Protocol
注：特に断りのない限り、手順は室温で行われます。温度制御インキュベータは、ハエの飼育のための温度を維持するために使用され、特に断りのない限り、交差しています。
1.準備
- ハエを準備します。
- 前中期に富む卵母細胞のコレクション。
- クリア大人は、健康な、若い株式またはクロス培養から飛びます。 25℃で2日間年齢ボトル。
メモ：詳細は、いくつかのクロス文化のために必要とされるかもしれないが、一般的に2人の健康のボトルは、十分であろう。 - 2日後、ボトルから（この時点では0〜2日齢である）〜100〜300人の女性を集めます。女性が処女である必要はありません。バイアルの側に酵母ペーストのDABを追加し、yeastedバイアルに30人の女性と10〜15人の男性それぞれに配置します。 25℃で2日間年齢バイアル。
- クリア大人は、健康な、若い株式またはクロス培養から飛びます。 25℃で2日間年齢ボトル。
- 中期に富む卵母細胞のコレクション。
- 株式やクロスculturから約100〜300人の女性を集めますエス。バイアルの側に酵母ペーストのDABを追加し、yeastedバイアルに30人の女性（無添加の男性と）それぞれを配置します。 25℃で3〜5日間年齢バイアル。
- 前中期に富む卵母細胞のコレクション。
- ソリューションを準備します。
注：特に断りのない限り、溶液は、室温で無期限に保存してもよいです。- 500mMのHEPES、500mMのスクロース、275 mM酢酸ナトリウム、200mMの酢酸カリウム、50mMのグルコース、6mMの塩化マグネシウム、および5mM塩化カルシウム：修飾ロブの緩衝液（5×）を調製します。 7.4にpHを水酸化カリウム：8水酸化ナトリウム：10 N 11を使用してください。濾過により滅菌します。オートクレーブはありません。 -20℃で保管してください。 〜1×ロブの卵母細胞あたりの準備を200mlを調製するために、必要に応じて解凍します。
- 固定ソリューション。
- オプション＃1：ホルムアルデヒド/ヘプタンの固定を準備します。 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えた150mMのスクロース：固定バッファを準備します。使用するには、687.5μlの固定バッファおよび312.5μlの16％ホルムアルデヒドで新鮮作ります卵母細胞の準備あたり。
注意：ドラフト内でホルムアルデヒド溶液を使用しながら、手袋を着用してください。機関のガイドラインに従って廃棄処分してください。 - オプション＃2：ホルムアルデヒド/カコジル酸固定を準備します。修正ミックスを準備：250mMのスクロース、100mMの酢酸カリウム（pHは7.5）、25 mM酢酸ナトリウム（pH 7.0）、および25mM EGTA（pHは8.0）。使用するには、400μlの新鮮なミックスを修正行い、100μlのカリウムカコジル（1 M、pHは7.2）、および卵母細胞の準備あたり500μlの16％ホルムアルデヒド。
注意：カリウムカコジルはヒ素が含まれています。
- オプション＃1：ホルムアルデヒド/ヘプタンの固定を準備します。 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えた150mMのスクロース：固定バッファを準備します。使用するには、687.5μlの固定バッファおよび312.5μlの16％ホルムアルデヒドで新鮮作ります卵母細胞の準備あたり。
- 1×PBS + 1％または0.05％のトリトンX-100：PBS /トリトンX-100を準備します。 4℃で保存。
- 1×PBS、（w / v）の0.5％のBSA、および0.1％のTween-20：PBS-Tween 20で、ウシ血清アルブミン（BSA）（PTB）を準備します。一週間4℃で保存してもよいです。
- in situハイブリダイゼーション（FISH）ソリューションでは 、蛍光。
- 調製20X塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（SSC）：3 M塩化ナトリウムおよび0.3 Mクエン酸ナトリウムを。
- 調製2×SSC、トゥイーン20（SSCT）：2×SSC + 0.1％のTween-20。卵母細胞の準備あたり新鮮な、〜20ミリリットルを加えます。
