Summary
Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.
Abstract
análise de lípidos realizada por cromatografia em camada fina de elevado rendimento (HPTLC) é um método relativamente simples e de baixo custo para analisar uma larga gama de lipidos. A função dos lípidos (por exemplo, em interacções hospedeiro-patogénio ou entrada de acolhimento) tem sido relatada a desempenhar um papel crucial em processos celulares. Aqui, mostramos um método para determinar a composição lipídica, com um foco no nível de colesterol de neutrófilos derivados do sangue primárias, por HPTLC em comparação com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O objectivo foi o de investigar o papel das alterações de lípido / colesterol na formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETS). libertação líquida é conhecido como um mecanismo de defesa do hospedeiro para evitar a propagação de agentes patogénicos no interior do hospedeiro. Portanto, os neutrófilos humanos derivadas do sangue foram tratadas com metil-β-ciclodextrina (MβCD) para induzir alterações lipídicas nas células. Usando HPTLC e HPLC, que demonstraram que o tratamento MβCD das células leva a lipídicoalterações associadas com uma redução significativa no teor de colesterol da célula. Ao mesmo tempo, o tratamento MβCD dos neutrófilos levou à formação de redes, como mostrado por microscopia de imunofluorescência. Em resumo, aqui se apresenta um método detalhado para estudar alterações lipídicas em neutrófilos e a formação de redes.
Introduction
Os lípidos foram mostrados para desempenhar um papel importante na homeostase celular, morte celular, as interacções hospedeiro-patogénio, e libertação de citoquinas 1. Ao longo do tempo, o interesse eo conhecimento sobre o impacto dos lipídios na interação patógeno-hospedeiro ou inflamação têm aumentado, e várias publicações confirmam o papel central de certos lipídios, especialmente o colesterol esteróide, em respostas celulares. O tratamento farmacológico com estatinas, que são utilizados como inibidores da biossíntese do colesterol através do bloqueio 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima-A-redutase (HMG-CoA-redutase), podem actuar como agentes anti-inflamatórios, diminuindo os níveis séricos de interleucina 6 e proteína C-reactiva 2. Colesterol e estruturas enriquecido-glicoesfingolipídeos pode ser utilizado por vários agentes patogénicos, tais como bactérias e vírus, como uma porta de entrada para o hospedeiro 3, 4, 5,class = "xref"> 6. Os esfingolípidos (por exemplo, esfingomielina) foram mostrados para ser usado por agentes patogénicos para promover a sua patogenicidade 7. Em macrófagos, domínios para entrar nas células uso micobactérias colesterol enriquecido; uma diminuição do colesterol inibe a absorção de micobactérias 8. Além disso, a infecção de macrófagos com Francisella tularensis, um agente zoonótica responsável pela tularemia (também conhecida como febre do coelho) 9, levou a uma infecção que foi abolido quando o colesterol foi descarregada a partir das membranas 10. Da mesma forma, a invasão de células hospedeiras de Escherichia coli por meio de estruturas ricas em lípidos foi demonstrado ser 4 dependente de colesterol. Além disso, a Salmonella typhimurium experiências de infecção de células epiteliais demonstrado que o colesterol é essencial para a entrada de agentes patogénicos para as células 11. Colesterol a inibição da exaustãod a absorção de Salmonella 11. Além disso, um estudo recente por Gilk et al. demonstrou que o colesterol desempenha um papel importante na captação de Coxiella burnetti 12. Além disso, Tuong et al. encontrado que 25-hidroxicolesterol desempenha um papel crucial na fagocitose por lipopolissacarídeo (LPS) estimuladas por macrófagos 13. Fagocitose foi reduzida quando os macrófagos foram tratados farmacologicamente para esgotar colesterol 14. Assim, colesterol e outros lípidos parecem desempenhar um papel importante na infecção e inflamação, uma vez que seu esgotamento pode reduzir o risco de invasão de vários patógenos 10, 11, 12.
