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Immunology and Infection

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Published: March 29, 2017 doi: 10.3791/54667
* These authors contributed equally

Summary

I lipidi sono noti per svolgere un ruolo importante nelle funzioni cellulari. Qui, si descrive un metodo per determinare la composizione lipidica di neutrofili, con enfasi sul livello di colesterolo, utilizzando sia HPTLC e HPLC per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi alla base di neutrofili extracellulare formazione trappola.

Abstract

analisi dei lipidi eseguita da cromatografia su strato sottile ad alta prestazione (HPTLC) è un metodo relativamente semplice e conveniente di analizzare una vasta gamma di lipidi. La funzione dei lipidi (ad esempio, nelle interazioni ospite-patogeno o voce host) è stato segnalato per svolgere un ruolo cruciale nei processi cellulari. Qui mostriamo un metodo per determinare la composizione dei lipidi, con una particolare attenzione per il livello di colesterolo neutrofili emoderivati ​​primari, da HPTLC rispetto a cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). L'obiettivo era quello di indagare il ruolo delle alterazioni dei lipidi / colesterolo nella formazione di neutrofili trappole extracellulari (NET). rilascio NET è noto come un meccanismo di difesa dell'ospite per impedire la diffusione di agenti patogeni all'interno dell'ospite. Pertanto, neutrofili umani derivati ​​dal sangue sono stati trattati con metil-β-ciclodestrina (MβCD) per indurre alterazioni lipidiche nelle cellule. Utilizzando HPTLC e HPLC, abbiamo dimostrato che il trattamento MβCD delle cellule porta alla lipidicaalterazioni associate con una significativa riduzione del contenuto di colesterolo della cella. Allo stesso tempo, il trattamento MβCD dei neutrofili ha portato alla formazione di reti, come dimostrato da immunofluorescenza. In sintesi, qui vi presentiamo un metodo dettagliato per studiare alterazioni lipidiche neutrofili e la formazione di reti.

Introduction

I lipidi hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nella omeostasi cellulare, morte cellulare, interazioni ospite-patogeno, e di citochine rilascio 1. Nel corso del tempo, l'interesse e la conoscenza sull'impatto dei lipidi nelle interazioni ospite-patogeno o infiammazioni sono aumentati, e diverse pubblicazioni confermano il ruolo centrale di alcuni lipidi, in particolare il colesterolo di steroidi, in risposte cellulari. trattamento farmacologico con statine, che vengono utilizzati come inibitori della biosintesi del colesterolo bloccando 3-idrossi-3-metilglutaril-Coenzima-A-reduttasi (HMG-CoA reduttasi), può agire come agenti anti-infiammatori abbassando i livelli sierici di interleuchina 6 e proteina C-reattiva 2. Colesterolo e strutture glicosfingolipidi arricchiti possono essere usate da diversi agenti patogeni, come batteri e virus, come un gateway nell'ospite 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Sfingolipidi (ad esempio, sfingomielina) hanno dimostrato di essere utilizzati da patogeni per promuovere la loro patogenicità 7. Nei macrofagi, domini per entrare nelle cellule uso micobatteri colesterolo arricchita; una deplezione di colesterolo inibisce l'assorbimento micobatterica 8. Inoltre, infezione di macrofagi con Francisella tularensis, un agente zoonotico responsabile tularemia (noto anche come febbre dei conigli) 9, ha portato ad un'infezione che è stata abolita quando il colesterolo è stata esaurita dalle membrane 10. Analogamente, l'invasione delle cellule ospiti di Escherichia coli tramite strutture ricche di lipidi è stata dimostrata per essere il colesterolo-dipendente 4. Inoltre, Salmonella typhimurium esperimenti di infezione di cellule epiteliali hanno dimostrato che il colesterolo è essenziale per l'ingresso del patogeno nelle cellule 11. Colesterolo esaurimento inhibited l'assorbimento di Salmonella 11. Inoltre, un recente studio condotto da Gilk et al. ha dimostrato che il colesterolo svolge un ruolo importante nella diffusione di Coxiella burnetti 12. Inoltre, Tuong et al. rilevato che il 25-idrossicolesterolo gioca un ruolo cruciale nella fagocitosi da lipopolisaccaride (LPS) -stimulated macrofagi 13. La fagocitosi è stato ridotto quando i macrofagi sono stati trattati farmacologicamente per esaurire il colesterolo 14. Così, il colesterolo e altri lipidi sembrano giocare un ruolo importante nella infezione e infiammazione, dal momento che il loro esaurimento può ridurre il rischio di invasione da diversi agenti patogeni 10, 11, 12.

