Summary
חלקיקים הם מתעוררים למערכות אספקת תרופות מבטיחות כמו עבור מגוון רחב של אינדיקציות. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה אך רבת עצמה כדי לייצר חלקיקי משי באמצעות משי טוואי משי מהונדס הפוך. חלקיקי משי אלה ניתן לטעון בקלות עם מטען טיפולי ובוחנים מכן עבור יישומי משלוח סמים.
Abstract
משי הוא biopolymer מבטיח עבור יישומים ביו תרופות בשל תכונות מכאני החוב שלה, התאמה ביולוגי פריקות ביולוגיות, כמו גם את יכולתה להגן ולאחר מכן לשחרר המטען שלה בתגובת הדק. בעוד משי אפשר לנסח לתוך פורמטים שונים חומר, חלקיקי משי הם מתעוררים למערכות אספקת תרופות מבטיחות כמו. לכן, במאמר זה מכסה את הליכי פקעות משי הנדסה לאחור להניב פתרון ממשי מחדש, שניתן להשתמש בם כדי ליצור חלקיקי משי יציבים. חלקיקים אלה ובהמשך מאופיין, סמים טעונים ובחנו כמערכת משלוח התרופה נגד הסרטן פוטנציאלית. בקצרה, פקעות משי מתוכננות הפוך לראשונה על ידי degumming הפקעות, ואחריו פירוק משי ולנקות, להניב פתרון ממשי מימי. לאחר מכן, הפתרון משי מחדש נתונה nanoprecipitation להניב חלקיקים משי - שיטה פשוטה אך רבת עוצמהשיוצר חלקיקים אחידים. חלקיקי המשי מאופיינים על פי גודלם, פוטנציאל זטה, מורפולוגיה ויציבות תקשורת מימית, כמו גם יכל ללכוד מטען כימותרפיות ולהרוג תאים סרטניים בשד אנושי. בסך הכל, המתודולוגיה המתוארת מניב חלקיקי משי אחידים שניתן לחקור בקלות עבור מספר עצום של יישומים, לרבות השימוש בם כמו ננו-רפואה פוטנציאלית.
Introduction
בגודל ננו למערכות אספקת תרופות משמשות לעתים קרובות כדי לשלוט שחרור תרופה ולספק קבוצה מגוונת של מטענים טיפוליים - למשל, חלבונים, פפטידים וסמי משקל מולקולריים קטנים - כדי למקד תאים ורקמות. מטענים טיפוליים אלה משולבים לעתים קרובות לתוך ספקי סמים שונים macromolecular, כגון ליפוזומים, פולימרים מסיסים במים (כולל dendrimers), ו מייקרו חלקיקים 1. חלקיקים (בדרך כלל בטווח גודל של 1 ננומטר 1,000 ננומטר) הם נבדקים נרחב כנישאי תרופה פוטנציאליים, במיוחד למסירת התרופה נגד סרטן 2. המבוא המוצלח של Abraxane (120 חלקיקים מבוססים אלבומין בגודל ננומטר עמוסים paclitaxel) לפועל קליני שיגרתי 3 יש catalyzed בתחום, כך חלקיקים רבים יותר עבור משלוח סמים נכנסים כעת 4 ניסויים קליניים. גידולים מוצקים להראות בדרך כלל ניקוז עניים הלימפה וכלי הדם שלהם דולף כלומר nanoparticles של עד 200 ננומטר יהיה ממוקד באופן פסיבי לגידולים אלה הבאים עירוי לוריד. תופעה סבילה מיקוד זה נקרא חדירות משופרת ושימור (EPR) אפקט דווח לראשונה בשנת 1986 5. ההשפעה EPR יכול להביא לעלייה 50 עד פי 100 בריכוזים התרופה במיקרו-סביבה של הגידול עבור מנה תרופה אשר ניתנת כאשר מטען התרופה מועבר באמצעות גישה מובילה תרופת macromolecular ולא תרופה חינם ללא ההספק. חלקיקים טעונים והתרופות שנועדו למסירה תרופה נגד סרטן צריך להגיע במיקרו-סביבה של הגידול ולעיתים קרובות יש להזין תא תאיים ספציפיים, בדרך כלל על ידי ספיגת endocytic עבור התרופה כדי להשיג השפעה טיפולית הרצוי שלה 3. חלקיקים נועדו עבור משלוח סמים תאי לנצל אנדוציטוזה כשער אל תוך התא, כמו גם מסלול להתגבר מנגנוני עמידות לתרופות. שחרור התרופה חלקיקים לעתים קרובות היא תוכננה במיוחד כדי occur ב lysosomes (כלומר, אספקת סמים lysosomotropic) 6 שבו ההיענות pH של המוביל ננו-חלקיקים (pH ליזוזומלית כ 4.5) יכול לשמש טריגר אנזימים שחרור או ליזוזומלית תרופה לשחרר את מטען מהמוביל 7.