- 準備ホルムアミド溶液：2×SSC、0.1％Tween-20を加えホルムアミド。 1 mlの20％ホルムアミド0.5mlの40％ホルムアミド、および卵母細胞の準備につき2 50mlの％ホルムアミド、新鮮します。
注意：ドラフト内でホルムアミド溶液を使用しながら、手袋を着用してください。機関のガイドラインに従って廃棄処分してください。 - （w / v）の2×SSC、50％ホルムアミド、10％硫酸デキストラン：ハイブリダイゼーション溶液を調製します。 4℃で保存。
- FISHプローブ。
- 注文HPLC精製を有するオリゴヌクレオチド（配列については表1を参照）、5 '蛍光修飾（ 例えば 、Cy3またはCy5の）を希望します。 50 ngの/μlのでトリスEDTA（TE）で再懸濁します。
注：すべての回で、露光からオリゴを保護します。
- 注文HPLC精製を有するオリゴヌクレオチド（配列については表1を参照）、5 '蛍光修飾（ 例えば 、Cy3またはCy5の）を希望します。 50 ngの/μlのでトリスEDTA（TE）で再懸濁します。
後期ショウジョウバエ卵母細胞の2コレクション
- として
- 二酸化炭素がすべて〜100〜300 yeastedハエを麻酔し、〜100ミリリットル1×ロブのバッファーを含むブレンダーに追加します。パルス3回（約1秒ずつ）。活性化を避けるために、<20分間ロブの中で卵母細胞を保管してください。
注：別の方法として、卵母細胞が雌から手で解剖することができます。この方法の利点は、以下の女性を必要とすることです。しかし、ケアは、低酸素状態7に関連したアーチファクトを回避するためにわずか数分に二酸化炭素への曝露を制限するように注意する必要があります。- 大きな身体の部分を除去するために、250ミリリットルのビーカーに大きなメッシュ（〜1500ミクロン）を通して濾過。多くの無傷の腹部には、追加のロブのバッファを使用して、メッシュ、再研削材上に残り、再びフィルタする場合。その後、できるだけ大きな体の部分の多くを取り除く、最上層を吸引する、〜2分の決済をしてみましょう。
- Fiの250ミリリットルのビーカーに小さなメッシュ（〜300ミクロン）を通してLTER。追加のロブのコーティングされたパスツールピペットを用いて、第1のビーカーのうち残りの卵母細胞を洗浄します。整が〜3分してみましょう。卵母細胞が沈降します。すべてしかし〜10ミリリットルを吸引除去。
- コーティングされた5ミリリットルのチューブに収まるように10ミリリットルの限りを注ぎます。 、落ち着く液体を除去し、残りは繰り返してみましょう。追加のロブのコーティングされたパスツールピペットを用いてビーカーのうち、残りの卵母細胞を洗浄します。 〜3-5分間5ミリリットルチューブに定住してみましょう。
- 二酸化炭素がすべて〜100〜300 yeastedハエを麻酔し、〜100ミリリットル1×ロブのバッファーを含むブレンダーに追加します。パルス3回（約1秒ずつ）。活性化を避けるために、<20分間ロブの中で卵母細胞を保管してください。
3.薬品による治療（オプション）
- コート各卵母細胞の準備のためのPTBと第2の5 mlのチューブ。各卵母細胞分取（ 表2）のために1ミリリットルロブのそれぞれに適切な溶媒（対照）または薬剤を追加します。
- 第二のコーティングされた5ミリリットルチューブに分割した卵母細胞。沈降は、液体を除去し、1チューブ及び第二のチューブに1ミリリットルロブのプラス薬物に1ミリリットルロブのプラス溶剤を追加してみましょう。薬物治療（ 表2）のための適切な時間のために章動させます。 Lらが落ち着きます。
4.固定
- 吸引し、オフすべての液体とすぐに1ミリリットル修正を加えます。
- オプション＃1：ホルムアルデヒド/ヘプタン固定（固定緩衝液+ 5％ホルムアルデヒド）。
- ニューテーター上で2.5分間固定してください。 1ミリリットルのヘプタン及びボルテックス1分を追加します。 〜1分で沈降してみましょう。
- すべての液体を除去し、その後PBS 1X 1ミリリットルを追加します。ボルテックス30秒。 〜1分で沈降してみましょう。
- すべての液体を除去し、次いで1×PBSでチューブを埋めます。
注：卵母細胞は、直ちに使用するか、または室温で数時間ニューテーター上で維持することができます。