Recentemente, fomos capazes de mostrar que as alterações lipídicas, especialmente o esgotamento de colesterol do celular, induzir a formação de extracellula neutrófilosarmadilhas r (NETS) em neutrófilos derivados do sangue humano 15. Desde a descoberta de redes em 2004, eles foram mostrados para desempenhar papéis críticos na armadilha bacteriana, e, portanto, impedindo a propagação da infecção 16, 17. NET consistem num esqueleto de ADN associado com histonas, proteases, e péptidos antimicrobianos 16. A libertação das redes por neutrófilos pode ser induzido por patogénios invasores 18, 19 e às substâncias químicas, tais como de forbol-miristato-acetato (PMA) ou estatinas 16, 20. No entanto, os mecanismos celulares detalhados, e especialmente o papel dos lipídios neste processo, ainda não são totalmente claras. A análise de lípidos pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em uma grande variedade de processos e interacções celulares, tais como a libertação de NET. CholesteRol e esf ingomielina são constituintes importantes das microdomínios da membrana celular e de lípidos, onde eles agregam estabilidade e facilitar a aglomeração das proteínas envolvidas no tráfico de proteína e eventos de sinalização 21. Para investigar o papel mecanicista de certos lípidos, agentes farmacológicos anfifílicos, tais como o oligossacarídeo cíclico metil-β-ciclodextrina (MβCD), pode ser usado para alterar a composição lipídica de uma célula e para reduzir o colesterol in vitro 15. Aqui, apresentam-se um método para utilizar HPTLC para analisar a composição lipídica de neutrófilos em resposta a MβCD. HPLC foi usada para confirmar o nível de colesterol na população de neutrófilos. Além disso, descreve-se um método para visualizar a formação de redes por microscopia de imunofluoresccia nos neutrófilos derivado de sangue humano em resposta a MβCD.
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Protocol
A coleta de sangue periférico neste protocolo foi aprovado pela comissão de ética em pesquisa humanos local. Todos os seres humanos desde que o seu consentimento informado por escrito.
1. Isolamento de neutrófilos humanos de sangue derivadas por centrifugação em gradiente de densidade
- Isolamento de neutrófilos derivados do sangue humano
- Camada de ~ 20 ml de sangue para 20 ml de diatrizoato / solução de dextrano de sio perto de uma chama e sem misturar.
- Centrifugar durante 30 minutos a 470 x g sem travão.
- Remover as células mononucleares e a camada de plasma amarelado. Transferir a fase de células polimorfonucleares (PMN) (segunda fase com células de acumulação; Figuras 1 e 2) para um novo tubo de 50 mL e preenchê-lo até 50 mL com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS).
- Centrifugar durante 10 minutos a 470 xg, com travão.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 5 mL de água estéril foR 5 s, para lisar os eritrócitos.
- encher imediatamente até 50 mL com PBS 1x e centrifuga-se durante 10 min a 470 x g.
- Remover o sobrenadante. O sedimento deve ser de cor branca. Se ele ainda estiver vermelho, repita os passos 1.1.5 e 1.1.6.
- Ressuspender o sedimento em 1.000 mL de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) médio. Contar o número de células por meio da coloração com azul de tripano num hemocitómetro sob um microscópio de luz.
- Prepara-se uma suspensão de células em meio RPMI a uma concentração de 2 x 10 6 / mL. Aproximadamente 2,5 x 10 7 neutrófilos podem ser colhidas a partir de 20 ml de sangue.
- O tratamento farmacológico de neutrófilos para análise de lípidos
- Use 5 x 10 7 culas a partir do passo 1.1.9. Ajustar o número de células em forma pura Hank's Solução Salina Equilibrada (HBSS) na presença ou ausência de MβCD 10 mM ou 25 nM de PMA, em um volume total de 300 ul num tubo de reacção de 1,5 mL.
- Incubar as amostras notubos de reacção de 2 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Centrifugar durante 10 minutos a 470 xg, com travão.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 uL de HBSS.
- Centrifugar durante 10 minutos a 470 xg, com travão.
- Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de clorofórmio / metanol (1: 1), homogeneizar com uma cânula de 26-G, pela sucção da amostra dentro e para fora para uma seringa de 1 mL de 10 vezes, e armazenar as amostras à temperatura de -20 ° C.
- O tratamento farmacológico de neutrófilos para a quantificação NET por imunofluorescência
- Prepare a poli-L-lisina-revestidas placas de 48 cavidades com lamelas de vidro.
- Coloque uma lamela de vidro de 8 mm em cada cavidade, adicionar 55 mL de solução estéril de 0,01% de Poli-L-Lisina, e incubar durante ~ 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Lavar duas vezes com 200 ul de 1x PBS. Armazenar as placas com 200 de 1x PBS por poço num frigorífico até serem necessários.
