Protocol
Note: Prosedyrene blir utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Temperaturstyrt inkubatorer brukes til å opprettholde temperaturer for fly oppdrett og krysser med mindre annet er angitt.
1. Forberedelser
- Forbered Fluer.
- Prometafase-beriket oocytten samlinger.
- Clear voksen flyr fra friske, unge lager eller kryss kulturer. Alder flasker for to dager ved 25 ° C.
MERK: Vanligvis to friske flasker vil nok, selv om flere kan være nødvendig for noen kryss kulturer. - Etter to dager, samle ~ 100 til 300 kvinner (som er 0 til 2 dager gammel på dette punkt) fra flaskene. Hunnene trenger ikke å være jomfruer. Legg en skvett av gjær lim til siden av en ampulle og plassere 30 kvinner og 10 til 15 menn hver inn i yeasted ampuller. Alder ampuller for to dager ved 25 ° C.
- Clear voksen flyr fra friske, unge lager eller kryss kulturer. Alder flasker for to dager ved 25 ° C.
- Meta-beriket eggcelle samlinger.
- Samle ~ 100 til 300 kvinner fra lager eller kryss cultures. Legg en skvett av gjær lim til siden av en ampulle og plassere 30 kvinner hver (uten hanner lagt til) inn i yeasted ampuller. Alder ampuller for tre til fem dager ved 25 ° C.
- Prometafase-beriket oocytten samlinger.
- Forbered Solutions.
Merk: Oppløsningen kan oppbevares i ubegrenset tid ved værelsetemperatur, med mindre annet er angitt.- Forbered Modifisert Robb Buffer (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sukrose, 275 mM natriumacetat, 200 mM kaliumacetat, 50 mM glukose, 6 mM magnesiumklorid, og 5 mM kalsiumklorid. Bruk 10 N 11: 8 natriumhydroksid: kaliumhydroksid for å bringe pH til 7,4. Steriliser ved filtrering; Ikke autoklaver. Oppbevar ved -20 ° C. Tine som trengs for å forberede ~ 200 ml 1x Robb per eggcelle prep.
- Feste Solutions.
- Alternativ # 1: Forbered formaldehyd / heptan fiksering. Forbered Fiksering Buffer: 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) og 150 mM sukrose. Hvis du vil bruke, lage fersk med 687.5 mL Fixation buffer og 312,5 mL 16% formaldehydper eggcelle prep.
FORSIKTIG: Bruk hansker når du bruker formaldehyd løsninger i en avtrekkshette. Kast avfall i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Alternativ # 2: Forbered formaldehyd / cacodylat fiksering. Forbered Fix-miks: 250 mM sukrose, 100 mM kaliumacetat (pH 7,5), 25 mM natriumacetat (pH 7,0), og 25 mM EGTA (pH 8,0). Hvis du vil bruke, lage fersk med 400 mL Fix Mix, 100 ul kaliumkakodylat (1 M, pH 7,2), og 500 mL 16% formaldehyd per eggcelle prep.
FORSIKTIG: kaliumkakodylat inneholder arsenikk.
- Alternativ # 1: Forbered formaldehyd / heptan fiksering. Forbered Fiksering Buffer: 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) og 150 mM sukrose. Hvis du vil bruke, lage fersk med 687.5 mL Fixation buffer og 312,5 mL 16% formaldehydper eggcelle prep.
- Forbered PBS / Triton X-100: 1 x PBS pluss 1% eller 0,05% Triton X-100. Oppbevar ved 4 ° C.
- Fremstille PBS-Tween 20-bovint serumalbumin (BSA) (PTB): 1 x PBS, 0,5% BSA (w v /), og 0,1% Tween-20. Kan lagres ved 4 ° C i en uke.
- Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH) Solutions.
- Forbered 20X Natriumklorid-Sodium Citrate (SSC): 3 M natriumklorid og 0,3 M natriumsitrat.
- Forbered 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC pluss 0,1% Tween-20. Lag friske, ~ 20 ml per eggcelle prep.
- Forbered formamide løsninger: 2x SSC, 0,1% Tween-20, pluss formamid. Gjøre fersk, 1 ml 20% formamid, 0,5 ml 40% formamid, og 2 ml 50% formamid pr oocytt prep.
