per eicel prep.
- Bereid formamide oplossingen: 2x SSC, 0,1% Tween-20, plus formamide. Voeg vers, 1 ml 20% formamide, 0,5 ml 40% formamide en 2 ml 50% formamide per oöcyt prep.
LET OP: Draag handschoenen tijdens het gebruik van formamide oplossingen in een zuurkast. Verwijdering van afval volgens de institutionele richtlijnen. - Bereid hybridisatieoplossing: 2x SSC, 50% formamide en 10% dextraansulfaat (w / v). Bewaren bij 4 ° C.
- FISH Probes.
- Order oligonucleotiden (zie Tabel 1 voor sequenties) met HPLC zuivering en gewenste 5 'fluorescerende modificatie (bijvoorbeeld Cy3 en Cy5). Resuspendeer in Tris-EDTA (TE) bij 50 ng / ul.
OPMERKING: Bescherm oligo's van blootstelling aan licht te allen tijde.
- Order oligonucleotiden (zie Tabel 1 voor sequenties) met HPLC zuivering en gewenste 5 'fluorescerende modificatie (bijvoorbeeld Cy3 en Cy5). Resuspendeer in Tris-EDTA (TE) bij 50 ng / ul.
2. Het verzamelen van een laat stadium Drosophila Eicellen
- Als
- Verdoven alle ~ 100 tot 300 gegist vliegen met kooldioxide en toe te voegen aan een blender met ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Pols drie keer (~ 1 sec elk). Houd eicellen in Robb voor <20 min om de activering te vermijden.
LET OP: Als alternatief, eicellen kan worden met de hand ontleed van vrouwtjes. Het voordeel van deze methode is dat het minder vrouwtjes. Wel moet erop worden genomen om de blootstelling aan kooldioxide te beperken tot slechts een paar minuten naar artefacten geassocieerd worden met hypoxie 7 te vermijden.- Filteren door middel van grote mazen (~ 1500 pm) in 250 ml beker om grote delen van het lichaam te verwijderen. Als veel intact abdomens blijven mesh, re-grind materiaal met behulp van extra Robb's Buffer en filter weer. Laat bezinken ~ 2 min, dan zuigen off bovenste laag, het verwijderen van zoveel mogelijk van de grote delen van het lichaam mogelijk te maken.
- Filter via kleine mesh (~ 300 micrometer) in een bekerglas van 250 ml. Spoel de resterende eicellen uit de eerste beker met behulp van extra Robb's en gecoat Pasteur pipet. Laten bezinken ~ 3 min; eicellen zullen bezinken. Zuig uit alle, maar ~ 10 ml.
- Giet zoveel van 10 ml en past in 5 ml gecoate buis. Laten bezinken, te verwijderen vloeistof, en herhaal met de rest. Spoel de resterende eicellen uit de beker met behulp van extra Robb's en gecoat Pasteur pipet. Laat vestigen in 5 ml buis ~ 3-5 min.
- Verdoven alle ~ 100 tot 300 gegist vliegen met kooldioxide en toe te voegen aan een blender met ~ 100 ml 1x Robb's Buffer. Pols drie keer (~ 1 sec elk). Houd eicellen in Robb voor <20 min om de activering te vermijden.
3. Drug Behandelingen (optioneel)
- Coat een tweede 5 ml buis met PTB voor elke eicel prep. Voeg geschikt oplosmiddel (controle) of geneesmiddel aan 1 ml Robb elk voor elke oöcyt prep (tabel 2).
- Split eicellen naar de tweede gecoat 5 ml buis. Laten bezinken, te verwijderen vloeistof, en voeg 1 ml Robb plus oplosmiddel in één buis en 1 ml Robb's plus geneesmiddel in tweede buis. Nutate voor de juiste hoeveelheid tijd voor de behandeling met geneesmiddelen (tabel 2). Let vestigen.
4. fixatie
- Aspireren uit alle vloeibare en onmiddellijk voeg 1 ml Fix.
- Optie # 1: Formaldehyde / heptaan fixatie (Fixation Buffer plus 5% formaldehyde).
- Fix voor 2,5 min op een nutator. Voeg 1 ml heptaan en vortex 1 min. Laten bezinken ~ 1 min.
- Verwijder alle vloeibare en voeg daarna 1 ml 1x PBS. Vortex 30 sec. Laten bezinken ~ 1 min.