- Carroefully adiciona-se 100 uL de suspensão de células (2 x 10 5/100 uL) a partir do passo 1.1.9 por cavidade no centro de cada lamela.
- Adicionar 100 por po de ambos o MβCD final de 10 mM ou o final de 25 nM PMA.
- Centrifugar durante 5 minutos a 370 xg, com travão.
- Incubar durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Centrifugar durante 5 minutos a 370 xg, com travão.
- Fixar as células com 155 uL de PFA a 4%, embrulhá-los em filme plástico de parafina, e armazená-los durante a noite a 4 ° C ou durante 10 min a RT.
NOTA: Para os dados sobre a formação de NET induzida por MβCD, ver Neumann et ai. 15.
- Prepare a poli-L-lisina-revestidas placas de 48 cavidades com lamelas de vidro.
2. Isolamento lipídico e Análise de neutrófilos derivados do sangue humano
- Isolar os lípidos a partir dos neutrófilos derivados do sangue periférico humano à base de Bligh e Dyer 22 e Brogden et al. 23
- Em gelo, pipetar os neutrófilos (presentes em metanol e solução de clorofórmio) para um tubo de vidro com tampa de rosca de 15 ml com um (PTFE) politetrafluoroetileno vedação e homogeneizá-los por agitação durante 1 min. Usar tubos de vidro para impedir que os lípidos de ligação a superfícies de plástico. Uso de PTFE tampões para evitar a contaminação a partir de borracha / plástico.
- Adicionar 2 mL de metanol, seguido de 1 min mais tarde por 1 mL de clorofórmio. Agitar mais uma vez durante 1 min.
- Rodar os tubos de vidro à temperatura ambiente e 50 rpm durante 30 min.
- Sedimentar a fracção de proteína por centrifugação da solução, a 7 ° C e 1952 x g durante 10 min.
- Decantar o sobrenadante cuidadosamente para um novo tubo com tampa de rosca de 15 mL glass, deixando o sedimento contendo proteína atrás. Armazenar o sedimento a -20 ° C para futuro quantificação.
- Adicionar 1 mL de clorofórmio, esperar um minuto, adicionar 1 mL de água duplamente destilada, e inverter o tubo de vidro com tampa de rosca com a amostra durante 30 s.
- Se necessário, realizar um outro passo opcional de purificação por repetição do passo 2.1.8.
- Secam-se as amostras em um concentrador de vácuo a 60 ° C e armazená-las a -20 ° C até ser necessário.
- Preparar os seguintes quatro soluções de funcionamento e a solução de coloração.
- Solução 1: Misturar acetato de etilo (26,6%), 1-propanol (26,6%), clorofórmio (26,6%), metanol (26,6%), e cloreto de potássio (9,6%). Prepare de KCl por dissolução de 0,25 g de KCl em 100 mL de água de HPLC de qualidade.
- Solução 2: Misturar n-hexano (73%), éter dietílico (23%), e ácido cítrico (2%).
- Solução 3: 100% de n-hexano.
- Preparar a solução de coloração pelamistura de água destilada (90 ml) com 7,5 g de sulfato de cobre, e, em seguida, adicionar 10 mL de ácido fosfórico.
- Encha até 5 mm de cada solução numa câmara de vidro separada. Adicionar qualquer tipo de papel de filtro para aumentar a velocidade de execução em cada câmara.
- Pré-incubar uma HPTLC de gel de sílica 60 da placa de vidro de 20 x 10 cm da primeira solução de funcionamento até que a solução de funcionamento atinge o topo da placa. Em seguida, secar durante 10 min a 110 ° C.
NOTA: Estas placas podem ser armazenadas para uso futuro em folha de alumínio e secou-se durante 10 min a 110 ° C antes de usar. - Dissolve-se o sedimento de lípidos obtida a partir do passo 2.1.10 em 200 ul de clorofórmio / metanol (1: 1) solução e incubar durante 15 min a 37 ° C para dissolver.
- Usar uma régua e um lápis macio para marcar os locais de carregamento para o número de amostras desejado, além de pelo menos um padrão. Marque a distância percorrida a aproximadamente 4 cm e 6 cm para a primeira e segunda solução de execução, respectivamente.