FORSIKTIG: Bruk hansker når du bruker formamide løsninger i en avtrekkshette. Kast avfall i henhold til institusjonelle retningslinjer. - Forbered hybridisering løsning: 2x SSC, 50% formamid, og 10% dekstransulfat (w / v). Oppbevar ved 4 ° C.
- FISH prober.
- Bestill oligonukleotider (se tabell 1 for sekvenser) med HPLC rensing og ønsket 5 'fluorescerende modifikasjon (f.eks Cy3 eller Cy5). Resuspender i Tris-EDTA (TE) på 50 ng / ul.
MERK: Beskytt oligos fra lyseksponering til alle tider.
- Bestill oligonukleotider (se tabell 1 for sekvenser) med HPLC rensing og ønsket 5 'fluorescerende modifikasjon (f.eks Cy3 eller Cy5). Resuspender i Tris-EDTA (TE) på 50 ng / ul.
2. Innsamling av sent stadium Drosophila oocytter
- Som
- Anesthetize alle ~ 100 til 300 yeasted fluer med karbondioksid og legge til en blender med ~ 100 ml 1x Robb buffer. Puls tre ganger (~ 1 sek hver). Hold ubefruktede egg i Robb for <20 minutter for å unngå aktivering.
MERK: Alternativt ubefruktede egg kan være hånd dissekert fra kvinner. Fordelen med denne metoden er at den krever mindre hunner. Imidlertid må man sørge for å begrense eksponering for karbondioksid til bare noen få minutter for å unngå gjenstander forbundet med hypoksi 7.- Filtrer gjennom store mesh (~ 1500 mikrometer) i 250 ml beger å fjerne store deler av kroppen. Hvis mange intakte livet forbli på mesh, re-slipe materialet ved hjelp av ekstra Robb Buffer, og filter igjen. La oss avgjøre ~ 2 min, så aspirer av topplaget, fjerne så mange av de store kroppsdeler som mulig.
- Filter gjennom små mesh (~ 300 mikrometer) i en 250 ml begerglass. Skyll resten ubefruktede egg ut av første beger å bruke ekstra Robb og belagt Pasteur pipette. La bosette ~ 3 min; oocytter vil bosette seg. Sug av alle, men ~ 10 ml.
- Helle så mye av de 10 ml som vil passe inn i belagte 5 ml rør. La oss avgjøre, fjerne væske og gjenta med resten. Skyll resten ubefruktede egg ut av begeret å bruke ekstra Robb og belagt Pasteur pipette. La oss slå seg ned i 5 ml tube for ~ 3-5 min.
- Anesthetize alle ~ 100 til 300 yeasted fluer med karbondioksid og legge til en blender med ~ 100 ml 1x Robb buffer. Puls tre ganger (~ 1 sek hver). Hold ubefruktede egg i Robb for <20 minutter for å unngå aktivering.
3. medikamentelle behandlinger (valgfritt)
- Coat en andre 5 ml tube med PTB for hver eggcelle prep. Legg passende oppløsningsmiddel (kontroll) eller medikament til 1 ml Robb er hver for hver eggcelle prep (tabell 2).
- Split ubefruktede egg i andre belagt 5 ml tube. La bosette, fjerne væske og tilsett 1 ml Robb menn pluss løsemiddel inn en tube og 1 ml Robb er pluss narkotika inn i andre røret. Nutere for passende tid for medikamentell behandling (tabell 2). Let bosette.
4. Fixation
- Sug ut all væske og umiddelbart legge en ml Fix.
- Alternativ # 1: Formaldehyd / heptan fiksering (Fixation buffer pluss 5% formaldehyd).
- Fix 2,5 min på en nutator. Tilsett 1 ml heptan og virvle 1 min. La bosette ~ 1 min.
- Fjern all væske, og deretter legge til 1 ml 1x PBS. Vortex 30 sek. La bosette ~ 1 min.
- Fjern all væske, og deretter fylle røret med 1x PBS.
MERK: oocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevares på nutator i flere timer ved romtemperatur.
- Alternativ # 2: Formaldehyd / cacodylat fiksering (Fiks Mix pluss 8% formaldehyd og 100 mM cacodylat).
- Fix for 6 min på en nutator. La bosette 2 min. Fjern væske, og deretter fylle røret med 1x PBS.
MERK: oocytter kan brukes umiddelbart eller oppbevares på nutator i flere timer ved romtemperatur.