- Verwijder alle vloeibare, en vul buis met 1x PBS.
OPMERKING: Eicellen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of gehandhaafd nutator verscheidene uren bij kamertemperatuur.
- Optie # 2: Formaldehyde / cacodylate fixatie (Fix Mix plus 8% formaldehyde en 100 mm cacodylate).
- Fix voor 6 min op een nutator. Laat bezinken 2 min. Verwijder vloeistof, en vul buis met 1x PBS.
OPMERKING: Eicellen kunnen onmiddellijk worden gebruikt of gehandhaafd nutator verscheidene uren bij kamertemperatuur.
- Fix voor 6 min op een nutator. Laat bezinken 2 min. Verwijder vloeistof, en vul buis met 1x PBS.
5. Het verwijderen van Membranen ( "Rolling")
- Gebruik van gecoat Pasteur pipet, voeg ~ 500 tot 1000 oöcyten aan de mat (gezandstraald) van een glasplaatje. Verwijder alle lichaamsdelen en vreemde materiaal met behulp van een tang. Laat geen eicellen uitdrogen; voeg 1x PBS als dat nodig is.
- Plaats een dekglaasje op de top van de eicellen en zachtjes "roll" eicellen tot alle membranen worden verwijderd (het slepen van de rand van het dekglaasje over de eicellen het beste werkt.) Controleer regelmatig de vooruitgang onder de microscoop, voor zover nodig het toevoegen van meer 1x PBS. Wees voorzichtig als te veel druk zal de eicellen te vernietigen.
LET OP: Voor immunofluorescentie alleen verder met stap 6. Voor FISH (met of zonder immunofluorescentie), verder met stap 7.
6. Antilichaam kleuring van Drosophila Eicellen
- Extractie en blokkeren
- Spoel gerold eicellen in een 15 ml conische buis met ~ 15 ml PBS / 1% Triton X-100. Nutate oöcyten in deze oplossing gedurende ten minste 1,5 uur en niet meer dan 2 uur.Deze stap maakt antilichaam penetratie.
- Laat eicellen af te wikkelen ~ 2 min. Verwijder vloeistof samen met zoveel membranen mogelijk, dan voeg PBS / 0,05% Triton X-100.
LET OP: Membranen zullen vestigen langzamer dan gerold eicellen. - Laat eicellen af te wikkelen ~ 2 min, verwijder alles behalve ~ 1 ml vloeistof. Transfer eicellen te afgestudeerd 1,5 ml tube en verwijder de resterende vloeistof. Voeg 1 ml PTB voor het blokkeren en nutate gedurende 1 uur.
- antilichaam kleuring
- Pre-opname van secundaire antilichamen tegen embryo's.
LET OP: Deze stap elimineert achtergrond kleuring van niet-specifiek antilichaam interacties met Drosophila eiwitten.- Verzamelen en lossen Drosophila embryo's (~ 25 pi) per typische procedure 8. Bewaar in methanol bij -20 ° C.
- Verwijder methanol uit embryo's, voeg 800 ul methanol plus 200 pl 1x PBS en nutate gedurende 15 min. Verwijder 500 pl supernatant en vervangen door 500 pl 1x PBS. Vervolgens nutate gedurende 15 min. Herhaal dit twee keer (voor een totaal van ~ 1 uur wasbeurten), en dan eindigen in PTB.
OPMERKING: Embryo's kunnen direct worden gebruikt of gehandhaafd nutator een aantal uur bij kamertemperatuur geroerd. - Verwijder vloeistof, vullen met PTB tot 200 ul per eicel prep, en voeg fluorescent-gelabelde secundaire antilichamen op geschikte verdunningen (in gedachten houden dat het uiteindelijke volume 300 pi zal zijn;. Zie stap 7.4) Nutate bij 4 ° C gedurende de nacht (bij voorkeur) of bij kamertemperatuur gedurende 3-4 uur.
OPMERKING: De pre-geabsorbeerde antilichamen worden gebruikt in stap 6.2.4.
OPMERKING: Houd monsters in het donker zoveel mogelijk na fluorescerende antilichamen zijn toegevoegd.
- Verwijder vloeistof uit eicellen, vul met PTB tot 300 ui en voeg primaire antilichamen op de juiste verdunningen. Nutate bij 4 ° C overnacht (bij voorkeur) of bij kamertemperatuur voor 3 tot 4 uur.