- Para carregar as amostras, lavar a seringa de 10 pL de 3 vezes em clorofórmio / metanol (1: 1) antes de carregar cada nova amostra. Carga de 10 ul de cada amostra, gota a gota, tentando concentrar a amostra na menor área possível. As amostras devem ser carregados pelo menos em duplicado.
- Colocar a placa verticalmente para dentro da primeira câmara com uma solução de 1 (passo 2.2.1.1) em execução. Assegure-se que a placa é paralela à parede da câmara de vidro para atingir uma velocidade de migração uniforme.
- Uma vez que a linha de solvente atingiu a primeira marca, remover a placa, secá-lo e colocá-lo na segunda solução. Repetir os passos semelhantes, para o segundo e para as soluções de terceiros de funcionamento; deixar a placa na solução até que a frente de solvente atingir o topo da placa e, em seguida remover e secá-lo a temperatura ambiente durante 1 min.
- Coloque placa em solução de sulfato de cobre durante 7 s. Remova a placa, secá-la completamente, e cozê-la num forno durante 7 min a 170 ° C. Aguarde até que o prato para esfriar.
- Using uma cromatografia em camada fina e software de análise de gel, bem como um software de processamento de imagem, digitalizar e analisar tal como descrito anteriormente por Brogden et al. 23.
- Anexar uma coluna 100 x 4,6 mm a um cartucho de guarda mm 5 m / 4,6 e aquecê-la a 32 ° C. Utilizar metanol como a fase móvel a um caudal de 1 mL / min a 65 bar e um detector de medição UV a 202 nm para quantificar a quantidade de colesterol, em cada amostra.
- Lava-se a máquina de HPLC completamente antes de analisar as amostras, executando as seguintes etapas: a limpeza da bomba, lavagem da agulha, enxaguar o vaso, purgar a seringa, e de se lavar a purga da bomba. Lave todos com água. Por fim, realizar uma purga de sistema com metanol a um caudal de 5 mL / min durante 5 min.
- Para estabelecer uma curva padrão de colesterol, preparar, pelo menos, 4 concentraes variandoa partir de 0,05 mg / mL a 2 mg / mL de colesterol em clorofórmio / metanol (1: 1) 24.
- Ressuspender as amostras obtidas a partir do passo 2.1.10 em 500 mL de clorofórmio / metanol (1: 1) em frascos de 1,5 mL glass de cor âmbar com tampa de rosca de PTFE vermelho / tampas de silicone branco.
- Quantificar as concentrações de colesterol utilizando o padrão preparado no passo 2.3.3.
NOTA: inserir o protocolo de amostragem, começando com, pelo menos, um padrão e um controlo negativo, seguido pelas amostras. - Expressar os resultados como a área sob a curva e comparar entre amostras apropriados utilizando qualquer software estatístico.
Nota: Os resultados também pode ser quantificado contra uma curva padrão e podem ser mostrados como a quantidade total de colesterol por mL, g, ou o número de células. A equação da curva padrão deve ser calculado utilizando os valores obtidos no passo 2.3.3.
3. visualização e quantificação das redes
- Visualization de redes
NOTA: A visualização das redes é baseado no trabalho previamente publicado por Neumann et al. 15.- Lavam-se as amostras fixadas a partir do passo 1.3.8 três vezes com 200 uL de PBS 1x.
- Bloco e permeabilizar com 100 uL de BSA a 2%, 0,2% de Triton X-100 em PBS por poço durante 45 minutos a RT.
- Adicionar 100? L de anticorpos primários: anticorpo monoclonal de ratinho anti-DNA-histona 1-anticorpo (diluir o material com 2,2 mg / ml de 1: 5000 em PBS contendo 2% de BSA e 0,2% de Triton X-100) ou anticorpo policlonal contra mieloperoxidase (MPO; de coelho anti-MPO; diluído 1: 300 em PBS contendo 2% de BSA e 0,2% de Triton X-100). Incubar durante a noite a 4 ° C.
- Lavar 3 vezes com 200? L de PBS 1x.
- Adicionar 100 uL de anticorpo secundário (marcado com fluorescência de cabra anti-ratinho, 1: 1000 em BSA-PBS-Triton X-100 e de cabra anti-coelho, 1: 1000 de BSA-PBS-Triton X-100) durante 1 h a TA no escuro.
- Lavar 3 vezes com 200 & #181; L de PBS 1x.