שיעורים רבים של חומרים שונים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור חלקיקים (למשל, מתכות ורבים חומרים אורגניים ואי-אורגניים). עם זאת, biopolymers הם מתעוררים חומרים אטרקטיביים כמו בגלל biocompatibility הידוע, פריקות ביולוגיות ורעילות 8 נמוכות. biopolymers הרב הם נבדק, כולל אלבומין, אלגינט, chitosan ומשי. מבין אלה, משי התפתח מתחרה מבטיח לפיתוח לתוך מערכות אספקת סמי 9. משי מסוגים שונים המיוצרים על ידי מספר פרוקי רגליים, כולל עכבישים (למשל, clavipes Nephila) ו המשי (למשל, Bombyx מורי). משי תולעת משי משמש הרבה יותר Extenבאופן בלעדי מ קורי עכביש כי תולעי המשי הוא מבוית לחלוטין והמשי שלה ובכך מייצג חומר-מוצא לשחזור. משי תולעת המשי הוא ארגון המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר חומר לשימוש בבני אדם, במיוחד כחומר תפר; יש לו רקורד בטיחות חזק בבני אדם, והוא ידוע לבזות in vivo 10. הפרופיל השפל של משי יכול להיות מכוון עדין יותר והוא נע בין שעות (משי גביש נמוך) עד 12 חודשים או יותר (משי גביש גבוה). מוצרים פגומים משי הם רעילים עוברים מטבוליזם בגוף 10. מבנה המשי מקנה את היכולת לרתק תרכובות משקל מולקולרי קטנות וסמי חלבון macromolecular 11, מה שהופך אותו חומר טוב לשחרור סמים מבוקר. תרופות חלבון (למשל, נוגדנים) רגישות denaturation, צבירה, מחשוף פרוטאוליטים ופינוי על ידי המערכת החיסונית. עם זאת, משי מייצב חלבונים תרופתיים עקב יכולת חציצה מחדש nanocrystalline שלהgions ויכולתה להתאים את תוכן מים הננומטרי 11. תכונות ייחודיות אלה מספקים הגנה פיזית להפחית ניידות מטען 11 והם בדרך כלל לא רואים עם פולימרים אחרים (ביו). מערכות שיגור רבות תרופה נגד הסרטן, עבור הידרוג משי מבוסס למשל 12, סרטים 13-15 חלקיקים 16,17, פותח עכשיו לנצל תכונות אלו (הנסקרת ב אזכור 18,19)
הנה, חלקיקי משי התאפיינו קביעת הגודל ולחייב שלהם על פני פרק זמן ממושך. דוקסורוביצין, תרופה נגד סרטן רלוונטית קליני, שמש כתרופת מודל מחקר העמסת cytotoxicity תרופה בתאי סרטן שד אנושי משולשים שליליים שטופלו חלקיקי משי טעון בסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פתרון Silk הפוכה מהונדסים מן Bombyx מורי גלמים
הערה: מתודולוגיה זו מבוססת על פרוטוקולים תארו במקום 12,27.
- חותכים 5 גרם של פקעות מיובשות עם מספריים לתוך 5 מ"מ x 5 חתיכות מ"מ. הסר את כל השכבות מלוכלכות.
- תשקול 4.24 גרם של סודיום קרבונט ולהוסיף זה בזהירות עד 2 ליטר של מים רותחים מזוקקים.
הערה: זה מניב פתרון קרבונט 0.02 M נתרן. - מוסיפים את חתיכות המעטפת לחתוך הפתרון סודיום קרבונט רותחים ומרתיחים במשך 60 דקות כדי degum סיבי משי. מערבבים את משי מדי פעם כדי להבטיח עיבוד מדגם הומוגני.
- הסר את משי Degummed ולשטוף עם 1 ליטר מים מזוקקים במשך 20 דקות; חזור על שלב הכביסה לפחות 3 פעמים.
- הסר את המשי המכובס ולסחוט אותה היטב כדי להסיר עודפי נוזלים ולאחר מכן להתיר / למשוך את המשי ביד. מניחים את משי התיר במנדף לאוורר לילה יבש. זה בדרך כלל מניבה 3.6 גרם של ים Degummedסיבי ודומיו.
- למחרת, לשקול את 5 גרם סיבי משי Degummed אוויר יבש ולארוז המשי בחוזקה לתוך החלק התחתון של מבחנה 50 מ"ל.
- כן פתרון 9.3 M LiBr טרי. ממיסים את סיבי משי LiBr באמצעות משי 1 גרם עד 4 מ"ל יחס LiBr. מכסה את מדגם המשי LiBr עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע אידוי ולאפשר המשי לפזר לחלוטין ב 60 מעלות צלזיוס. שלב זה נמשך עד 4 שעות והוא נעזר תוך ערבוב מדי פעם.
- להרטיב קלטת דיאליזה (חתוכים משקל מולקולרי של 3,500 Da) במים למשך 5 דקות. להזריק 15 מ"ל הפתרון משי LiBr לתוך קלטת דיאליזה 15 מ"ל ולהשתמש מחט מזרק כדי להסיר בועות אוויר.
- Dialyze נגד 1 ליטר של מים מזוקקים להחליף את המים ב 1, 3 ו -6 שעות (כלומר, 3 שינויים ביום הראשון) ושוב על הבוקר והערב הבא (כלומר, 2 שינויים ביום השני), ושוב על למחרת בבוקר (כלומר, שינוי של 1 ביום שלישי).
- אסוף את soluti משיעל מתוך הקלטת דיאליזה צנטריפוגות הפתרון במשך 20 דקות ב 5 מעלות צלזיוס ב 9,500 x ז. לשחזר את supernatant וחזור תהליך צנטריפוגה זה עוד פעמיים.
- קבע את משקל סירה במשקל ריק (W1) ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון ממשי. רשום את המשקל שוב (W2) ולאחר מכן לייבש את המדגם על ידי השארת את הסירה במשקל ב -60 ºC לילה. לאחר מכן, לקבוע את המשקל היבש הכולל (W3) (משי יבש סירה במשקל). הריכוז של הפתרון הממשי (w / v) הוא:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.