- オプション＃2：ホルムアルデヒド/カコジル固定（ミックスプラス8％のホルムアルデヒド及び100mMのカコジルを修正）。
- ニューテーター上で6分間固定してください。 2分の決済をしてみましょう。液体を除去し、次いで1×PBSでチューブを埋めます。
注：卵母細胞は、直ちに使用するか、または室温で数時間ニューテーター上で維持することができます。
- ニューテーター上で6分間固定してください。 2分の決済をしてみましょう。液体を除去し、次いで1×PBSでチューブを埋めます。
5.取り外し膜（「ローリング」）
- コーティングされたパスツールピペットを用いて、スライドガラスのつや消し（サンドブラスト）部分に〜500〜1,000卵母細胞を追加します。鉗子を使用して、すべてのボディパーツや異物を取り除きます。卵母細胞を乾燥させないでください。必要に応じて1×PBSを追加します。
- すべての膜が除去されるまで（卵母細胞全体にカバースリップの端をドラッグすると、最も効果的に機能します。）卵母細胞およびそっと「ロール」卵母細胞の上にカバースリップを置き、定期的に必要に応じてより多くの1×PBSを追加し、顕微鏡下で進行状況を確認します。あまりにも多くの圧力が卵母細胞を破壊するように注意してください。
注：唯一の免疫蛍光のために、（または免疫蛍光なし）FISHについては、ステップ6に進み、ステップ7に進みます。
ショウジョウバエ卵母細胞の6抗体染色
- 抽出とブロッキング
- 〜15ミリリットルのPBS / 1％トリトンX-100を含む15ミリリットルコニカルチューブに巻かれた卵母細胞を洗浄します。無未満1.5時間この溶液を超えない2時間で章動卵母細胞。このステップでは、抗体の浸透を可能にします。
- 卵母細胞は、〜2分に解決しましょう。 PBS / 0.05％トリトンX-100を追加し、できるだけ多くの膜と一緒に液体を削除します。
注：膜は、圧延卵母細胞よりも遅いセトリングします。 - 卵母細胞は、〜2分に解決しましょう、その後、液体のすべてが、〜1ミリリットルを削除します。転送卵母細胞を1.5 mlチューブを卒業し、残りの液体を除去します。 1時間ブロッキングし、うなだれるのために1ミリリットルPTBを追加します。
- 抗体染色
- 胚に対する二次抗体の予備吸収。
注：この手順は、ショウジョウバエのタンパク質との非特異的抗体相互作用からバックグラウンド染色を排除します。- 典型的な手順8あたりのショウジョウバエの胚（〜25μl）を収集し、固定します。 -20℃のメタノール中で保管してください。
- 胚からメタノールを除去、800μlのメタノールを加えた200μlの1×PBSを追加し、15分間うなだれます。上清の500μLを削除し、500μlの1×PBSと交換。その後、15分間章動させます。 （洗浄の〜1時間の合計）を2回繰り返し、その後、PTBでフィニッシュ。
注：胚はすぐに使用するか、または室温で数時間ニューテーター上で維持することができます。 - （最終容量は300μlのであろうことを念頭に置いて、ステップ7.4を参照してください。）、液体を除去卵母細胞プレップあたり200μlにPTBで記入し、適切な希釈で蛍光標識された二次抗体を追加章動4℃で一晩（望ましいです）または3〜4時間、室温で。
注：前吸収抗体は、ステップ6.2.4で使用されます。
注：蛍光抗体が追加された後、できるだけ多くの暗闇の中でサンプルを保管してください。
- 、卵母細胞から液体を除去する300μlにPTBで記入し、適切な希釈で一次抗体を追加します。 4℃での章動一晩（望ましい）または3〜4時間、室温で。
- 洗浄は、1ミリリットルPTBで15分間、4回ずつ卵母細胞。
- 削除します卵母細胞からの液体、胚（プレ吸収二次抗体）からの上清200μlを添加します。その後、300μlにPTBでいっぱい。 3〜4時間（好ましく）または4℃で一晩、室温で章動させます。
- 1ミリリットルPTBで15分間、一度卵母細胞を洗浄し、液体を除去。その後、7分間0.5μlのヘキスト33342と500μlのPTBとうなだれるを追加します。
- 1ミリリットルPTBで15分間ずつ二回卵母細胞を洗ってください。
注：卵母細胞は直ちにスライド上に取り付けられてもよいし、撮像のための準備ができるまで4℃でPTBに格納されてもよいです。