- Remover lamelas usando uma pinça e colocá-los de face para baixo com 3 mL de meio de montagem contendo DAPI em lâminas de vidro.
- Examinar as amostras utilizando uma base de microscópio invertido confocal de fluorescência equipado com um HCX PL APO 40X 0,75-1,25 óleo objectiva de imersão 15.
- A quantificação dos núcleos de libertação da NET
- Abra um software de processamento de imagem (por exemplo, ImageJ) e arraste e solte imagem de interesse para a barra de ferramentas.
- Clique em "Plugins", "Analisar" e "Contador de células".
- Pressionar o botão "Inicializar" na janela do contador e escolher um tipo de contador (por exemplo, clique no dia 7 no vermelho para células libertador de NET e 8 em amarelo para células não desprendimento, como apresentado na Figura 6B-I e II).
NOTA: Os critérios de células NET-positiva: positivamente coradas núcleo verde + um nucleu menos densos (perda de lobulação) ou uma perda da forma redonda do núcleo + um aumento do tamanho do núcleo, ou uma ocorrência de uma extracelular distinta ramificação. - Clique cada aderente de células com os critérios acima e escrever o número de células contadas em uma folha de dados de um software de análise.
- Calcular a percentagem de células libertador de líquido a partir das número de células contadas de células-NET libertando e de não desprendimento.
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Representative Results
Neutrófilos derivados do sangue humano foram isolados por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2). Para investigar o efeito de alterações lipídicas sobre os neutrófilos, as células foram tratadas com 10 mM de MβCD, que esgota o colesterol a partir da célula. Subsequentemente, os lípidos foram isolados a partir das amostras por Bligh e Dyer (Figura 1, painel da esquerda), como descrito por Brogden et al. 23. As amostras lipídicas preparadas foram carregadas em placas de HPTLC de gel de sílica e executado utilizando um protocolo de três solução, que foi optimizada para separar e visualizar uma vasta gama de lipidos, incluindo o colesterol, ésteres de colesterol, esfingomielina, fosfolípidos, e triacilglicéridos, ácidos gordos livres , monoacilglicerol, fosfatidiletanolamina, cardiolipina, fosfatidilserina e fosfatidilcolina (Figura 3A). derivados oxigenados de colesterol (oxisteróis) não são detectáveis wom este método. Uma análise quantitativa adicional do colesterol foi realizada utilizando HPLC (Figura 3B). O valor de regressão para o colesterol foi significativamente melhor quando utilizando HPLC (figura 4A) em comparação com HPTLC (Figura 4B). Para visualizar as redes, as células foram estimuladas com os estímulos acima mencionado, fixo, e coradas para ADN / histona 1 (verde), MPO (vermelho), e ADN (azul) marcadores de líquido, tal como típicos (Figura 5A). Como apresentado na Figura 5A, uma ocorrência clara da MPO, ADN / histona 1, e ADN ocorre nas redes quando as células foram tratadas com MβCD 10 mM durante 2 h. Subsequentemente, o efeito de redução do colesterol foi analisada microscopicamente. Portanto, as células foram coradas para ADN (azul) e ADN / histona 1 (verde), e os núcleos de libertação da NET foram contadas utilizando o contador de células de encaixe a partir do software ImageJ de processamento de imagem (Figura 5B). neutrófilos não tratadas serviram como controlo para spontaneous formação NET (Figura 5B-i). Na figura apresentada, a libertação líquida em neutrófilos não tratados após 2 horas de incubação foi de 3,89%, enquanto que o tratamento das células com MβCD 10 mM resultou em 35,17% de formao de líquido (Figura 5B).
Figura 1: Diagrama esquemático que mostra os passos envolvidos na determinação da composição lipídica e libertação extracelular armadilha de neutrófilos derivados do sangue humano. Os neutrófilos são isolados utilizando um gradiente de densidade e tratada com metil-β-ciclodextrina (MβCD) para induzir alterações lipídicas e formação NET. Depois disso, os lípidos são isolados e analisados por HPTLC utilizando um ou HPLC, e redes são visualizados e quantificados por imunofluorescência.