Recentemente, siamo stati in grado di dimostrare che alterazioni lipidiche, in particolare l'esaurimento del colesterolo dalla cella, indurre la formazione di spazio extracellulare neutrofilir trappole (NET) in derivati dal sangue umano neutrofili 15. Dalla scoperta del NET nel 2004, essi hanno dimostrato di giocare un ruolo critico nel intrappolamento batterica, e quindi nel ostacolare la diffusione di infezioni 16, 17. NET consistono di una dorsale DNA associato con istoni, proteasi, e peptidi antimicrobici 16. Il rilascio delle reti da neutrofili può essere indotta da patogeni invasori 18, 19 e sostanze chimiche come forbolo miristato-acetato (PMA) o statine 16, 20. Tuttavia, i meccanismi cellulari dettagliati e in particolare il ruolo dei lipidi in questo processo, non sono ancora del tutto chiaro. L'analisi dei lipidi può portare ad una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti in una varietà di processi e interazioni cellulari, come ad esempio il rilascio di NET. Cholesterol e sfingomielina sono costituenti fondamentali della membrana cellulare e lipidi microdomini, dove si aggiungono la stabilità e facilitare il raggruppamento delle proteine coinvolte nel traffico di proteine e gli eventi 21 di segnalazione. Per studiare il ruolo meccanicistico di alcuni lipidi, agenti farmacologici anfifilici, come il ciclico oligosaccaride metil-β-ciclodestrina (MβCD), può essere utilizzato per modificare la composizione lipidica di una cella e per ridurre il colesterolo in vitro 15. Qui vi presentiamo un metodo per utilizzare HPTLC per analizzare la composizione lipidica dei neutrofili in risposta a MβCD. HPLC è stata utilizzata per confermare il livello di colesterolo nella popolazione dei neutrofili. Inoltre, si descrive un metodo per visualizzare la formazione di NET mediante immunofluorescenza microscopia in neutrofili derivati ​​dal sangue umano in risposta a MβCD.

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Protocol

La raccolta di sangue periferico in questo protocollo è stato approvato dalla commissione etica della ricerca umane locale. Tutti i soggetti umani, purché il loro consenso informato scritto.

1. Isolamento dei neutrofili Sangue umano-derivate dal gradiente di densità centrifugazione

  1. Isolamento di neutrofili derivati dal sangue umano
    1. Strato ~ 20 ml di sangue su 20 mL di sodio diatrizoato / soluzione destrano vicino a una fiamma e senza mescolare.
    2. Centrifugare per 30 minuti a 470 xg senza freno.
    3. Rimuovere le cellule mononucleari e lo strato di plasma giallastro. Trasferire la fase cellule polimorfonucleati (PMN) (seconda fase con accumulo cellule; le figure 1 e 2) in un nuovo tubo da 50 ml e riempire fino a 50 ml con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS).
    4. Centrifugare per 10 minuti a 470 xg con freno.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di acqua sterile for 5 s per la lisi degli eritrociti.
    6. Immediatamente riempire fino a 50 ml con PBS 1x e centrifugare per 10 minuti a 470 x g.
    7. Rimuovere il surnatante. Il pellet dovrebbe essere bianco. Se è ancora rosso, ripetere i punti 1.1.5 e 1.1.6.
    8. Risospendere il pellet in 1.000 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) di media. Contare il numero di cellule utilizzando trypan colorazione blu in un emocitometro sotto un microscopio ottico.
    9. Preparare una sospensione di cellule in RPMI ad una concentrazione di 2 x 10 6 / ml. Circa 2,5 x 10 7 neutrofili possono essere raccolte da 20 ml di sangue.
  2. Il trattamento farmacologico dei neutrofili per l'analisi dei lipidi
    1. Utilizzare 5 x 10 7 cellule dal punto 1.1.9. Regolare il numero di cellule in puro soluzione salina bilanciata (HBSS) medium Hank's in presenza o assenza di 10 mM MβCD o 25 nM PMA in un volume totale di 300 microlitri in un tubo di reazione da 1,5 ml.
    2. Incubare i campioni delprovette di reazione per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
    3. Centrifugare per 10 minuti a 470 xg con freno.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 300 ml di HBSS.
    5. Centrifugare per 10 minuti a 470 xg con freno.
    6. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di cloroformio / metanolo (1: 1), omogeneizzare con una cannula da 26 G aspirando il campione in e fuori in una siringa da 1 ml per 10 volte, e conservare i campioni a -20 ° C.
  3. Il trattamento farmacologico dei neutrofili per la quantificazione NET mediante immunofluorescenza
    1. Preparare poli-L-lisina rivestite piastre da 48 pozzetti con vetrino.
      1. Posizionare un coprioggetto di vetro 8 mm in ciascun pozzetto, aggiungere 55 ml di soluzione sterile 0,01% Poli-L-lisina, e incubare per ~ 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
    2. Lavare due volte con 200 microlitri di PBS 1x. Conservare le piastre con 200 microlitri di PBS 1x per pozzetto in frigorifero fino al momento dell'uso.
    3. Autoefully aggiungere 100 ml di sospensione cellulare (2 x 10 5/100 mL) dal punto 1.1.9 per pozzetto nel centro di ogni coprioggetto.
    4. Aggiungere 100 microlitri per pozzetto di una finale 10 mM MβCD o la finale di 25 nM PMA.
    5. Centrifugare per 5 min a 370 xg con freno.
    6. Incubare per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
    7. Centrifugare per 5 min a 370 xg con freno.
    8. Fissare le cellule con 155 microlitri del 4% PFA, avvolgerli in pellicola plastica paraffina, e memorizzarli notte a 4 ° C o per 10 min a RT.
      NOTA: Per i dati sulla formazione NET indotta da MβCD, vedi Neumann et al. 15.