- Fix for 6 min på en nutator. La bosette 2 min. Fjern væske, og deretter fylle røret med 1x PBS.
5. Fjerning Membraner ( "Rolling")
- Bruke belagt Pasteur pipette, tilsett ~ 500 til 1000 eggceller til frostet (sandblåst) en del av et glass lysbilde. Fjern alle kroppsdeler og overflødig materiale ved hjelp av tang. Ikke la ubefruktede egg tørke ut; legge til 1 x PBS som nødvendig.
- Plasser et dekkglass på toppen av ubefruktede egg og forsiktig "rulle" ubefruktede egg inntil alle membraner er fjernet (dra kanten av dekkglass over eggceller som fungerer best.) Med jevne mellomrom sjekke fremdriften under mikroskop, og legger mer 1x PBS som nødvendig. Ta vare så altfor mye press vil ødelegge eggceller.
MERK: For immunfluorescens bare fortsette med trinn 6. For FISH (med eller uten immunofluorescence), fortsett med trinn 7.
6. Antistoff Farging av Drosophila oocytter
- Utvinning og Blokking
- Skyll valsede oocytter til et 15 ml konisk rør inneholdende ~ 15 ml PBS / 1% Triton X-100. Nutere oocytter i denne løsningen for ikke mindre enn 1,5 timer og ikke mer enn 2 timer.Dette trinnet kan antistoff penetrasjon.
- La oocytter bosette ~ 2 min. Fjerne væske sammen med så mange membraner som mulig, og deretter legge PBS / 0,05% Triton X-100.
MERK: Membraner vil bosette tregere enn rullet eggceller. - La oocytter bosette ~ 2 min, og deretter fjerne alle unntatt ~ 1 ml væske. Overfør eggceller til gradert 1,5 ml tube og fjerne gjenværende væske. Tilsett 1 ml PTB for blokkering og nutere i 1 time.
- antistoff Farging
- Pre-absorpsjon av sekundære antistoffer mot embryoer.
MERK: Dette trinnet eliminerer bakgrunnsfarging fra ikke-spesifikke antistoff interaksjoner med Drosophila proteiner.- Samle og fikse Drosophila embryoer (~ 25 mikroliter) per vanlig prosedyre 8. Oppbevar i metanol ved -20 ° C.
- Fjern metanol fra embryoer, tilsett 800 mL metanol pluss 200 mL 1x PBS, og nutere i 15 min. Fjern 500 mL av supernatant og erstatte med 500 mL 1x PBS. Deretter nutere i 15 min. Gjenta to ganger (for totalt ~ 1 time av vasker), og deretter ferdig med PTB.
MERK: Befruktede egg kan brukes umiddelbart eller oppbevares på nutator for flere timer ved romtemperatur. - Fjern væske, fyll med PTB 200 mikroliter per eggcelle prep, og legge fluorescensmerket-merket sekundære antistoffer ved passende fortynninger (husk at den endelige volum blir 300 mL, jf. Trinn 7.4) nutere ved 4 ° C over natten (fortrinnsvis) eller ved romtemperatur i 3 til 4 timer.
MERK: De forhånds absorbert antistoffer vil bli brukt i trinn 6.2.4.
MERK: Hold prøvene i mørket så mye som mulig når fluorescerende antistoffer har blitt lagt til.
- Fjern væske fra oocytter, fyll med PTB 300 gl, og legge primære antistoffer ved passende fortynninger. Nutere ved 4 ° C natten over (fortrinnsvis) eller ved romtemperatur i 3 til 4 timer.
- Vask Oocytter fire ganger i 15 minutter hver med 1 ml PTB.
- Fjernevæske fra oocytter, tilsett 200 mL av supernatant fra embryoer (pre-absorbert sekundære antistoffer). Deretter fyller med PTB til 300 mL. Nutere ved romtemperatur i 3 til 4 timer (fortrinnsvis) eller ved 4 ° C over natten.
- Vask ubefruktede egg en gang i 15 minutter med 1 ml PTB, fjerne væske. Deretter legger 0,5 mL Hoechst 33342 og 500 mL PTB og nutere for 7 min.
- Vask ubefruktede egg to ganger i 15 minutter hver med en ml PTB.
MERK: Oocytter kan være montert på et lysbilde umiddelbart eller kan lagres i PTB ved 4 ° C inntil de er klare for avbildning.