- Wassen oöcyten viermaal gedurende 15 min elk met 1 ml PTB.
- Verwijderenvloeistof van oöcyten, voeg 200 pl supernatant van embryo's (pre-geabsorbeerd secundaire antilichamen). Dan vullen met PTB tot 300 pi. Nutate bij kamertemperatuur gedurende 3-4 uur (bij voorkeur) of bij 4 ° C overnacht.
- Was eicellen eenmaal gedurende 15 minuten met 1 ml PTB, verwijder vloeistof. Voeg vervolgens 0,5 ul Hoechst 33342 en 500 pl PTB en nutate gedurende 7 min.
- Wassen eicellen tweemaal gedurende 15 min elk met 1 ml PTB.
OPMERKING: Eicellen kunnen direct op een slede gemonteerd of kan worden opgeslagen in PTB bij 4 ° C tot klaar voor beeldvorming.
- Pre-opname van secundaire antilichamen tegen embryo's.
7. FISH (verder vanaf stap 5 hierboven)
- Spoel gerold eicellen in een 15 ml conische buis met ~ 15 ml 2x SSCT. Laat eicellen af te wikkelen ~ 2 min. Verwijder alles behalve ~ 0,5 ml vloeistof met zoveel membranen mogelijk.
LET OP: Membranen zullen vestigen langzamer dan gerold eicellen. - Transfer eicellen tot 0,5 ml tube en verwijder de resterende vloeistof. Achtereenvolgens toevoegen en verwijderen 500 ul20%, 40% en 50% formamide oplossingen, nutatiepomp gedurende 10 minuten in elke oplossing.
LET OP: Eicellen zal vestigen trager met hogere percentages formamide. - Verwijderen vloeistof, voeg 500 ul 50% formamide oplossing en nutate bij 37 ° C gedurende 1-5 uur.
OPMERKING: Langere incubaties van betere penetratie probe. - Verwijderen vloeistof, met achterlating van niet meer dan ~ 100 ul eicellen en voeg 36 ul hybridisatieoplossing plus 2 pl probe (50 ng / ul) en 2 pl water of 2 pi van een 2 tweede probe (Tabel 1).
- Incubeer bij 91 ° C gedurende 3 min (FISH) of 80 ° C gedurende 20 min (FISH plus immunofluorescentie), gevolgd door incubatie in een 37 ° C waterbad gedurende de nacht.
Opmerking: Deze stappen kunnen worden uitgevoerd in een thermocycler. - Geen vloeistof te verwijderen. Voeg 500 ul 50% formamide oplossing en nutate bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Laten bezinken, verwijderen vloeistof, voeg 500 ul 50% formamide-oplossing, eend nutate bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Laten bezinken verwijderen vloeistof, voeg 500 ul 20% formamide oplossing en nutate bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Voer drie snelle wassingen in 500 pi 2x SSCT (laten bezinken, verwijder vervolgens toe te voegen vloeistof, omkeren meerdere malen herhalen.) Laten bezinken, verwijderen vloeistof, voeg dan 500 pi PTB en nutate voor 4 uur.
8. Antilichaam kleuring na FISH
- Verwijder vloeistof uit eicellen, vul met PTB tot 300 ui en voeg 10 ul anti-α-tubuline antilichaam geconjugeerd aan FITC. Als alternatief kunnen andere antilichamen worden gebruikt, na bovenstaande protocol. Nutate overnacht bij kamertemperatuur.
- Was eicellen eenmaal voor 15 min met 500 ul PTB, verwijderen vloeistof, voeg dan 0,5 ul Hoechst 33342 en 500 ui PTB en nutate gedurende 7 min.
- Wassen eicellen tweemaal gedurende 15 min elk met 500 pi PTB.