2. Isolamento dei lipidi e analisi dei neutrofili umani derivati ​​dal sangue

  1. Isolare i lipidi dai neutrofili periferici umani derivati dal sangue, basate su Bligh e Dyer 22 e Brogden et al. 23
    1. Su ghiaccio, pipettare i neutrofili (presenti in metanolo e la soluzione cloroformio) in una provetta con tappo a vite 15 ml con una guarnizione di politetrafluoroetilene (PTFE) e omogeneizzare agitando per 1 min. Utilizzare tubi di vetro per impedire i lipidi di legarsi a superfici plastiche. Utilizzare PTFE tappi per prevenire la contaminazione da gomma / plastica.
    2. Aggiungere 2 mL di metanolo seguiti 1 min più tardi da 1 mL di cloroformio. Agitare ancora per 1 min.
    3. Ruotare i tubi di vetro a temperatura ambiente e 50 rpm per 30 min.
    4. Pellet la frazione proteica mediante centrifugazione della soluzione a 7 ° C e 1.952 xg per 10 min.
    5. decantare attentamente il supernatante in una nuova provetta con tappo a vite 15 mL glass, lasciando il pellet contenente proteine. Conservare il pellet a -20 ° C per il futuro quantificazione.
    6. Aggiungere 1 ml di cloroformio, attendere 1 min, aggiungere 1 ml di acqua bidistillata, e invertire il tubo coperchio a vite vetro con il campione per 30 s. Centrifugare a 7 ° C e 1.952 xg per 10 min e scarta la fase superiore, fino a, ma non incluso, lo strato nuvoloso.
    7. Se richiesto, eseguire una ulteriore fase di purificazione opzionale ripetendo il passo 2.1.8.
    8. Essiccare i campioni in un concentratore a vuoto a 60 ° C e conservarli a -20 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Alte prestazioni cromatografia su strato sottile (HPTLC) a semi-quantificare la quantità di diversi lipidi, quali colesterolo, fosfolipidi, e sfingomielina
    1. Preparare le seguenti quattro soluzioni di gestione e soluzione colorante.
      1. Soluzione 1: Mescolare acetato di etile (26,6%), 1-propanolo (26,6%), cloroformio (26,6%), metanolo (26,6%), e cloruro di potassio (9,6%). Preparare KCl sciogliendo 0,25 g di KCl in 100 mL di acqua HPLC qualità.
      2. Soluzione 2: Mescolare n-esano (73%), etere etilico (23%) e acido citrico (2%).
      3. Soluzione 3: 100% di n-esano.
      4. Preparare la soluzione colorante damiscelazione acqua distillata (90 mL) con 7,5 g di solfato di rame, e quindi aggiungere 10 ml di acido fosforico.
    2. Riempire fino a 5 mm di ciascuna soluzione in un vetro camera separata. Aggiungere qualsiasi tipo di carta da filtro per aumentare la velocità di marcia in ciascuna camera.
    3. Pre-incubare un HPTLC silice gel 60 lastra di vetro 20 x 10 cm nella prima soluzione corsa fino a che la soluzione raggiunge la marcia superiore della piastra. Poi asciugare per 10 minuti a 110 ° C.
      NOTA: Queste piastre possono essere memorizzati per un uso futuro in foglio di alluminio ed essiccati per 10 minuti a 110 ° C prima dell'uso.
    4. Sciogliere il pellet lipidica ottenuto dalla fase 2.1.10 in 200 ml di cloroformio / metanolo (1: 1) soluzione e incubare per 15 min a 37 ° C per sciogliere.
    5. Utilizzare un righello e una matita morbida, tracciare i punti di carico per il numero desiderato di campioni, più almeno uno standard. Mark distanza percorsa a circa 4 cm e 6 cm per la prima e seconda soluzione funzionamento, rispettivamente.