- Pre-absorpsjon av sekundære antistoffer mot embryoer.
7. FISH (Fortsett fra trinn 5 ovenfor)
- Skyll rullet ubefruktede egg inn i en 15 ml konisk rør som inneholder ~ 15 ml 2x SSCT. La oocytter bosette ~ 2 min. Fjerne alle unntatt ~ 0,5 ml væske sammen med så mange membraner som mulig.
MERK: Membraner vil bosette tregere enn rullet eggceller. - Overføring oocytter til 0,5 ml rør og fjerne gjenværende væske. Stadig legge til og fjerne 500 mL20%, 40% og 50% formamid løsninger, vippende i 10 minutter i hver løsning.
MERK: oocytter vil bosette tregere med høyere prosenter av formamide. - Fjerne væske, så tilsett 500 ul 50% formamid-oppløsning, og nutere ved 37 ° C i 1 til 5 timer.
MERK: Lengre inkubasjoner resultere i bedre probe penetrasjon. - Fjerne væske, etterlater ikke mer enn ~ 100 mL oocytter, og tilsett 36 pl hybridiseringsoppløsning pluss 2 ul av probe (50 ng / pl) og 2 pl av vann eller 2 ul av en 2 nd probe (tabell 1).
- Inkuber ved 91 ° C i 3 minutter (bare FISH) eller 80 ° C i 20 min (FISH pluss immunofluorescens), fulgt av inkubering i et 37 ° C vannbad over natten.
MERK: Disse trinnene kan utføres i et termo. - Ikke fjern væske. Tilsett 500 ul 50% formamid-oppløsning og nutere ved 37 ° C i 1 time.
- La bosette, fjerne væske, tilsett 500 mL 50% formamid løsning, end nutere ved 37 ° C i 1 time.
- La Settle, fjerne væske tilsettes 500 pl 20% formamid-oppløsning, og nutere ved romtemperatur i 10 min.
- Utfør tre raske vasker i 500 mL 2x SSCT (la bosette, fjern deretter legge til væske, snu flere ganger, gjenta.) La bosette, fjerne væske, legg deretter til 500 mL PTB og nutere i 4 timer.
8. Antistoff Farging etter FISH
- Fjern væske fra oocytter, fyll med PTB 300 gl, og tilsett 10 mL anti-α-tubulin antistoff konjugert til FITC. Alternativt kan andre antistoffer anvendes, etter ovennevnte protokoll. Nutere ved romtemperatur over natten.
- Vask ubefruktede egg en gang i 15 min med 500 mL PTB, fjerne væske, så tilsett 0,5 mL Hoechst 33342 og 500 mL PTB og nutere for 7 min.
- Vask oocytter to ganger i 15 minutter hver med 500 ul PTB.
MERK: Oocytter kan være montert på et lysbilde umiddelbart eller kan lagres i PTB ved 4 ° C inntil de er klare forbildebehandling. Hold oocytter i mørket så mye som mulig når fluorescerende antistoffer har blitt lagt til.
| Gjenta navn | kromosom | Oligo Sequence * |
| 359 | x | GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC |
| AACAC | 2 | AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC |
| dodeca | 3 | CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT |
| 1,686 | 2 + 3 | AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG |
| AATAT | 4 (+ Y) | AATATAATATAATATAATATAATATAATAT |
| * 359 sekvens fra Eric Joyce, personlig kommunikasjon, andre sekvenser fra Sullivan et al. 8 | ||
Tabell 1: FISH prober for Drosophila centromeric gjentas.
| Legemiddel | Løsemiddel | Stock konsentrasjon | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP | Tidspunkt for behandling | Effekt |
| kolkisin | etanol | 125 mm | 150 mikrometer | 10 minutter eller 30 minutter | destabilisere ikke-kinetochore (10 min) 9 eller alle (30 min) mikrotubuli |
| paclitaxel | DMSO | 10 mm | 10 mikrometer | 10 min | stabilisere microtubules |
| Binucleine 2 | DMSO | 25 mm | 25 mikrometer | 20 min | hemme Aurora B kinase 10 |
Tabell 2: Narkotika behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodene vi har beskrevet her vil resultere i samlingen av sene stadier av Drosophila ubefruktede egg som representerer tre stadier av meiose (figur 1). Oocytter i prophase kjennetegnes ved nærværet av den kjernefysiske konvolutten, som er synlig ved mangelen på tubulin signal i det området som omgir karyosome (figur 1A). Prometafase er perioden etter atom konvolutt sammenbrudd der spindel setter sammen. Under prometafase antar karyosome en særegen form, blir forlenget ofte med de 4 th kromosomer bortsett fra hoved karyosome masse (figur 1B). Prometafase konkluderer med meta, der Drosophila eggceller naturlig arrestere til eggløsning. I metafase oocytter har karyosome trukket tilbake inn i en rund form (figur 1C).