2. הכנת משי החלקיקים מן ההפוך מהונדס פתרון Silk
- הוסף% 5 (w / v) dropwise פתרון ממשי כדי אצטון תוך שמירה על> 75% (v / v) פתרון אצטון. לדוגמה, להוסיף 9 מ"ל של 5% (w / v) dropwise פתרון ממשי (10 μl / ירידה בשיעור של 50 טיפות / min) ל -34 מ"ל אצטון.
- צנטריפוגה המשקע ב 48,000 XG במשך שעה 2 ב 4 ° C..
- לשאוב supernatant ו resuspend Pellet במים מזוקקים על ידי פירוק הגלולה ראשון עם מרית ולאחר מכן הוספה 20 מ"ל מים מזוקקים. השתמש בעצות pipet להסיר הגלולה מן המרית. לאחר vortexing במשך 20 שניות ואחריו שני מחזורי sonication באמצעות בדיקה קולית ב משרעת 30% למשך 30 שניות, למעלה למעלה בצינור צנטריפוגות עד אפס מקום עם מים מזוקקים.
- חזור על צנטריפוגה צעד resuspension לפחות פעמיים.
- Resuspend גלולה ב 6 מ"ל מים מזוקקים, כמפורט 2.3 ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש. עבור מחקרי תרבית תאים, מניות nanoparticle משי יכולות להיות מוקרנת גמא 17.
3. קביעת ריכוז Nanoparticle משי
- חלקיקי משי צנטריפוגה ב 48,000 XG במשך שעה 2 ב 4 ° C..
- לאסוף את כל החלקיקים ב 3 מיליליטר של מים מזוקקים, ואחריו שני מחזורי sonication ב משרעת 30% למשך 30 שניות.
- מחלק את 3 מיליליטר המלאה של חלקיקי משי לתוך 2 מיליליטר ו 1 מיליליטר המון ולהעביר לתוך יחסי הציבורדואר שקלה 2 צינורות מ"ל. רשום את המשקל הכולל של מדגם 2 מ"ל. אחסן במגרש 1 מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש; מדגם 1 מ"ל זה ישמש כדי ליצור עקומת כיול.
- הקפאת הצמד ואז Lyophilize במגרש nanoparticle משי 2 מ"ל בתוך מייבש להקפיא למשך הלילה. לאחר ייבוש בהקפאה, reweigh צינור 2 מיליליטר ולחשב את כמות חלקיקי משי (מ"ג) כי נכחו במקור במדגם 2 מיליליטר.
- לדלל את המניות nanoparticle משי 1 מ"ל מים מזוקקים כדי ליצור עקומת כיול של 5 נקודות (0.04-7 מ"ג / מ"ל). ודא כי דגימות לא לחרוג המקסימלי ספיגת.
- קבע את הספיגה של כל דילול סטנדרטי ב 600 ננומטר. זה נעשה הכי טוב באמצעות התקנת צלחת 96-היטב. ספיגה מגרש לעומת ריכוז (מ"ג / מיליליטר) עבור העקומה הסטנדרטית. לאחר מכן השתמש עקומת תקן זה באופן שיגרתי כדי לקבוע את הריכוז של חלקיקי משי השעיות.
4. הכנת חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין
- ממיסים 1.2 מ"ג של דוקסורוביצין HCl ב 8 מ"ל מים מזוקקים.
- לעשות עד 10 מ"ל עם מים מזוקקים להניב המניות עבודה של 116 מיקרוגרם / מ"ל (0.2 μmol / מ"ל).
- מערבבים 2 מ"ל של 0.2 μmol / פתרון דוקסורוביצין מ"ל עם 200 μl של 10, 30 או 50 מ"ג / מ"ל של חלקיקים משי בתוך שפופרת 2 מ"ל.
- לדגור על השעיית משי-דוקסורוביצין בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במשך הלילה על מערבל מסתובב.
- לאחר מכן, בצנטריפוגה ההשעיה דוקסורוביצין-משי 194,000 XG במשך 30 דקות. שטפו את חלקיקי משי טעון-דוקסורוביצין עם מים מזוקקים לחזור על הליך זה עוד פעמיים.
- פינת supernatant ו לציין את הנפח הכולל (דגימה זו משמשת כדי לקבוע את יעילות אנקפסולציה).
- Resuspend חלקיקי המשי טעון-דוקסורוביצין במים מזוקקים, להגן מפני אור ולאחסן ב 4 ºC until שימוש.
- Pipet 200 μl של supernatant משלב 4.2.4 לתוך צלחת microtiter שחור.
- שימוש בקורא microplate פלואורסצנטי למדוד קרינה הקשורים דוקסורוביצין בכל הגדרת מכפיל קבועה.
- קבע את אורך הגל עירור על 485 ננומטר אורך גל ופליטה כדי 590 ננומטר ולהקליט את ערכי הקרינה.
- ליצור עקומת כיול דוקסורוביצין. ודא מדידות נרכשות עם גדרות מכשיר זהות (כלומר, עם הגדרת מכפיל קבועה). באמצעות עקומת כיול, לחשב את ריכוז דוקסורוביצין ב supernatant בשילוב. חזור על המדידה הזו בשלושה ניסויים בלתי תלויים.
- השתמש במשוואה (1) כדי לקבוע את יעילות אנקפסולציה:
אפיון 5. של משי Nanoחלקיקים
- הערכת הגודל זיטה הפוטנציאל של טרייה המאוחסנים משי חלקיקים.