    6. Per caricare i campioni, lavare la siringa 10 microlitri 3 volte in cloroformio / metanolo (1: 1) prima di caricare ciascun nuovo campione. Carico 10 microlitri di ciascun campione goccia a goccia, cercando di concentrare il campione come piccola l'area possibile. I campioni devono essere caricati almeno in duplicati.
    7. Posizionare la piastra verticalmente nella prima camera con la gestione di soluzione 1 (passo 2.2.1.1). Assicurarsi che la piastra sia parallela alla parete della camera di vetro per ottenere una velocità di migrazione uniforme.
    8. Una volta che la linea del solvente ha raggiunto la prima boa, rimuovere la piastra, asciugarlo, e posizionarlo nella seconda soluzione. Ripetere i passaggi simili per il secondo e per il terzo soluzioni di funzionamento; lasciare la piastra nella soluzione fino a che il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra, quindi rimuovere e asciugare a temperatura ambiente per 1 min.
    9. Mettere piastra in una soluzione di solfato di rame per 7 s. Rimuovere la piastra, asciugare bene, e cuocere in forno per 7 minuti a 170 ° C. Attendere che il piatto si raffreddi.
    10. Using una cromatografia su strato sottile e analisi di gel, così come un software di elaborazione delle immagini, scansione e analizzare come descritto in precedenza da Brogden et al. 23.
  3. Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per quantificare la quantità di colesterolo
    1. Collegare una colonna 100 x 4,6 mm ad una cartuccia mm guardia 5 um / 4,6 e riscaldare a 32 ° C. Utilizzare metanolo come fase mobile ad una velocità di flusso di 1 ml / min a 65 bar e un rivelatore UV di misurazione a 202 nm per quantificare la quantità di colesterolo in ciascun campione.
    2. Lavare la macchina HPLC accuratamente prima di analizzare i campioni, effettuare le seguenti operazioni: pulizia della pompa, lavando l'ago, risciacquo la pentola, spurgo la siringa, e lavaggio del spurgo pompa. Lavare il tutto con acqua. Infine, eseguire la pulizia del sistema con metanolo ad una velocità di flusso di 5 ml / min per 5 min.
    3. Per stabilire una curva standard colesterolo, preparare almeno 4 concentrazioni variabilida 0,05 mg / ml a 2 mg / mL di colesterolo in cloroformio / metanolo (1: 1) 24.
    4. Risospendere campioni ottenuti dal passo 2.1.10 in 500 ml di cloroformio / metanolo (1: 1) in bottiglie di vetro da 1,5 ml di color ambra con tappo a vite rosso PTFE / silicone coperchi bianchi.
    5. Quantificare le concentrazioni di colesterolo che utilizzano lo standard preparato al punto 2.3.3.
      NOTA: inserire il protocollo di campionamento, iniziando con almeno uno standard e un controllo negativo, seguito dai campioni.
    6. Esprimere i risultati come l'area sotto la curva e confronta tra campioni appropriati utilizzando qualsiasi software statistico.
      NOTA: I risultati possono anche essere quantificati contro una curva standard e possono essere visualizzati come la quantità totale di colesterolo per mL, g, o numero di cellule. L'equazione curva standard deve essere calcolato utilizzando i valori ottenuti al punto 2.3.3.