- 胚に対する二次抗体の予備吸収。
7. FISH（上記の手順5から続けます）
- 〜15ミリリットル2倍SSCTを含む15ミリリットルコニカルチューブに巻かれた卵母細胞を洗浄します。卵母細胞は、〜2分に解決しましょう。できるだけ多くの膜と一緒に液体すべてが、〜0.5ミリリットルを削除します。
注：膜は、圧延卵母細胞よりも遅いセトリングします。 - 転送は、0.5 mlチューブに卵母細胞および残りの液体を除去します。続いて500μlのを追加および削除20％、40％、および50％ホルムアミドの溶液を、各溶液中に10分間章動。
注：卵母細胞は、ホルムアミドの割合が高いと遅く沈降します。 - 500μlの50％ホルムアミド溶液を加えた後、液体の削除、および1〜5時間、37℃でうなだれます。
注：インキュベーション時間が長いほど、より良いプローブの浸透につながります。 - これ以上の100〜よりμlの卵母細胞を残して、液体を除去し、36μlのハイブリダイゼーション溶液を加えたプローブの2μlの（50 ngの/μL）と水の2μlあるいは2 番目のプローブ（ 表1）の2μlを添加します。
- 一晩37℃の水浴中でインキュベートし、続いて3分間（FISHのみ）または20分間（FISHプラス免疫蛍光法）のために80°C、91°Cでインキュベートします。
注：これらの手順は、サーモサイクラーで行うことができます。 - 液体を除去しないでください。 500μlの1時間、37℃で50％ホルムアミド溶液と、うなだれるを追加します。
- 、液体を除去、沈降をしてみましょう500μlの50％ホルムアミド溶液を加え、1時間37℃でdはうなだれます。
- 落ち着くしましょう、液体を除去、500μlの20％ホルムアミド溶液を添加し、10分間室温でうなだれます。
- 500μlの2×SSCT（沈降が、その後、液体を追加し、数回転倒、繰り返しを削除しましょう。）が沈降してみましょう、液体を除去し、4時間500μlのPTBとうなだれるを追加で3クイック回の洗浄を行います。
8.抗体染色FISH後
- 、卵母細胞から液体を除去する300μlにPTBで記入し、FITCにコンジュゲート10μlの抗αチューブリン抗体を追加します。あるいは、他の抗体は、上記のプロトコルに従って、使用することができます。室温で一晩章動させます。
- その後、7分間0.5μlのヘキスト33342と500μlのPTBとうなだれるを追加し、液体を除去し、500μlのPTBとの15分間に一度卵母細胞を洗浄します。
- 500μlのPTBで15分間ずつ二回卵母細胞を洗ってください。
注：卵母細胞は直ちにスライド上に取り付けられてもよいし、準備が整うまで4℃でPTBに格納することができますイメージング。暗闇の中で卵母細胞を蛍光抗体が追加された後、可能な限りにしてください。
| 繰り返し名前 | 染色体 | オリゴ配列* |
| 359 | バツ | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| ドデカ | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1.686 | 2 + 3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4（+ Y） | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| *エリック・ジョイス、パーソナル通信、サリバンらから他の配列から359の配列。8 | ||
表1： ショウジョウバエ 動原体繰り返し のためのFISHプローブ 。
| ドラッグ | 溶媒 | ストック濃度 | 最終濃度 | 治療の時間 | 効果 |
| コルヒチン | エタノール | 125 mMの | 150μM | 10分または30分 | 非動原体（10分）9またはすべて（30分）微小管を不安定にします |
| パクリタキセル | DMSO | 10 mMの | 10μM | 10分 | マイクを安定させますrotubules |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 mMの | 25μM | 20分 | オーロラBキナーゼ10を阻害 |
表2：薬物治療。