- חלקיקי משי חנות במים מזוקקים ב 4 מעלות צלזיוס ו -25 מעלות צלזיוס.
- למדוד את פוטנציאל הגודל זטא של חלקיקי המשי בימים 0, 14 ו -28 באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS). גדר מדדים שבירים כדי 1.33 עבור מים מזוקקים 1.60 עבור חלבון 17. חישוב גדלים של חלקיקים עם תוכנת ממשק המשתמש.
- הערכה מורפולוגי של חלקיקים משי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM).
- מניחים דיסק דבק פחמן על בדל SEM ובהמשך לצרף פרוסות סיליקון.
- לדלל חלקיקים משי לריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. פיפטה 10 μl של המדגם על גבי פרוסות סיליקון, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס ולינה Lyophilize באמצעות מערכת ייבוש בהקפאה לפי הוראות היצרן.
- מעיל המדגם עם זהב שכבת עד 20 ננומטר עבהבאמצעות coater גמגום ואקום נמוך.
הערה: גדרות מכשירות להשתנות בהתאם לדגם. המודל המשמש כאן הוא אוטומטיים לחלוטין פועל על ידי עובי בלבד. - דגימות תמונה עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של 5 קילו ו בהגדלת 40,000 פי.
6. במבחנה Cytotoxicity של שליטה טעון דוקסורוביצין חלקיקים משי
- כדאיות התא בעקבות חשיפה משי חלקיקים.
- תרבות תאים מד"א- MB-231 ב RPMI 1640 עם 10% FBS V / V. פלייט תאים על בתרבית רקמה מטופלים קלקר דגירה באווירה 5% CO 2 humidified על 37 מעלות צלזיוס. באופן שגרתי תת בנקודת המפגש 80% כל 2-3 ימים.
- פלייט תאים מד"א- MB-231 בצפיפות של 2 x 10 4 תאים / ס"מ 2 ב 96-גם הצלחות. אפשר התאים להתאושש לילה.
- להוסיף (i) 0.001-1 מיקרוגרם דוקסורוביצין diffusible בחופשיות, (ii) 0.001-.5 חלקיקי משי מ"ג ו -0.1 מ"ג חלקיקי משיעמוס 0.001-1 דוקסורוביצין מיקרוגרם לתוך צלחות 96-היטב (נפח סופי 100 μl לכל היטב).
- לקבוע כדאיות התא ריכוז מעכבות מקסימלי וחצי (IC 50) על ידי הוספת (3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) ברומיד -2,5-diphenyltetrazolium (MTT 5 מ"ג / מ"ל ב PBS) בשעה 72 hr. דגירה במשך 5 שעות, לנקז את הבארות בזהירות עם טפטפתי לפזר את formazan עם 100 μl של dimethylsulfoxide. מדוד את הספיגה ב 560 ננומטר. חזור המדידה הזו בשלושה ניסויים בלתי תלויים.
הערה: הערכים הספיגים של בקרות מטופל לשמש ער ייחוס עבור כדאיויות תא 100%.
- SEM של בתאים שנחשפו משי חלקיקים.
- זרע תאים מד"א- MB-231 על coverslips זכוכית סטרילית בצפיפות של 2 x 10 4 תאים / 2 ס"מ. אפשר התאים להתאושש לילה. לחשוף את התאים לתנאי הטיפול הרצויים עבור 72 שעות.
- תקן את התאים עם glutaraldehyde נ 2% / v ב PBS למשך 30 דקות, לשטוף עם diמים השתיקו פעמים, מייבש עם סדרת אתנול, ו נקודה קריטית לייבש את הדגימות, כמפורט במקומות אחר 28.
- גמגום מעיל דגימות עם זהב שכבת עד 20 ננומטר עבה באמצעות coater גמגום ואקום נמוך.
הערה: גדרות מכשירות להשתנות בהתאם לדגם. המודל המשמש כאן הוא אוטומטיים לחלוטין פועל על ידי עובי בלבד. - תמונה הדגימות על ידי SEM באמצעות האצת אלקטרונים של 5 קילו וולט והגדלה 700 פי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הנתונים נותחו סטטיסטית כמפורט לעיל 17. מבחן t שמש זוגות מדגם וניתוח חד סטרי של שונות (ANOVA) ואחריו ההשוואה המרובה של Bonferroni פוסט הוק מבחן דוגמאות רבות. כוכבית מציינת מובהקות סטטיסטית כדלקמן: * P <0.05 ו ** P <0.001. כל הנתונים מוצגים ערכים ממוצעים ± סטיית תקן (SD) ואת המספרים בסוגריים מציינים את מספר ניסויים בלתי תלויים.
פתרון ממשי מחדש הוכן שיצטרף dropwise כדי אצטון כדי ליצור חלקיקי משי באמצעות nanoprecipitation (איור 1). שיטה זו הניבה אחידה (מדד polydispersity: 0.1), כדורים, חלקיקי משי (106.5 ננומטר ± 1.1) עם מטען משטח שלילי (-49.57 mV ± 0.6) (איורים 2 ו -3). משי nanoparticle stיכולת במים הוערכה עד 28 ימים על ידי ניטור גודל חלקיקים, זטא פוטנציאלי ומורפולוגיה (איורים 2 ו -3). במהלך תקופת האחסון של 28 יום, בבית או 4 ° C או 25 ° C, ללא שינוי משמעותי גודל חלקיקים, פריצה (איור 2) או מורפולוגיה נצפה (איור 3).