3. Visualizzazione e quantificazione dei NET

  1. Visualization di NET
    NOTA: La visualizzazione di NET si basa sul lavoro precedentemente pubblicato da Neumann et al. 15.
    1. Lavare i campioni fissati dal punto 1.3.8 3 volte con 200 ml di PBS 1x.
    2. Blocco e permeabilize con 100 ml di 2% BSA, 0,2% Triton X-100 in PBS per pozzetto per 45 minuti a RT.
    3. Aggiungere 100 ml di anticorpi primari: topo monoclonale anti DNA-istone 1-anticorpo (diluire le azione con 2,2 mg / ml 1: 5000 in PBS contenente 2% di BSA e 0,2% Triton X-100) o anticorpo policlonale contro mieloperossidasi (MPO; coniglio anti-MPO, diluito 1: 300 in PBS contenente 2% di BSA e 0,2% Triton X-100). Incubare per una notte a 4 ° C.
    4. Lavare 3 volte con 200 microlitri di PBS 1x.
    5. Aggiungere 100 ml di anticorpo secondario (fluorescenza marcato di capra anti-topo, 1: 1.000 in BSA-PBS-Triton X-100 e di capra anti-coniglio, 1: 1.000 BSA-PBS-Triton X-100) per 1 ora a RT al buio.
    6. Lavare 3 volte con 200 & #181; L di PBS 1x.
    7. Rimuovere coprioggetto usando pinzette e posizionare a faccia in giù con 3 ml di mezzo di montaggio contenente DAPI su vetrini.
    8. Esaminare i campioni utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza confocale-base dotato di 0,75-1,25 olio HCX PL APO 40X obiettivo ad immersione 15.
  2. La quantificazione dei nuclei NET-releasing
    1. Aprire un software di elaborazione delle immagini (ad esempio, ImageJ) e trascinare e rilasciare un'immagine di interesse nella barra degli strumenti.
    2. Clicca su "plugins", "analizzare" e "contro Cell."
    3. Premere il pulsante "Inizializza" nella finestra del contatore e scegliere un tipo di contatore (ad esempio, cliccare su 7 in rosso per celle NET-rilascio e 8 in giallo per cellule non-rilascio, come mostrato nella Figura 6B-i e ii).
      NOTA: I criteri di cellule NET-positive: nucleo verde Positivamente macchiato + un nucleu meno densas (perdita di lobulation) o una perdita della forma rotonda del nucleo + un aumento delle dimensioni del nucleo, o un evento di un extracellulare distinta diramazione.
    4. Istruzioni ogni aderente cella per i criteri di cui sopra e scrivere il numero di cellule contate in un foglio di dati di un software di analisi.
    5. Calcolare la percentuale di cellule NET rilasciante utilizzando i numeri di cellule contate di cellule NET rilasciante e non-rilascio.

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Representative Results

Neutrofili derivati dal sangue umano sono state isolate mediante centrifugazione a gradiente di densità (Figura 2). Per studiare l'effetto di alterazioni lipidiche sui neutrofili, le cellule sono state trattate con 10 mM MβCD, che esaurisce colesterolo dalla cella. Successivamente, i lipidi sono stati isolati dai campioni di Bligh e Dyer (figura 1, pannello di sinistra), come descritto da Brogden et al. 23. I campioni lipidi preparati sono stati caricati su piastre HPTLC gel di silice ed eseguito utilizzando un protocollo a tre soluzione, che è stata ottimizzata per separare e visualizzare una vasta gamma di lipidi, tra cui il colesterolo, esteri di colesterolo, sfingomielina, fosfolipidi e trigliceridi, acidi grassi liberi , monoacilglicerolo, fosfatidiletanolammina, cardiolipina, fosfatidilserina e fosfatidilcolina (Figura 3A). derivati ​​ossigenati di colesterolo (ossisteroli) non sono rilevabili wesimo questo metodo. Un'analisi quantitativa supplementare di colesterolo è stata effettuata utilizzando HPLC (Figura 3B). Il valore di regressione per colesterolo era nettamente migliore quando si usa HPLC (Figura 4A) rispetto al HPTLC (Figura 4B). Per visualizzare le reti, le cellule sono state stimolate con stimoli summenzionati, fissate e colorate per DNA / istone 1 (verde), MPO (rosso), e DNA (blu) marcatori NETTE tipici (Figura 5A). Come mostrato nella Figura 5A, una chiara presenza di MPO, DNA / istone 1, e DNA avviene nelle reti quando le cellule sono state trattate con 10 mM MβCD per 2 h. Successivamente, l'effetto di riduzione del colesterolo è stato analizzato al microscopio. Pertanto, le cellule sono state colorate per DNA (blu) e DNA / istone 1 (verde), e nuclei NET-rilascio sono stati contati utilizzando il plug contatore di cellule dalla ImageJ software di elaborazione di immagini (Figura 5B). neutrofili non trattati servivano come controllo per spontaneous formazione NET (Figura 5B-i). Nella figura mostrata, il rilascio NET nei neutrofili trattati dopo 2 ore di incubazione era 3,89%, mentre il trattamento delle cellule con 10 mM MβCD comportato 35.17% formazione NET (Figura 5B).