Vi beskriver her methods å manipulere hastigheten på egg-legging av Drosophila kvinner å berike for oocytter enten i prometafase eller metafase. Ubefruktede egg fra prometafase-beriket samlinger ofte viser det langstrakte karyosome (figur 2A) mens metafase-beriket samlinger eller samlinger fra jomfru Drosophila kvinner, som nesten helt eliminerer egg-legging, først og fremst viser det runde karyosome (figur 2B). Interessant, prometafase-beriket samlinger også vanligvis vise mye mer robust spindler, noe som tyder på at både karyosome og spindel endring mellom prometafase og meta i Drosophila oocytter 9.
Figur 3 viser representative bilder fra de to protokollene som er beskrevet her. Antistoffer mot α-tubulin (for å vise spindelen), CENP-C (for å vise sentromerer), og INCENP (for å vise den sentrale spindelen) ble brukt på oocytter fiksert med formaldehyde / heptan (figur 3A). Prober for repeterende centromeric sekvenser på 2 nd kromosom (AACAC) og 3 rd kromosom (dodeka) ble anvendt på oocytter fiksert med formaldehyd / cacodylat og ko-farget med en α-tubulin-antistoff i henhold til den FISH-protokollen (figur 3B). Den AACAC probe ser ut som flere gruppert foci mens dodeca sonden fremstår som ett fokus per kromosom. Oocytter ble behandlet med 150 uM kolkisin i 10 minutter ble fiksert med formaldehyd / heptan (figur 3C). Denne behandlingen fjerner de fleste ikke-kinetochore-mikrotubuli, noe som resulterer i alle mikrotubuler kontakter DNA ved cent-merket foci. Oocytter ble behandlet med 10 uM paclitaxel i 10 min overdrevent mikrotubuler i cytoplasma, men liten virkning på spinde mikrotubuli (figur 3D). Oocytter behandlet med 25 mikrometer Binucleine 2 for 20 min å hemme Aurora B kinase showet fullstendig tap avspindel mikrotubuli (Figur 3E).
Figur 1: Tre stadier av modne Drosophila oocytter:. Prophase er prometafase, og meta Confocal bilder av Drosophila ubefruktede egg i prophase (A), prometafase (B), og metafase (C) av meiose I. DNA vist i blått og tubulin er vist i grønt i fusjonerte bilder. Innfellinger i (B) og (C) viser DNA i hvitt. Skala barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:Prometaphase- vs. metafase-beriket samlinger av Drosophila ubefruktede egg. Confocal bilder av Drosophila ubefruktede egg fra prometafase-beriket (A) eller metafase-beriket (B) samlinger. DNA er vist i blått og tubulin er vist i grønt. Skala barer = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Antistoff flekker, fisk og medikamentell behandling av Drosophila oocytter Confocal bilder av Drosophila ubefruktede egg med DNA i blått og tubulin i grønt.. Skala barer = 10 mikrometer. (A) Immunofluorescence i formaldehyde / heptan fiksering med INCENP (sentral spindel) i rødt og CENP-C (sentromerer) i hvitt. (B) FISH i formaldehyd / cacodylat fiksering med AACAC vises i rødt og dodeca vist i hvitt. (C) Behandling med 150 uM kolkisin i 10 minutter med CENP-C er vist i rødt. Behandling med 10 mm paclitaxel i 10 min (D) eller 25 mikrometer Binucleine 2 for 20 min (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Staging Drosophila oocytter
Selv om en langstrakt karyosome er ofte sett i prometafase oocytter, ved hjelp karyosome form til å skille prometafase fra meta ubefruktede egg kan være problematisk. Under prometafase begynner karyosome som en rund form, elongates, og deretter trekker til en rund form som eggcelle nærmer seg metafase arrest. Dette betyr at mange prometafase ubefruktede egg ikke har en langstrakt karyosome. I tillegg, hvis mutante eller medikamentbehandlede ubefruktede egg er undersøkt, karyosome form kan bli berørt, utelukker å bruke denne metoden for å iscenesette oocytter. Fordi andre markører for å skille disse stadiene er ikke tilgjengelig for øyeblikket, bruker vi metoden som er beskrevet ovenfor for å manipulere