דוקסורוביצין שמש כתרופת מודל כימותרפיות רלוונטית קליני לטעינה בסמים במחקרי cytotoxicity במבחנה. שלושה ריכוזים nanoparticle משי שונים (10, 30 ו -50 מ"ג / מ"ל) שימשו להעריך את יכולת הטעינה התרופה של חלקיקים משי. היעילות אנקפסולציה דוקסורוביצין במשך 10, 30 ו -50 מ"ג / חלקיקים משי מ"ל (כלומר, 2, 6 או 10 מ"ג של משי 232 מיקרוגרם של דוקסורוביצין) היה 73 ± 2.2, 87 ± 1.8 ו -97 ± 0.2%, בהתאמה (איור 4 א ). גודל החלקיקים ואת פוטנציאל זטה של דוקסורוביצין-loחלקיקי משי aded (10 מ"ג) נמדדו בהשוואה לקבוצת ביקורת nanoparticle משי 10 מ"ג. גודל החלקיקים לא השתנה גם לאחר טעינת סמים (איור 4B), ואילו פוטנציאל זטה של חלקיקים משי טעון דוקסורוביצין הופחת באופן משמעותי מ 49.57 ± 0.6 mV ל 43.52 ± 0.37 mV (איור 4C).
היכולת של חלקיקי משי טעון תרופה לספק דוקסורוביצין ובהמשך להרוג תאים סרטניים הוערכה במבחנה. מד"א- MB-231 תאים סרטניים בשד אדם נחשפו חלקיקי משי, דוקסורוביצין diffusible בחופשיות או חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין. כדאיויות תא הוערכו לאחר תקופת חשיפה 72 שעות. הערכים 50 IC של דוקסורוביצין diffusible בחופשיות חלקיקים משי טעון דוקסורוביצין היו 0.48 מיקרוגרם / מ"ל ו 0.24 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה ואילו חלקיקים משי היה 50 IC> 5 מ"ג / מ"ל (איור 5 א).במינוני תרופה מקבילים של 0.1 מיקרוגרם, דוקסורוביצין diffusible בחופשיות חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין גרמו לירידה משמעותית כדאיויות תא של 83 ± 11 ו -65 ± 11%, בהתאמה (איור 5). עם זאת, באופן חופשי דוקסורוביצין diffusible הראה רעיל יותר משמעותי מאשר חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין. מדידות כמותיות אלה אומתו על ידי הדמיה איכותית SEM (5c איור). הנה, תרבויות ביקורת הראו צפיפות הסלולר גבוהה mesenchymal predominating מד"א- MB-231 פנוטיפ; תצפיות דומות היו גם עבור תרבויות חשופות חלקיקי משי. עם זאת, תרבויות החשופות דוקסורוביצין הראו פנוטיפ תא שונה במידה ניכרת. במינון דוקסורוביצין המקביל, מד"א- MB-231 תאים שטופלו דוקסורוביצין diffusible בחופשיות חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין הראה ירידה משמעותית מספרים סלולריים. יתר על כן, תאים רבים היו רחבים מאוד ופרש מורפולוגיה. תרבויות exposed חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין הראה עדות של חלקיקים (אגרגטים שלהם) קשורים עם קרום הפלזמה (איור 5 ג).
איור 1: השלבים העיקריים ליצירת פתרון משי חלקיקי משי המהונדס הפוכים ראשי, פקעות משי מתוכננות הפוכות על ידי חיתוך ולאחר מכן degumming אותם במשך 60 דקות (כלומר, רותחים) להניב סיבי משי Degummed.. הסיבים הם מומסים 9.3 M LiBr ואז dialyzed נגד מים במשך 72 שעות. 5% מימית w / פתרון ממשי v משמש להפקת חלקיקים משי. תוספת dropwise של משי לתוך אצטון מוביל nanoprecipitation משי. חלקיקי משי נשטפים ולאסוף לשימוש מאוחר יותר. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זהדמות.