Figura 1
Figura 1: schema che mostra le fasi coinvolte nel determinare la composizione lipidica e protezione antischiacciamento extracellulare da neutrofili derivati dal sangue umano. Neutrofili sono isolate utilizzando un gradiente di densità e trattate con metil-β-ciclodestrina (MβCD) per indurre alterazioni lipidiche e formazione NET. Successivamente, i lipidi sono isolati e analizzati utilizzando uno HPTLC o HPLC, e reti vengono visualizzati e quantificati mediante immunofluorescenza.

figura 2
rong> Figura 2: Immagini raffigurante un gradiente di densità tipico utilizzato per isolare cellule polimorfonucleati da sangue fresco isolato. Quattro strati sono visibili dopo centrifugazione: plasma, cellule mononucleate, cellule polimorfonucleati e eritrociti.

Figura 3
Figura 3: HPTLC e HPLC analisi dei lipidi isolati da neutrofili. (A) standard utilizzato per identificare i lipidi presenti nei neutrofili via HPTLC (corsia di sinistra). CE: Esteri del colesterolo, TG: Triacilgliceroli, FFA: Acidi grassi liberi, Chol: colesterolo, MG: monoacilglicerolo, PE: fosfatidiletanolammina, CL: cardiolipina, PS: Fosfatidilserina, PC: fosfatidilcolina e SM: sfingomielina. (B) risultato rappresentativa che mostra un picco specifico colesterolo per 2 mg / ml a 4.980 min utilizzando il protocollo HPLC descritto qui.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: HPLC e HPTLC analisi di colesterolo. Grafici che mostrano la relazione tra la concentrazione di colesterolo e zona, come misurato mediante HPLC (A), e l'intensità di banda, misurata mediante HPTLC (B). Il limite minimo di rilevamento per HPLC era 0,0016 mg / ml, con un valore di regressione per la curva standard di 0,998 N = 3, SEM (A). Colesterolo compreso tra 2 mg / ml fino a 0,05 mg / ml può essere semi-quantificata mediante HPTLC (B), con un limite minimo di rilevamento di 0,05 mg / mL N = 3, SEM. Il valore di regressione per la curva standard HPTLC è 0.918.

Figura 5
Figura 5: micrografie fluorescenza rappresentativi che mostrano strutture a rete e subsequente quantificazione NET. (A) neutrofili stimolati con 10 mM MβCD per 2 h sono state colorate per (ii) MPO (rosso), (iii) DNA / istone 1 (verde), e (iv) DNA (blu). (I) Sovrapposizione di (ii), (iii) e (iv). (B) Le cellule sono state incubate per 2 h con (i) media HBSS o (ii) 10 mM MβCD e NET rilasciati sono stati colorati per nuclei (blu) e DNA / istone 1 (verde). nuclei NET-negativi sono stati contrassegnati con contatore 8 (giallo) e NET-positivi nuclei con contatore 7 (rosso).

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Discussion

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per analizzare specifici lipidi, come il colesterolo, per HPTLC o HPLC e per studiare gli effetti delle alterazioni lipidiche farmacologici sulla formazione di reti (vedi Neumann et al. 15).