OPMERKING: Eicellen kunnen direct worden aangebracht op een objectglaasje of kan worden opgeslagen in PTB bij 4 ° C tot klaar voorbeeldvorming. Houd eicellen in het donker zo veel mogelijk eenmaal fluorescerende antilichamen zijn toegevoegd.
| Herhaal Naam | chromosome | Oligo Sequence * |
| 359 | X | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| dodeca | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1.686 | 2 + 3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4 (+ Y) | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| * 359 sequentie van Eric Joyce, persoonlijke mededeling, andere sequenties van Sullivan et al. 8 | ||
Tabel 1: FISH probes voor Drosophila centromere herhalingen.
| drug | solvent | voorraadconcentratie | eindconcentratie | De tijd van de behandeling | Effect |
| colchicine | ethanol | 125 mM | 150 uM | 10 min of 30 min | destabiliseren non-kinetochoor (10 min) 9 of alle (30 min) microtubules |
| paclitaxel | DMSO | 10 mM | 10 uM | 10 minuten | stabiliseren microtubules |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 mM | 25 uM | 20 min | remmen Aurora B kinase 10 |
Tabel 2: Drug behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methoden die we hier beschreven leidt tot de verzameling van laat-stadium Drosophila oöcyten die drie stadia van de meiose (figuur 1). Eicellen in profase onderscheiden zich door de aanwezigheid van de nucleaire envelop, die zichtbaar is door het gebrek aan tubuline signaal in het gebied rond de karyosome (Figuur 1A). Prometafase is de periode na de nucleaire envelop afbraak gedurende welke de spil assembleert. Tijdens prometafase, de karyosome gaat uit van een kenmerkende vorm, raken vaak verlengd met de 4 e chromosomen, afgezien van de belangrijkste karyosome massa (Figuur 1B). Prometafase eindigt met metafase, waarbij Drosophila eicellen nature arresteren tot ovulatie. In metafase eicellen, heeft de karyosome teruggetrokken in een ronde vorm (figuur 1C).
We beschrijven hier methoden om de snelheid van eieren leggen van Drosophila vrouwtjes manipuleren om verrijken oöcyten hetzij in prometafase en metafase. Eicellen uit prometafase-verrijkte collecties tonen vaak het langwerpige karyosome (Figuur 2A), terwijl metafase-verrijkte collecties of collecties van maagdelijke Drosophila vrouwtjes, die eieren leggen bijna volledig te elimineren, in de eerste plaats de ronde karyosome (Figuur 2B) laten zien. Interessant prometafase verrijkte collecties ook typisch tonen veel robuuster spindels, wat suggereert dat zowel de karyosome en de spil verandering tussen prometaphase en metafase in Drosophila oöcyten 9.
Figuur 3 toont representatieve beelden van de twee protocollen hier beschreven. Antilichamen tegen α-tubuline (in de spil tonen), CENP-C (op centromeren tonen) en INCENP (de centrale spil tonen) ondergebracht bij oöcyten bevestigd met formaldehyde / heptaan (Figuur 3A). Probes voor de repetitieve centromere sequenties op de 2e chromosoom (AACAC) en 3 rd chromosoom (dodeca) werden gebruikt eicellen met formaldehyde / cacodylate en vaste co-gekleurd met een α-tubuline antilichaam volgens de FISH protocol (Figuur 3B). De AACAC probe verschijnt als meerdere geclusterde brandpunten terwijl de dodeca probe verschijnt als een enkele aandacht per chromosoom. Oöcyten behandeld met 150 uM colchicine gedurende 10 min gefixeerd met formaldehyde / heptaan (Figuur 3C). Deze behandeling elimineert de meeste niet-kinetochore-microtubules, waardoor alle microtubuli contact brengen van het DNA in centromeer gelabeld foci. Oöcyten behandeld met 10 uM paclitaxel gedurende 10 min tonen buitensporige microtubuli in het cytoplasma, maar weinig effect op de spindel microtubuli (Figuur 3D). Eicellen behandeld met 25 uM Binucleine 2 voor 20 min naar Aurora B kinase tonen volledig verlies van remmenspindel microtubuli (figuur 3E).