איור 2:. גודל ואפיון אחראי חלקיקי משי גודל חלקיקים ואת פוטנציאל זטא של חלקיקי משי ב 4 ° C ו- 25 ° C מעל 28 ימים. ± SD; ברי שגיאה מוסתרים בתוך סמל העלילה כאשר אינו גלוי, n = 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. להערכת איכות של חלקיקים משי לאחסן 4 ° C ו- 25 ° C מעל 28 ימים חלקיקים משי הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (בר סולם = 1 מיקרומטר). PleASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: אפיון של חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין (Dox-SNPs) (א) Encapsulation יעילה של 232 מיקרוגרם דוקסורוביצין בתגובת כמויות שונות של חלקיקי משי (SNPs);. 2, 6 ו -10 מ"ג של חלקיקי משי. יעילות אנקפסולציה עבור 10 מ"ג ו חלקיקי משי 5 מ"ג גדלה באופן משמעותי בהשוואת חלקיקי משי 2 מ"ג. (ב) חלקיקים בגודל (C) זטא פוטנציאל של חלקיקי משי טעון-דוקסורוביצין לעומת שליטת חלקיקי משי (10 מ"ג של חלקיקי משי). הבדלים משמעותיים סטטיסטית עבור זוגות מדגם נקבעו עם מבחן t. דגימות מרובות הוערכו על ידי ANOVA חד כיווני, ואחריו מבחן פוסט הוק השוואה המרובה של Bonferroni; * P & #60; 0.05, ** P <0.001, ± סטיית תקן; ברי שגיאה מוסתרים בתוך-סמל העלילה כאשר אינו גלוי, n = 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: ב cytotoxicity במבחנה של חלקיקי משי חלקיקי משי טעון-דוקסורוביצין בתאי סרטן השד אנושיים (א) כדאיויות תא של מד"א- MB-231 תאים לאחר מחזור טיפול 72 שעות עם חלקיקי משי (SNPs) (0.01-5 מ"ג. / מ"ל); כרכים לכל טוב היו 100 μl. (ב) כדאי תא של מד"א- MB-231 תאים לאחר מחזור טיפול 72 שעות עם חלקיקי משי 0.1 מ"ג, 0.1 מיקרוגרם של דוקסורוביצין diffusible בחופשיות (DOX) או 0.1 מ"ג של חלקיקי משי עמוס 0.1 מיקרוגרם של דוקסורוביצין (Dox-SNPS). כדאיויות תא הוקטנו סטטיסטי בעקבות חשיפת 0.1 מיקרוגרם של דוקסורוביצין diffusible בחופשיות 0.1 מ"ג של חלקיקי משי עמוסים 0.1 מיקרוגרם של דוקסורוביצין כאשר לעומת השליטה. (C) SEM תמונות של מד"א- MB-231 תאים חשופים (i) בינונית (שליטה), (ii) חלקיקי משי 0.1 מ"ג, (iii) 0.1 מיקרוגרם של דוקסורוביצין diffusible בחופשיות, וכן (iv) חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין ב מינונים שווים ערך (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי בכיוון אחד ANOVA ואחריו מבחן פוסט הוק השוואה המרובה של Bonferroni, ns = לא משמעותי, * P <0.05, ** P <0.001, ± סטיית התקן; ברי שגיאה מוסתרים בתוך-סמל העלילה כאשר אינו גלוי, n = 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות שונות זמינות לייצר חלקיקי משי, כוללים אלכוהול פוליוויניל מיזוג 20, ריסוס ייבוש 21, מתובל מתוך 22, microdot נימי הדפסת 23, סופר הקריטי CO 2 ממטרים 24 ו nanoprecipitation 16,25 (הנסקרת תוך התייחסות 26). עם זאת, nanoprecipitation, בשל הפשטות הכוללת שלה, היא השיטה הפופולרית ביותר להפקת חלקיקי משי. לכן, מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליישם nanoprecipitation להפוך מהונדסים משי לייצר חלקיקים מבוססי משי, שניתן להשתמש בהם עבור מגוון רחב של יישומים, כולל אספקת התרופה האנטי-סרטנית lysosomotropic.
במהלך העשור האחרון, nanoprecipitation הפך לאחד ההליכים הנפוצים ביותר לייצור חלקיקים מבוסס חלבון 29. 16,17 ואחרים קבוצת המחקר שלנו 25,26,30,31 בהצלחה יישם טק זהnology משי; כאן, אנו מציגים פרוטוקול בשלבים פשוט אך חזק עבור הדור של חלקיקי משי. אצטון nanoprecipitation מניב חלקיקי משי כדוריים הומוגניות בגודלם לנפול בדרך כלל בטווח גודל ננומטרי. אצטון התפתחה בשלב הרציף העדיף על פני ממסים כגון מתנול, אתנול, isopropanol ו butanol 16,25. אצטון מניב חלקיקים שיש ברמה מופחתת של הידרציה בהשוואת 100-200 metastable ננומטר בגודל מבני micellar כדוריים נוכח פתרונות משי יליד מחדש 32. עם זאת, יש מרחב לחקור תערובות וריאציות ממסות בזמן degumming על מנת לייצר משי (ננו) חלקיקים בעלי תכונות שונות פוטנציאל לאלה שתוארו כאן. הפרוטוקול המתואר כאן מנצל אצטון כשלב המתמשך, המאפשר הייצור של חלקיקי משי בגודל ננו כדוריים אחידים (106.5 ± 1.1 ננומטר), שנושאים מטען משטח שלילי (-49.5777; 0.6 mV) ויש להם כי אריזה הדוקה של שרשראות הידרופובי, גבישי משי 16,17. בסך הכל, ההליך המתואר דורש על ידות מעט זמן מניב חלקיקי משי מפתרון משי מימי מהונדס הפוך (איור 1). כמה מן התכונות העיקריות של הליך זה כוללות שימוש של 60 דקות משי Degummed, את גודל טיפה המתאים (כ 10 μl / ירידה) ושיעור ושחרור מרבי של 50 טיפות / min. דבקות אלה התכונות העיקריות תוצאה היא תשואה טיפוסית של 14%. חלקיקים אלה הם חזקים ואנחנו מספקים ראיות לכך שהם יציבים ואינם משתנים המאפיינים הפיסיים שלהם על פני תקופת אחסון 28 יום. עם זאת, הערת אזהרת פוטנציאל של השיטה המתוארת היא העדר ליצור חלקיקים על פני טווח גודל רחב (כלומר, יצירת חלקיקים מן ננומטר עד מיקרומטר בקנה מידה תוך שמירה על מדד polydispersity צר).