hastigheten på egg-legging av Drosophila kvinner å berike for oocytter enten i prometafase eller metafase. Begrunnelsen er at hvis oocytter bruke en bestemt tidsperiode i prometafase, og en ubestemt tidsperiode arrsert i metafase, som varer fram til egglegging, deretter raskere egglegging vil skew mot en høyere prosentandel av prometafase ubefruktede egg, mens tregere egglegging vil berike for metafase. Hvor mye innsats som kreves for å samle virgin kvinner eller samle kvinner over en kortere tidsramme enn 2 dager, som beskrevet av Gilliland et al. 6, ikke blir belønnet med en betydelig økning i prometafase oocytter. Det er også umulig å bruke rygg vedheng til scenen oocytter tilberedt med denne protokollen som rygg vedheng fjernes sammen med membraner. Selv om det ikke er mulig å iscenesette individuelle oocytter med 100% sikkerhet ved hjelp av denne metoden, data fra prometafase-beriket eller metafase-beriket samlingene kan tas sammen for å trekke konklusjoner om disse forskjellige stadier 9.
Drosophila ubefruktede egg er ikke befruktet før de passerer gjennom egglederen; derfor, fordi oocyttene oppsamlet for the protokollen beskrevet her undersøke eggceller tatt før egglegging, har disse ubefruktede egg ikke blitt befruktet. Passasje gjennom egglederen bevirker også eggcelle for å aktivere og gjenoppta cellesyklusprogresjon. Metoder for å undersøke cellesyklus stadier etter meta jeg eksisterer 11,12, men er utenfor omfanget av denne protokollen.
Festemetode Betraktninger
Vi beskriver to separate metoder for fiksering av sene stadier av Drosophila eggceller. Den formaldehyd / cacodylat fiksering metoden ble først beskrevet av Theurkauf og Hawley 3 og formaldehyd / heptan fiksering metoden ble først beskrevet av Zou et al. 4. I tillegg er en tredje metode (metanol fiksering) som brukes av noen 13, men som ikke er beskrevet her. Fjerning av oocytten membraner er noe mer vanskelig etter formaldehyd / heptan fiksering i forhold til formaldehyd / cacodylat. Dette er fordi "rulle" avhenges på friksjon mellom dekkglass og eggcelle, og formaldehyd / heptan fiksering gjør eggceller glattere. Til tross for dette lagt vanskeligheter, vårt førstevalg for fiksering metode ved testing av nye antistoffer er formaldehyd / heptan fordi det fungerer best for de fleste av antistoffer som vi har prøvd. På den annen side foretrekker vi formaldehyd / cacodylat fiksering for FISH, først og fremst for å lette fjerning av membranen, selv om formaldehyd / heptan fiksering har også vært vellykket. Begge disse metodene bevare oocytt morfologi bedre enn metanol fiksering, og derfor anbefales metanol fiksering bare i tilfeller av antistoffer som er motstandsdyktige overfor formaldehydbaserte fiksering.
Protokollen beskrevet her fokusere på fast avbildning, for å demonstrere effektive metoder for å gjengi modne oocytter Drosophila mottagelig for antistoff penetrasjon, nemlig ved fjerningen av oocytten membraner. Alternative metoder for membran removal (ved hjelp av tenger 14 eller sonikering 13) er mulig; det imidlertid funnet å "rulle" for å være den mest effektive og pålitelige metode. Teknikker for live avbildning er også beskrevet andre steder 14-16 og er utenfor omfanget av denne protokollen.
FISH Anbefalinger
FISH i Drosophila oocytter ble opprinnelig beskrevet av Dernburg et al. 5. Denne protokollen er designet for å gi optimale forhold for probe hybridisering til det sammendratte oocytten kromosomer, men den opprinnelige protokollen var ikke optimal for immunfluorescens. Metoden er beskrevet ovenfor omfatter tilpasninger vi har gjort for å forbedre antistoff farging av α-tubulin, som først og fremst er det vi bruker når du utfører FISH. For andre antistoffer, senke temperaturen i denaturering trinnet (trinn 7.5) fra 80 ° C kan være nødvendig.