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Representative Results
我々がここで説明している方法は、減数分裂の三段階を表す後期ショウジョウバエ卵母細胞の収集（ 図1）になります。前期中の卵母細胞はカリオソーム（ 図1A）を取り囲む領域におけるチューブリンシグナルの欠如によって可視である、核膜の存在によって区別されます。前中期は、核膜の崩壊時のスピンドル組み立て後の期間です。前中期の間、カリオソームは離れてメインカリオソーム質量（ 図1B）から4 番目の染色体に頻繁に細長くなって、独特の形状を想定しています。前中期は、 ショウジョウバエの卵母細胞が自然に排卵するまで逮捕れる、中期で締めくくり。中期卵母細胞では、カリオソームは丸い形状（ 図1C）に収納しています。
私たちはここメートル記述しますethodsは、前中期または中期のいずれかで卵母細胞を濃縮するために、ショウジョウバエの雌の産卵の速度を操作することができます。ほぼ完全に産卵を排除処女ショウジョウバエ雌から中期に富んだコレクションまたはコレクションは、主にラウンドカリオソーム（ 図2B）を示しながら、前中期に富んだコレクションから卵母細胞は、頻繁に細長いカリオソーム（ 図2A）を示します。興味深いことに、前中期に富んだコレクションはまた、典型的にショウジョウバエの前中期および中期の間カリオソームとスピンドルの変化の両方が9を卵母ことを示唆し、はるかに堅牢スピンドルを示しています。
図3は、ここで説明する 2つのプロトコルからの代表的な画像を示しています。 αチューブリンに対する抗体（スピンドルを表示するために）、CENP-C（動原体を示すため）、およびINCENPは（中央のスピンドルを示すため）FOで固定した卵母細胞で使用されましたrmaldehyde /ヘプタン（ 図3A）。反復セントロメア2 番目の染色体（AACAC）上の配列と3 番目の染色体（ドデカ）のためのプローブは、FISHプロトコル（ 図3B）によると、ホルムアルデヒド/カコジルで固定した卵母細胞に使用され、αチューブリン抗体で共染色しました。ドデカプローブは、染色体ごとに単一の焦点として表示されている間、AACACプローブは、複数のクラスタ化された病巣として表示されます。 10分間、150μMのコルヒチンで処理された卵母細胞は、ホルムアルデヒド/ヘプタン（ 図3C）で固定しました。この処理は、動原体で標識された病巣でのDNAと接触するすべての微小管、その結果、ほとんどの非動原体 - 微小管を排除します。 10分間、10μMのパクリタキセルで処理された卵母細胞は、細胞質内に過度の微小管を示しているが、紡錘体微小管（ 図3D）にほとんど影響。のオーロラBキナーゼショーの完全な損失を抑制するために20分間、25μMBinucleine 2で処理された卵母細胞スピンドル微小管（ 図3E）。
図1： 成熟した ショウジョウバエの 卵母細胞 の三段階 ：減数分裂IのDNAは青とチューブリンに示されているの前期、中期、および中期前期におけるショウジョウバエの卵母細胞の共焦点画像（A）、中期（B）、及び中期（C）はマージされた画像内の緑に示します。 （B）及び（C）中の挿入図は、白でDNAを示します。スケールバー=10μmとは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ショウジョウバエの 卵母細胞 のPrometaphase-対中期に富んだコレクション 。前中期に富む（A）からショウジョウバエ卵母細胞の共焦点画像または中期に富む（B）のコレクション。 DNAは青で示されており、チューブリンは緑色で示されています。スケールバー=10μmとは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 抗体染色、FISH、および ショウジョウバエの 卵母細胞 の薬物治療青と緑の中にチューブリン中のDNAとショウジョウバエの卵母細胞の共焦点画像。スケールバー=10μmです。ホルムアルデヒド中（A）免疫蛍光白、赤とCENP-C（動原体）でINCENP（中央スピンドル）付きの電子/ヘプタン固定。 （B）白色で示さ赤とドデカに示すAACACホルムアルデヒド/カコジル固定でFISH。赤で示したCENP-Cで10分間、150μMコルヒチンと（C）治療。 10分（D）または20分（E）のために、25μMBinucleine 210μMのパクリタキセルによる治療。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ショウジョウバエの卵母細胞ステージング