גודל חלקיקים שליט, לחייב וצורה היא אניmportant עבור משלוח סמים, במיוחד כאשר מיקוד גידולים מוצקים 33. חלקיקים בטווח גודל 100 ננומטר הם מתעוררים מועמדים אידיאליים כפי למיקוד הגידול. לכן, 100 חלקיקי משי ננומטר בגודל הם מתמודדים פוטנציאליים כמערכות משלוח התרופה נגד הסרטן לטיפולי גידולים מוצקים. חלקיקי משי יש מטען משטח שלילי, אשר הופך אותם לטעון בקלות עם תרופות בעלי מטען חשמלי חיובי באמצעות ניצול של האינטראקציה אלקטרוסטטית 16. עם זאת, מלבד תשלום, מאפייני תרופה נוספים (למשל, logD) ידועים גם להשפיע טעינת סמים לשחרר 34. במחקר הנוכחי, דוקסורוביצין, תרופה נגד סרטן בסיסית חלש, נבחר כמועמדת תרופת מודל. המחקר טוען התרופה (איור 4) הראה כי הגדלת ריכוז ננו-חלקיקים משי הוביל יעילות אנקפסולציה דוקסורוביצין מוגברת; 10 מ"ג של חלקיקי משי יכולים לתמצת 232 מיקרוגרם של דוקסורוביצין. טעינת והתרופות של משי נהnoparticles, בתורו, הביא חלקיקי משי עם מטען משטח מופחת באופן משמעותי, שהיו ראיות ניסיוניות ישירות המאשרות כי אינטראקצית תשלום דוקסורוביצין-המשי חשובה שילוב מוביל תרופה מסוימת זו.
סיפקנו בעבר ראיות כי חלקיקים משי יכול לשמש 16,17 מערכת אספקת סמים lysosomotropic. כאן, אנו מציגים מבחן באמצעות חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין לטיפול בסרטן שד אדם שורת תאי מד"א- MB-231. תאים אלה הלקוחים מתוך סרטן שד שלילי פולשנית המשולש ביותר (ER - / PR - / HER2 -) כי הוא קשה לטיפול במרפאת 35. לכן, עיצוב מערכת אספקת סמים המותאמים באוכלוסיית חולים זו צפויה להניב יתרונות עצומים. בהעדר טעינת סמים, חלקיקים משי לא השפיע כדאיות התא (IC 50 ערכים> 5 מ"ג / מ"ל) (איור 5 א, ג). עם זאת, ב שוהמינונים ערכיים, cytotoxicity הגבוה משמעותי נצפו עם דוקסורוביצין diffusible בחופשיות מאשר עם חלקיקי משי טעון דוקסורוביצין (איור 5 ב). ההבדלים בין הפרמקוקינטיקה הסלולר במבחנה של תרופה כבולה diffusible וחלקיק בחופשיות להסביר תצפית זו. תרופת diffusible בחופשיות יכולה לחצות את קרום התא במהירות באמצעות דיפוזיה, ואילו ספיגה של החלקיקים טעוני התרופה מסתמכת על אנדוציטוזה. אף על פי כן, ספיגת endocytic של חלקיקים יכולה לשפר החזקת סמים ולהתגבר מנגנוני עמידות לתרופות 3. עם זאת, היתרון האמיתי של משלוח תרופה אנטי-סרטנית בתיווך nanoparticle הוא שזה מנצל את אפקט EPR כדי להקל מיקוד גידול פסיבי לשיפור הפרמקוקינטיקה. לכן, השימוש בגישת משלוח סמים מבוסס ננו-חלקיק יכול להיות רק להעריך באופן מלא in vivo. במחקרים במבחנה יש מגבלות (כלומר, בהעדר השפעת EPR) שימנע charact המלאerization של סוגים אלה של מערכות אספקת סמים 7.
לסיכום, המתודולוגיה המתוארת מאפשרת ייצור הקל של חלקיקי משי כדוריים של מטען גודל משטח אחיד. חלקיקי משי אלה יכולים לשמש עבור מגוון רחב של יישומים (למשל, קוסמטיקה, תבניות עבור דפוסי ננו, theranostics, חומרי סיכה, חלקיקים מלאים ללימודי nanotoxicity), לרבות השימוש בם כמו פלטפורמות אספקת התרופה אנטי-סרטנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR International, Radnor, PA, USA | 20066.33 | |
| Automated Critical Point Dryer | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM CPD300 | |
| Balancing | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | NewClassic MS | |
| Black polystyrene microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3991 | |
| Capillary cell (DTS 1070) | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | DTS107 | |
| Carbon adhesive disc | Agar Scientific, Essex, UK | G3347N | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany | Z323K | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Avanti J-E, Rotor: J20 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392 | |
| Coater, low vacuum | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM ACE200 | |
| Cuvettes, polystyrene, disposable | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | FB55147 | |
| Doxorubixin | LC Laboratories, Boston, MA, USA | D4000 | |
| Electronic pipetting, Easypet | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| FE-SEM | Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany | SU6600 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 16000-044 | |
| Freeze dryer | Martin Christ, Osterode, Germany | Epsilon 2-4 | |
| Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons | Tajima Shoji, Kanagawa, Japan | N/A | |
| Hotplate with Stirrer | Bibby Scientific, Stanffordshire, UK | US 152 | |
| Incubator | Memmert, Schwabach, Germany | INB 200 | |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 12585-014 | |
| Lithium bromide | Acros Organics, Geel, Belgium | AC199870025 | |
| MDA-MB-231 | ATCC, Manassas, VA, U.S.A | N/A | |
| Micropipette and tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| Microplate Reader | Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA | SpectraMax M5 | |
| Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | N/A | |
| Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | 355645 | |
| Penicilin/streptomycin | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| RPMI medium | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 11875-093 | |
| Serological pipettes, 5 ml | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Silicon wafers | Agar Scientific, Essex, UK | G3391 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 87724 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S/2840/62 | |
| Specimen stubs for SEM | Agar Scientific, Essex, UK | G301 | |
| Ultrasonic homogenizer | Bandelin, Berlin, Germany | Sonoplus HD 2070 | |
| UV transparent microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3635 | |
| Vortex | IKA, Staufen, Germany | Genius 3 | |
| Zetasizer | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | Nano ZS | |
| Zetasizer Software version 7.11 | DLS software | ||
| Micro Modulyo | Thermo Fisher | 230 | Freeze drying system |
References
- Haley, B., Frenkel, E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 26 (1), 57-64 (2008).