Figura 3: HPTLC e HPLC análise de lípidos isolados a partir de neutrófilos. (A) padrão usada para identificar os lipídios presentes em neutrófilos através de HPTLC (faixa da esquerda). CE: ésteres de colesterol, TG: Triacilgliceróis, FFA: ácidos graxos livres, Chol: colesterol, MG: monoacilglicerol, PE: fosfatidiletanolamina, CL: Cardiolipina, PS: fosfatidilserina, PC: fosfatidilcolina, e SM: esfingomielina. (B) resultado representativa mostrando um pico específico em colesterol durante 2 mg / mL a 4,980 min, utilizando o protocolo de HPLC descrito aqui.
Figura 4: HPLC e HPTLC análises de colesterol. Os gráficos que mostram a relação entre a concentração de colesterol e área, como medido por HPLC (A), e intensidade da banda, tal como medido por HPTLC (B). O limite mínimo de detecção por HPLC foi de 0,0016 mg / mL, com um valor de regressão para a curva padrão de 0,998 N = 3, SEM (A). O colesterol que varia desde 2 mg / mL até 0,05 mg / mL podem ser semi-quantificados utilizando HPTLC (B), com um limite de detecção mínimo de 0,05 mg / mL de N = 3, SEM. O valor de regressão para a curva padrão HPTLC é 0,918.
Figura 5: micrografias de fluorescência representativos que exibem estruturas NET e subseqafluente quantificação NET. (A) Os neutrófilos estimulados com MβCD 10 mM durante 2 h foram coradas para (ii) de MPO (vermelho), (iii) ADN / histona 1 (verde), e (iv) de ADN (azul). (I) Sobreposição de (ii), (iii), e (iv). (B) As células foram incubadas durante 2 h com (i) meio HBSS ou (ii) MβCD 10 mM, e redes libertadas foram coradas para núcleos (azul) e ADN / histona 1 (verde). NET-núcleos negativos foram marcados com contador de 8 (amarelo) e de núcleos com contador 7 (vermelho) NET-positivo.
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Discussion
Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para analisar os lípidos específicos, tais como colesterol, por HPTLC ou HPLC e para investigar os efeitos de alterações lipídicas farmacológicos sobre a formação de redes (ver Neumann et ai. 15).
HPTLC é um método relativamente de baixo custo e simples para analisar uma larga gama de lipidos em um grande número de amostras. Este método tem sido usado em muitas áreas de investigação, incluindo quantificação antibiótico 25, armazenamento de lípidos em doenças de armazenamento lisossómico 26, e a determinação dos níveis de colesterol e cholesterylglucoside em células epiteliais 27. O método aqui descrito foi modificado e optimizado para isolar lípidos a partir de uma população de neutrófilos purificado; no entanto, uma versão ligeiramente modificada também podem ser utilizadas para isolar amostras de tecido a partir de lípidos (ver Brogden et ai. 23). Usando este conheceuhod, lípidos podem também ser eficazmente separados, identificados e semi-quantificados contra um padrão conhecido. Um passo crítico neste método é a utilização da respectiva memória intermédia chamado, uma vez que o uso de qualquer outro tampão ou meio pode levar à contaminação lipídica e bandas não específicas lipídicas nas amostras. Uma vez que a sensibilidade é limitada com HPTLC, HPLC deve ser utilizada como um método mais preciso para a quantificação absoluta.
HPLC facilita a quantificação e identificação de colesterol e as suas várias formas ou derivados através da realização de uma comparação com um lípido conhecido. Usando o protocolo acima descrito, é possível quantificar de forma fiável para baixo a 0,0016 mg / mL de colesterol (Figura 4A), com uma relação linear para até 10 mg / mL (R = 0,990). O método permite a detecção de HPTLC colesterol para baixo a 0,05 mg / mL, mas com uma curva sigmóide e um coeficiente de correlação inferior de R = 0,906 (Figura 4B). A maior sensibilidade e maior correlação coeficiente assim faz HPLC de um método muito superior para a quantificação exacta de lípidos, que subsequentemente permite menores diferenças entre as amostras a serem detectados. No entanto, ambos os métodos podem ser utilizados em combinação; HPTLC pode ser usada para obter uma visão geral em que os lípidos podem ser alteradas, e HPLC pode ser usada em uma abordagem mais orientada para quantificar a diferença de um lípido específico numa determinada amostra. Ao comparar as nossas medições com os valores obtidos por outras 28, 29, menos colesterol foi quantificado em neutrófilos totais. Isso pode ser explicado pela metodologia utilizada. Outros estudos utilizaram uma detecção fluorimétrica, que se baseia numa reacção de enzima acoplada, que detecta tanto o colesterol livre e cholesterylesters.