Sondene som er oppført her er for denrepeterende sekvenser i heterochromatin nær sentromerer. Fordi disse sekvensene er svært repeterende, sondene binde til flere steder, og de kollektive signalene er ganske sterk. Vi har hatt liten suksess med prober for sekvenser i eukromatin, muligens på grunn av den unike konstruksjon av kromosomene mens som inneholdes i den kondenserte karyosome.
Imaging
Moden Drosophila oocytter, som oocyttene av de fleste organismer, er store, enkeltceller. Det betyr at det er et stort volum av cytoplasma som inneholder en enkelt kjerne. Heldigvis er denne kjernen, også kjent som en karyosome i Drosophila, kan lett identifiseres som det vanligvis er plassert like under dorsal vedheng nær cortex. De dorsale vedheng blir fjernet sammen med oocytten membraner, men det karyosome kan fortsatt være lokalisert ved å finne det lille divot i en oocytt cortex hvor vedheng once var. De beste bildene er hentet fra ubefruktede egg som har blitt montert med dette divot mot dekk siden dette plasserer karyosome nærmest målet. Selv om det kan være mulig å arrangere de ubefruktede egg i denne retningen før montering, foretrekker vi å montere mange oocytter tilfeldig og deretter søke lysbildet for dem i den foretrukne orientering.
fremtidige Applications
I fremtiden vil det være viktig å identifisere markører som pålitelig skiller prometafase jeg og meta I spindler. Å kunne mer pålitelig iscenesette oocyttene vil redusere avhengigheten av mer arbeidskrevende alternativer, for eksempel bildebehandling stort antall scene-beriket eggceller eller levende avbildning, som også har sin iscenesettelse problemer. Denne fremgangsmåten er en enkel metode som kan brukes til å dra nytte av fremskritt i Drosophila genetikk som nye verktøy blir tilgjengelige for å modifisere eller slå ut genprodukter. Dette omfatter metodertil direkte rettet mot protein aktivitet med nye medikamenter eller målrettede nedbrytnings strategier. I tillegg er disse fremgangsmåter ikke begrenset til, avbilding meiotisk spindler. Enhver struktur innenfor en oocytt, slik som aktin cytoskjelettet, kan analyseres ved hjelp av disse metodene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 ml conical tubes | Various | ||
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | HAZARDOUS; once opened, discard after one month |
| 250 ml beakers | Various | ||
| 5 ml tubes | Various | ||
| active dry yeast | Various | mix with water to make a paste the consistency of peanut butter | |
| anti-α-tubulin antibody conjugated to FITC | Sigma | F2168 | clone DM1A |
| Binucleine 2 | Sigma | B1186 | HAZARDOUS |
| blender | Various | ||
| bovine serum albumin | Sigma | A4161 | |
| calcium chloride | Various | ||
| colchicine | Sigma | C-9754 | HAZARDOUS |
| coverslips | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| dextran sulfate | Various | ||
| DMSO | Various | ||
| EGTA | Various | ||
| ethanol | Various | ||
| forceps | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont tweezers high precision grade style 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| glass slides | VWR | 48312-003 | |
| glucose | Various | ||
| graduated 1.5 ml tubes | Various | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | available from several venders |
| Hoechst 33342 | Various | ||
| magnesium chloride | Various | ||
| methanol | Various | ||
| large mesh (~1,500 µm) | VWR | AA43657-NK | variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh |
| small mesh (~300 µm) | Spectrum labs | 146 424 | variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486 |
| nutator | Various | ||
| Pasteur pipets | Various | ||
| potassium acetate | Various | ||
| Cacodylic acid | Sigma | C0125 | HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted |
| potassium hydroxide | Various | ||
| sodium acetate | Various | ||
| sodium chloride | Various | ||
| sodium citrate | Various | ||
| sodium hydroxide | Various | ||
| sucrose | Various | ||
| taxol (paclitaxel) | Sigma | T1912 | HAZARDOUS |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Various |
References
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
- Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544 (2009).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605 (2015).
- Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
- Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
- Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
- Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).