- Sun, T., Zhang, Y. S., Pang, B., Hyun, D. C., Yang, M., Xia, Y. Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (46), 12320-12364 (2014).
- Davis, M. E., Chen, Z. G., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (9), 771-782 (2008).
- Sheridan, C. Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nature Biotechnol. 30 (6), 471-473 (2012).
- Matsumura, Y., Hitoshi, M. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res. 46, 6387 (1986).
- De Duve, C., De Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., Van Hoof, F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 23 (18), 2495-2531 (1974).
- Duncan, R., Richardson, S. C. W. Endocytosis and intracellular trafficking as gateways for nanomedicine delivery: opportunities and challenges. Mol. Pharm. 9 (9), 2380-2402 (2012).
- Vishakha, K., Kishor, B., Sudha, R. Natural Polymers - A Comprehensive Review. Int. J. Pharm. Biomed. Res. 3 (4), 1597-1613 (2012).
- Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery. Expert. Opin. Drug Del. 8 (6), 797-811 (2011).
- Thurber, A. E., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157 (2015).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Seib, F. P., Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Self-Assembling Doxorubicin Silk Hydrogels for the Focal Treatment of Primary Breast. Adv. Funct. Mater. 23 (1), 58-65 (2013).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Doxorubicin-loaded silk films: drug-silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials. 33 (33), 8442-8450 (2012).
- Seib, F. P., Coburn, J., et al. Focal therapy of neuroblastoma using silk films to deliver kinase and chemotherapeutic agents in vivo. Acta. Biomater. 20, 32-38 (2015).
- Coburn, J. M., Na, E., Kaplan, D. L. Modulation of vincristine and doxorubicin binding and release from silk films. J. Control. Release. 220, 229-238 (2015).
- Seib, F. P., Jones, G. T., Rnjak-Kovacina, J., Lin, Y., Kaplan, D. L. pH-dependent anticancer drug release from silk nanoparticles. Adv. Healthc. Mater. 2 (12), 1606-1611 (2013).
- Wongpinyochit, T., Uhlmann, P., Urquhart, A. J., Seib, F. P. PEGylated Silk Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery. Biomacromolecules. 16 (11), 3712-3722 (2015).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Silk for Drug Delivery Applications: Opportunities and Challenges. Isr. J. Chem. 53 (9-10), 1-12 (2013).
- Yucel, T., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Silk-based biomaterials for sustained drug delivery. J. Control. Release. 190, 381-397 (2014).
- Wang, X., Yucel, T., Lu, Q., Hu, X., Kaplan, D. L. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials. 31 (6), 1025-1035 (2010).
- Qu, J., Wang, L., Hu, Y., You, R., Li, M. Preparation of Silk Fibroin Microspheres and Its Cytocompatibility. J. Biomater. Nanobiotechnol. 4, 84-90 (2013).
- Lammel, A., Hu, X., Park, S., Kaplan, D., Scheibel, T. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31 (16), 4583-4591 (2010).
- Gupta, V., Aseh, A., Rìos, C. N., Aggarwal, B. B., Mathur, A. B. Fabrication and characterization of silk fibroin-derived curcumin nanoparticles for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine. 4, 115-122 (2009).
- Zhao, Z., et al. Generation of silk fibroin nanoparticles via solution-enhanced dispersion by supercritical CO2. Ind. Eng. Chem. Res. 52 (10), 3752-3761 (2013).
- Tudora, M., Zaharia, C., Stancu, I. Natural silk Fibroin micro-and nanoparticles with potential uses in drug delivery systems. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 75 (1), 43-52 (2013).
- Zhao, Z., Li, Y., Xie, M. B. Silk Fibroin-Based Nanoparticles for Drug Delivery. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4880-4903 (2015).
- Rockwood, D., Preda, R., Yücel, T. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6 (10), 1-43 (2011).
- Seib, F. P., Müller, K., Franke, M., Grimmer, M., Bornhäuser, M., Werner, C. Engineered extracellular matrices modulate the expression profile and feeder properties of bone marrow-derived human multipotent mesenchymal stromal cells. Tissue. Eng. Part A. 15 (10), 3161-3171 (2009).
- Lai, P., Daear, W., Löbenberg, R., Prenner, E. J. Overview of the preparation of organic polymeric nanoparticles for drug delivery based on gelatine, chitosan, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) and polyalkylcyanoacrylate. Colloids Surf., B, Biointerfaces. 118, 154-163 (2014).
- Subia, B., Kundu, S. C. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers. Nanotechnology. 24 (3), 035103 (2013).
- Zhang, Y. Q., Shen, W. D., Xiang, R. L., Zhuge, L. J., Gao, W. J., Wang, W. B. Formation of silk fibroin nanoparticles in water-miscible organic solvent and their characterization. J. Nanopart. Res. 9 (5), 885-900 (2006).
- Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
- Yhr Bae,, Park, K. Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility. J. Control. Release. 153 (3), 198-205 (2011).
- Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials. 32 (8), 2233-2240 (2011).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).