細長いカリオソームは、多くの場合、中期卵母細胞から前中期区別するためにカリオソーム形状を使用して、前中期卵母細胞に見られるが問題となる可能性があります。前中期の間、カリオソームは、丸い形状として始まり伸長し、その後卵母細胞が中期停止に近づくにつれて円形に後退します。これは、多くの前中期の卵母細胞は、細長いカリオソームを持っていないことを意味します。突然変異体または薬剤処理した卵母細胞が検討されている場合に加えて、カリオソーム形状は、卵母細胞を上演するために、このメソッドを使用して排除し、影響を受ける可能性があります。これらの段階を区別する他のマーカーは現在利用できませんので、我々は、卵母細胞前中期または中期のいずれかを濃縮するために、ショウジョウバエの雌の産卵の速度を操作するために上記の方法を使用します。理論的根拠は、卵母細胞は、前中期での特定の時間、および時間ARRの不確定金額を費やす場合ということです遅い産卵は中期のために豊かにする一方で、前中期卵母細胞のより高い割合の方にスキューます産卵し、より迅速な産卵まで続く中期にested。処女雌を収集したり、Gilliland らによって記載されているように、2日間より短い時間枠にわたって、女性を集める。6をするために必要な努力の量は、前中期卵母細胞におけるかなりの増加によって報われていません。背の付属は、膜と一緒に除去されているように、このプロトコルを用いて調製した卵母細胞をステージングする背付属を使用することも不可能です。それは、この方法を用いて100％確実に個々の卵母細胞をステージングすることはできませんが、前中期富化または中期-濃縮されたコレクションからのデータは、これらの異なるステージ9についての結論を引き出すために一緒に撮影することができます。
彼らは卵管を通過するまで、 ショウジョウバエの卵母細胞を受精されていません。したがって、卵母細胞は、番目のために収集しているためここで説明する電子プロトコルは産卵前に撮影した卵母細胞を調べ、これらの卵母細胞が受精していません。卵管の通過も活性化し、細胞周期の進行を再開する卵母細胞が発生します。中期後に細胞周期のステージを調べる方法は、私が11,12の存在が、このプロトコルの範囲外です。
固定方法の検討事項
私たちは、後期ショウジョウバエ卵母細胞の固定のための2つの別々の方法を記載しています。ホルムアルデヒド/カコジル固定方法は、第一Theurkaufおよびハーレイ3に記載されたホルムアルデヒド/ヘプタンの固定方法は、最初にゾウらによって記載された。4。また、第3の方法（メタノール固定）は、いくつかの13で使用されるが、ここでは説明しません。卵母細胞の膜の除去は、ホルムアルデヒド/カコジル酸に比べてホルムアルデヒド/ヘプタン固定後幾分より困難です。これは、依存しているため、「ローリング」でありますカバーガラスと卵母細胞、およびホルムアルデヒド/ヘプタン固定の間の摩擦にsが卵母細胞がより滑りやすいことができます。それは我々がしようとした抗体の大部分を最高の動作するため、この追加された困難にもかかわらず、新しい抗体をテストする固定方法の私たちの最初の選択肢は、ホルムアルデヒド/ヘプタンです。ホルムアルデヒド/ヘプタン固定も成功しているが、一方で、我々は、主に膜の除去を容易にするために、FISHのためのホルムアルデヒド/カコジル固定を好みます。これらの方法はいずれも、メタノール固定よりも優れた卵母細胞の形態を維持するため、我々は唯一のホルムアルデヒド系固定方法に難治性である抗体の例にはメタノール固定をお勧めします。
ここで説明するプロトコルは、すなわち、卵母細胞膜の除去によって、抗体の浸透に適し成熟したショウジョウバエの卵母細胞をレンダリングするための効果的な方法を実証するために、固定されたイメージングに焦点を当てます。膜レモのための代替方法（鉗子14または超音波処理13を使用して）valが可能です。しかし、私たちは、「ローリング」は、最も効率的で信頼性の高い方法であることがわかりました。ライブイメージングのための技術はまた、他の場所で14-16を説明し、このプロトコルの範囲外でされています。