HPTLC è un metodo relativamente economico e semplice per analizzare una vasta gamma di lipidi in un gran numero di campioni. Questo metodo è stato utilizzato in molte aree di ricerca, compresa la quantificazione antibiotico 25, accumulo di lipidi in malattie da accumulo lisosomiale 26, e la determinazione dei livelli di colesterolo e cholesterylglucoside in cellule epiteliali 27. Il metodo qui descritto è stato modificato e ottimizzato per isolare lipidi dal neutrofili una popolazione purificata; tuttavia, una versione leggermente modificata può anche essere utilizzata per isolare i lipidi da campioni di tessuto (vedi Brogden et al. 23). Usando questo ha incontratohod, lipidi possono anche essere efficacemente separati, identificati e quantificati semi-contro uno standard noto. Un punto critico in questo metodo è l'uso del rispettivo buffer di chiamata, poiché l'utilizzo di qualsiasi altro tampone o terreno può portare alla contaminazione dei lipidi e bande non specifiche lipidi nei campioni. Poiché la sensibilità è limitata con HPTLC, HPLC dovrebbe essere usato come un metodo più accurato per la quantificazione assoluta.

HPLC facilita la quantificazione e l'identificazione di colesterolo e le sue varie forme o derivati ​​eseguendo un confronto con un lipide nota. Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile quantificare attendibilmente fino a 0,0016 mg / mL di colesterolo (Figura 4A), con un rapporto lineare fino a 10 mg / mL (R = 0,990). Il metodo consente di rilevare HPTLC colesterolo fino a 0,05 mg / ml, ma con una curva sigmoidale e una minore coefficiente di correlazione R = 0,906 (Figura 4B). La maggiore sensibilità e maggiore correlazione coefficiente rende così HPLC un metodo molto superiore per l'esatta quantificazione dei lipidi, che consente successivamente più piccole differenze tra i campioni da rilevare. Tuttavia, entrambi i metodi possono essere utilizzati in combinazione; HPTLC può essere utilizzato per ottenere una visione in cui i lipidi possono essere modificati e HPLC può essere utilizzato in un approccio più mirato per quantificare la differenza di un lipide specifica in un dato campione. Quando si confrontano le nostre misurazioni con i valori ottenuti da altri 28, 29, meno colesterolo è stata quantificata nei neutrofili totali. Questo potrebbe essere spiegato con la metodologia utilizzata. Altri studi hanno utilizzato una determinazione fluorimetrica, che si basa su una reazione enzimatica accoppiata che rileva sia colesterolo libero e cholesterylesters.

Qui, HPTLC e HPLC sono usati in combinazione per verificare che MβCD porta ad una riduzione significativa del colesterolo come precedentemente mostrato anche da Gorudko et al.ss = "xref"> 28. Hanno dimostrato una riduzione del 60% del colesterolo neutrofili da 10 mM MβCD. Inoltre, una lieve riduzione del livello di sfingomielina ma non esteri del colesterolo era rilevabile nei neutrofili quando trattati con MβCD (vedi Neumann et al. 15). Allo stesso tempo, l'esaurimento del colesterolo porta alla formazione di reti (vedi Neumann et al. 15). Questi trovando correlano bene con il fenomeno che il trattamento dei neutrofili con statine, inibitori di 3-idrossi-3 metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reduttasi, l'enzima limitante la velocità nella biosintesi del colesterolo, aumenta la formazione di reti. Tuttavia, poiché il trattamento statina di neutrofili esibisce forte induzione NET rispetto al trattamento MβCD (vedi Neumann et al. 15 e Chow et al. 20), ulteriori effetti delle statine esempio su prenilati membrana ancorata effettore proteins potrebbe anche essere coinvolta nella formazione di reti.

La formazione di NET è relativamente nuovo meccanismo di difesa dell'ospite descritto. Le fibre di DNA extracellulare sono ora descritta non solo nei mammiferi 30, 31, ma anche in pollo, pesce, gamberi, e le piante 32, 33, 34, 35. Su stimolazione dei neutrofili con patogeni o altri stimoli, le reti vengono rilasciati nello spazio extracellulare, dove intrappolano e, eventualmente, uccidono gli agenti patogeni invasori 36. Studiare la composizione lipidica di un neutrofili attivati ​​può aiutare a comprendere i meccanismi cellulari che mediano l'attività antimicrobica. Poiché abbiamo misurato solo il livello lipidico totale dei neutrofili, rimane da stabilire come il contenuto lipidico è diversa ed è influenzata da MβCD a cellula intera contro plasmembrane mA e tra domini diversi micro membrana. Tuttavia, ciò richiede procedure di separazione di membrana specifici come precedentemente descritto (Xu et al.). 37