Aqui, HPTLC e HPLC são utilizados em combinação para verificar que MβCD leva a uma redução significativa de colesterol como também previamente demonstrado por Gorudko et al.ss = "xref"> 28. Eles demonstraram uma redução de 60% de colesterol em neutrófilos por MβCD 10 mM. Além disso, uma ligeira redução do nível de esfingomielina mas não ésteres de colesterol era detectável nos neutrófilos quando tratados com MβCD (ver Neumann et ai. 15). Ao mesmo tempo, a depleção de colesterol conduz à formação de redes (ver Neumann et ai. 15). Estes encontrando correlacionam-se bem com o fenómeno de que o tratamento de neutrófilos com as estatinas, inibidores da 3-hidroxi 3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, a enzima limitante da velocidade na biossíntese do colesterol, estimula a formação de redes. No entanto, uma vez que o tratamento com estatina de neutrófilos exibe indução NET mais forte em comparação com o tratamento MβCD (ver Neumann et ai. 15 e Chow et ai. 20), os efeitos adicionais de estatinas, por exemplo sobre prenilada prote efectora membrana ancoradains também podem estar envolvidos na formação de redes.
A formação de redes é um mecanismo de defesa do hospedeiro relativamente nova descrita. As fibras de ADN extracelular agora não têm sido descritos apenas em mamíferos 30, 31, mas também em galinhas, peixes, camarões, e as plantas 32, 33, 34, 35. Após a estimulação dos neutrófilos com agentes patogénicos ou outros estímulos, as redes são libertadas para o espaço extracelular, onde eles aprisionar e, eventualmente, matar patogénios invasores 36. Estudando a composição lipídica de um neutrófilos activados podem ajudar a entender os mecanismos celulares que medeiam a sua actividade antimicrobiana. Uma vez que medido apenas o nível total de lípidos dos neutrófilos, que permanece por determinar a forma como o teor de lípidos varia e é afectada por MβCD em células inteiras contra plasmembranas de ma e entre os diferentes domínios micro membrana. No entanto, isto requer processos de separação de membrana específicos como previamente descrito (Xu et al.). 37
Além cromatina, NET humanos contém várias proteínas de neutrófilos, tais como MPO; elastase, o péptido antimicrobiano da LL-37; ou calgranulina 17, 36. Uma pesquisa recente tem focado fortemente sobre o papel dessas proteínas específicas e alterações morfológicas, que iniciar e facilitar a formação de redes de 15, 38, 39. No entanto, até agora, não se limita apenas conhecimentos sobre a importância de certos lípidos durante este processo 15, 20. Portanto, esta é uma área particularmente interessante a ser explorado em mais detalhes no futuro. Finalmente, o conhecimento sobre as modificações membrana lipídicapode servir como uma base para as abordagens terapêuticas para estimular o sistema imunológico contra infecções. Como um exemplo, demonstrou-se que a depleção de colesterol pode ajudar no combate a agentes patogénicos resistentes a antibióticos, tais como H. pylori, uma vez que foi demonstrado que o colesterol aumenta a resistência desses erros contra os antibióticos e anti-microbianos peptídeos 40. Estudos semelhantes podem ser úteis para a compreensão de interações patógeno-hospedeiro com diferentes espécies bacterianas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Akademie für Tiergesundheit (AFT) e uma bolsa de estudos do programa de doutoramento, "Animal e Zoonoses Infecções", da Universidade de Medicina Veterinária de Hanover, Alemanha, desde a Ariane Neumann.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
| Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
| Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
| Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
| Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
| Dulbecco´s PBS 10x | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1x working solution |
| Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
| ImageJ | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
| Light microscope | VWR | 630-1554 | |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
| PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1 N NaOH to clear solution |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1x PBS |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
| RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
| HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
| Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
| Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipid isolation and analysis | |||
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
| 10 µL syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
| Canullla 26 G | Braun | 4657683 | |
| Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
| Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
| CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
| Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
| High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
| HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
| HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
| HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
| HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
| Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
| n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
| Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
| Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
| SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
| HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
| Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
| Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
| Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
| BD Tuberculin Syringe Only 1 mL | BD Bioscience | 309659 | |
References
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