Figuur 1: De drie fasen van rijpe oöcyten Drosophila. Prophase, prometafase en metafase confocale beelden van Drosophila eicellen in profase (A), prometaphase (B) en metafase (C) van meiose I. DNA wordt getoond in blauw en tubuline is in het groen in de samengevoegde beelden. Bijvoegsels in (B) en (C) tonen DNA in wit. Schaal bars = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:Prometaphase- vs. metafase verrijkte verzamelingen van Drosophila oöcyten. Confocale beelden van Drosophila eicellen uit prometaphase verrijkt (A) of verrijkte metafase (B) verzamelingen. DNA wordt getoond in blauw en tubuline wordt getoond in groen. Schaal bars = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Antibody kleuring, vis en medicamenteuze behandelingen van Drosophila eicellen confocale beelden van Drosophila eicellen met DNA in blauw en tubuline in het groen.. Schaalbalken = 10 urn. (A) Immunofluorescentie in formaldehydee / heptaan fixatie met INCENP (centrale as) in rood en CENP-C (centromeres) in het wit. (B) FISH in formaldehyde / cacodylate fixatie met AACAC in het rood weergegeven en dodeca getoond in het wit. (C) behandeling met 150 uM colchicine gedurende 10 min met CENP-C rood weergegeven. Behandeling met 10 pM paclitaxel gedurende 10 min (D) of 25 pM Binucleine 2 gedurende 20 minuten (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Staging Drosophila Eicellen
Hoewel een langwerpig karyosome vaak wordt gezien in prometaphase oöcyten, met behulp van karyosome vorm prometafase onderscheiden van metafase eicellen kan problematisch zijn. Tijdens prometafase, de karyosome begint als een ronde vorm, verlengt, en dan trekt om een ronde vorm als de eicel bereikt de metafase arrestatie. Dit betekent dat veel prometaphase oöcyten niet een langwerpige karyosome hebben. Bovendien, als mutant of met geneesmiddel behandelde oöcyten onderzocht, karyosome vorm kan worden beïnvloed, zich verzet tegen het gebruik van deze methode eicellen stadium. Omdat andere markers te onderscheiden deze fasen zijn niet beschikbaar, gebruiken we de hierboven beschreven werkwijze om de snelheid van eieren leggen van Drosophila vrouwtjes manipuleren om verrijken oöcyten hetzij in prometafase en metafase. De achterliggende gedachte is dat als eicellen te besteden een bepaalde hoeveelheid tijd in prometaphase en onbepaalde tijd arrseerd in metafase, die duurt tot het leggen van eieren, vervolgens sneller eileg zal scheef in de richting van een hoger percentage van prometaphase eicellen, terwijl de langzamere eieren leggen zullen verrijken voor metafase. Het bedrag van de inspanning die nodig is om maagdelijke vrouwtjes verzamelen of te verzamelen vrouwtjes over een korter tijdsbestek dan 2 dagen, zoals beschreven door Gilliland et al. 6, wordt niet beloond met een aanzienlijke toename van de prometaphase eicellen. Het is ook mogelijk de dorsale aanhangsels om oöcyten bereid met dit protocol stadium dorsale aanhangsels worden verwijderd samen met de membranen. Hoewel het niet afzonderlijke eicellen met 100% zekerheid stadium met deze methode, de data van prometaphase-verrijkte of metafase verrijkte verzamelingen kunnen worden samengenomen om conclusies te trekken over de verschillende stadia 9.
Drosophila eicellen worden niet bevrucht totdat ze door de eileider passeren; Daarom, omdat de eicellen vooe protocollen hier beschreven onderzoeken eicellen genomen voordat leg, zijn deze eicellen niet bevrucht. Passage door de eileider veroorzaakt ook de eicel te activeren en hervatten celcyclus. Methoden om celcyclus fasen te onderzoeken nadat metafase ik besta 11,12, maar vallen buiten de reikwijdte van dit protocol.
Fixatie Methode Overwegingen
We beschrijven twee verschillende methoden voor het fixeren van een laat stadium Drosophila eicellen. De formaldehyde / cacodylate dingsreactie werd eerst beschreven door Theurkauf en Hawley 3 en de formaldehyde / heptaan dingsreactie werd eerst beschreven door Zou et al. 4. Daarnaast wordt een derde werkwijze (methanol fixatie) gebruikt door sommige 13, maar hier niet beschreven. Verwijdering van de eicel membranen is iets moeilijker na formaldehyde / heptaan fixatie tegenover formaldehyde / cacodylaat. Dit is omdat "rollen" afhangeninzake wrijving tussen het dekglaasje en eicel en formaldehyde / heptaan bevestiging maakt de oöcyten gladder. Desondanks extra moeilijkheid, de eerste keus van fixatiemethode bij het testen van nieuwe antilichamen formaldehyde / heptaan omdat het beste werkt voor de meeste antilichamen die we hebben geprobeerd. Anderzijds gaat onze voorkeur formaldehyde / cacodylate bevestiging voor FISH, vooral voor het gemak van verwijdering membraan, hoewel formaldehyde / heptaan fixatie ook succesvol geweest. Beide methoden behouden eicel morfologie beter dan methanol fixatie, en daarom is het raadzaam methanol fixatie slechts in de gevallen van antilichamen die ongevoelig basis van formaldehyde fixatie methoden.