Oltre cromatina, NET umani contengono diverse proteine ​​neutrofili, come MPO; elastasi, il peptide antimicrobico LL-37; o calgranulin 17, 36. Una recente ricerca ha puntato molto sul ruolo di queste proteine specifiche e cambiamenti morfologici, che avviano e facilitare la formazione di NET 15, 38, 39. Tuttavia, finora, non è limitato soltanto conoscenza circa l'importanza di alcuni lipidi durante questo processo 15, 20. Pertanto, questa è una zona particolarmente interessante da esplorare in maggior dettaglio in futuro. Infine, la conoscenza sulle modifiche membrana lipidicapotrebbe servire come base per approcci terapeutici per stimolare il sistema immunitario contro le infezioni. A titolo di esempio, è stato dimostrato che la riduzione del colesterolo potrebbe contribuire alla lotta patogeni resistenti agli antibiotici come H. pylori, poiché è stato dimostrato che il colesterolo aumenta la resistenza di tali insetti contro antibiotici e peptidi antimicrobici 40. Studi simili potrebbero essere utili per comprendere le interazioni ospite-patogeno con diverse specie batteriche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio della Akademie für Tiergesundheit (AFT) e una borsa di studio del corso di dottorato, "Animal e zoonotiche infezioni", dell 'Università di Medicina Veterinaria, Hannover, Germania, a condizione di Ariane Neumann.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neutrophil isolation, NET staining and quantification
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A-21070
Anti-MPOα antibody Dako A0398
BSA Sigma-Aldrich 3912-100G
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber Celeromics MF-0640010
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner Leica DMI6000CS
Dulbecco´s PBS 10x Sigma-Aldrich P5493-1L Dilute 1:10 in water for 1x working solution
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed Thermo Fisher Scientific 35503
Excel Microsoft 2010
DNA/Histone 1 antibody Millipore MAB3864
ImageJ NIH 1.8 http://imagej.nih.gov/ij/
Light microscope VWR 630-1554
Methyl-β-cyclodextrin Sigma-Aldrich C4555-1G
PFA Carl Roth 0335.3 dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution
PMA Sigma-Aldrich P8139-1MG Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Polymorphprep AXIS-SHIELD AN1114683
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P7481
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Invitrogen P7581
RPMI1640 PAA E 15-848
HBSS with CaCl and Mg Sigma H6648
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ml
Trypanblue Invitrogen 15250-061 0.4% solution
Water Carl Roth 3255.1 endotoxin-free
Name Company Catalog Number  Comments
Lipid isolation and analysis
1-propanol Sigma-Aldrich 33538
10 µL syringe Hamilton 701 NR 10 µl
Diethyl ether Sigma-Aldrich 346136
Ethyl acetate Carl Roth 7336.2
Canullla 26 G Braun 4657683
Copper(II)sulphatepentahydrate Merck 1027805000
Chloroform Carl Roth 7331.1
CP ATLAS software Lazarsoftware 2.0
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column Merck 152022
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster Hitachi HITA 892-0080-30Y Paramaters are dependent on individual HPLC machine
HPLC UV Detector Hitachi 5410
HPLC Column Oven Hitachi 5310
HPLC Auto Sampler Hitachi 5260
HPLC Pump Hitachi 5160
Methanol Carl Roth 7342.1
n-Hexane Carl Roth 7339.1
Phosphoric acid Sigma-Aldrich 30417
Potassium chloride Merck 49,361,000
Potters LAT Garbsen 5 ml
SDS Carl Roth CN30.3
HPTLC silica gel 60 Merck 105553
Vacufuge plus basic device Eppendorf 22820001
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom Sigma CLS3548
Coverslip Thermo Fisher Scientific 1198882
Glass slide Carl Roth 1879
BD Tuberculin Syringe Only 1 mL BD Bioscience 309659

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References

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Immunologia neutrofili neutrofili extracellulare Trappole (reti) Colesterolo Metil-β-ciclodestrina (MβCD) cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) ad alte prestazioni cromatografia su strato sottile (HPTLC)
Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps
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Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. More

Brogden, G., Neumann, A., Husein, D. M., Reuner, F., Naim, H. Y., von Köckritz-Blickwede, M. Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps. J. Vis. Exp. (121), e54667, doi:10.3791/54667 (2017).

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