FISHの推奨事項
ショウジョウバエの卵母細胞におけるFISHは、もともとデルンブルクらによって記載された。5。このプロトコルは、凝縮した卵母細胞の染色体へのプローブのハイブリダイゼーションのための最適な条件を提供するように設計されたが、元のプロトコルは、免疫蛍光のために最適ではなかったです。上記の方法は、私たちが主にFISHを行うときに私たちが使用しているものであるαチューブリンの抗体染色を強化するために作られている適応を含んでいます。他の抗体については、80°Cで変性ステップ（ステップ7.5）の温度を低下させることが必要であり得ます。
ここに記載されているプローブは、のためのものです動原体の近くに異質で反復配列。これらの配列は高度に反復されているので、プローブは、複数の場所にアニールし、集団の信号が非常に強いです。凝縮カリオソームに含まれている間私たちは、おそらく染色体のユニークな構造のため、ユークロマチン中の配列のためのプローブではほとんど成功を収めています。
イメージング
成熟したショウジョウバエの卵母細胞は、ほとんどの生物の卵母細胞のように、大規模な、単一細胞です。すなわち、単一の核を含有する細胞質の大容量があることを意味します。それは一般的にちょうど皮質に近い背付属の下に配置されるように幸いなことに、また、 ショウジョウバエのカリオソームとして知られるこの核は、容易に識別することができます。背の付属は、卵母細胞膜と一緒に削除されますが、カリオソームはまだ付属のO卵母細胞の皮質に小さなくぼみを見つけることによって配置することができますNCEました。最高の画像は、この目的に最も近いカリオソームを配置するため、カバーガラスに面したこのディボットが搭載されてきた卵母細胞から得られます。それは前の取付にこの向きで卵母細胞を配置することが可能かもしれないが、我々はランダムに多くの卵母細胞をマウントしてから、好ましい方向でそれらのためのスライドを検索することを好みます。
将来の応用
将来的には確実に前中期Iおよび中期Iスピンドルを区別するマーカーを同定することが重要になります。より確実に、このような、また、そのステージング問題を抱えている段階に富む卵母細胞またはライブイメージング、多数の画像化など、より労働集約的な代替、への依存を軽減します卵母細胞を上演することができます。このメソッドは、新しいツールが変更または遺伝子産物をノックアウトするために利用可能になったショウジョウバエ遺伝学の進歩を活用するために使用することができる基本的な方法です。これは、メソッドが含まれてい直接新薬または標的劣化戦略とタンパク質の活性を標的にします。また、これらの方法は、減数分裂紡錘体を画像化に限定されるものではありません。卵母細胞内の任意の構造は、アクチン細胞骨格のように、これらの方法を用いて分析することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tubes | Various | ||
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC | Sigma | F2168 | clone DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| dextran sulfate | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| graduated 1.5 ml tubes | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| magnesium chloride | Various | ||
| methanol | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium chloride | Various | ||
| sodium citrate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
References
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