De hier beschreven protocollen gericht op vaste beeldvorming, teneinde effectieve methoden voor het weergeven volwassen Drosophila oöcyten vatbaar antilichaam penetratie, namelijk door de verwijdering van de eicel membranen tonen. Alternatieve methoden voor het membraan removal (14 behulp van een tang of sonificeren 13) mogelijk; vinden we echter "rollen" de meest efficiënte en betrouwbare methode. Technieken voor live-imaging zijn ook elders beschreven 14-16 en vallen buiten de reikwijdte van dit protocol.
FISH Aanbevelingen
FISH in Drosophila oöcyten oorspronkelijk beschreven door Dernburg et al. 5. Dit protocol werd ontworpen om optimale voorwaarden te scheppen voor probe hybridisatie met de eicel gecondenseerde chromosomen, maar het oorspronkelijke protocol niet optimaal voor immunofluorescentie. De hierboven beschreven werkwijze omvat aanpassingen die we hebben gemaakt antilichaam kleuring van α-tubuline, dat vooral gebruiken we bij het uitvoeren FISH verbeteren. Voor andere antilichamen, verlagen van de temperatuur van de denaturatiestap (Stap 7.5) van 80 ° C nodig zijn.
De hier genoemde probes zijn voor derepetitieve sequenties in de heterochromatine nabij de centromeren. Omdat deze sequenties zeer repetitief, de probes hybridiseren meerdere plaatsen en collectief signalen vrij sterk. We hebben weinig succes met probes voor sequenties in het euchromatin was, mogelijk door de unieke structuur van de chromosomen, terwijl in het gecondenseerde karyosome.
Imaging
Volwassen Drosophila eicellen, zoals de eicellen van de meeste organismen, zijn groot, enkele cellen. Dat betekent dat er een grote hoeveelheid cytoplasma dat een kern bevat. Gelukkig is dit kern, ook bekend als karyosome in Drosophila, kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als het meestal ligt net onder de dorsale aanhangsels nabij de cortex. De dorsale aanhangsels worden verwijderd, samen met de eicel membranen, maar de karyosome kan nog steeds worden gelokaliseerd door het vinden van de kleine graszode in de eicel cortex waar de aanhangsels oNVU waren. De beste foto's worden verkregen uit eicellen die zijn gemonteerd met dit divot uitzicht op de dekglaasje, aangezien hierdoor de karyosome het dichtst bij de doelstelling. Hoewel het mogelijk kan zijn de eicellen in deze oriëntatie te regelen vóór montage we liever veel oöcyten willekeurig monteren en zoek vervolgens de slede voor die in de voorkeursoriëntatie.
toekomstige toepassingen
In de toekomst zal het van belang zijn markers die betrouwbaar onderscheiden prometaphase I en metafase ik spindels identificeren. Het kunnen betrouwbaarder stadium de eicellen de afhankelijkheid arbeidsintensiever alternatieven, zoals het afbeelden van een groot aantal fasen verrijkte eicellen en levende beeldvorming, wat ook zijn staging te verminderen. Deze methode is een basismethode die kan worden gebruikt om te profiteren van de vooruitgang in Drosophila genetica nemen nieuwe instrumenten ter beschikking te wijzigen of verdringen genproducten worden. Dit omvat werkwijzendirect doeleiwit activiteit nieuwe geneesmiddelen of gerichte afbraak strategieën. Bovendien zijn deze werkwijzen niet beperkt tot meiotische spindels beeldvorming. Elke structuur binnen de eicel, zoals actine cytoskelet, kan worden geanalyseerd met behulp van deze werkwijzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tubes | Various | ||
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC | Sigma | F2168 | clone DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| dextran sulfate | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| graduated 1.5 ml tubes | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| magnesium chloride | Various | ||
| methanol | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium chloride | Various | ||
| sodium citrate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
References
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
- Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544 (2009).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605 (2015).
- Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
- Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
- Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
- Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).
