Summary
Nanodeeltjes zijn in opkomst als veelbelovende dragersystemen voor een groot aantal indicaties. Hier beschrijven we een eenvoudige maar krachtige methode om zijde nanodeeltjes produceren met behulp van reverse engineered Zijdevlinder zijde. Deze zijde nanodeeltjes kunnen gemakkelijk worden geladen met een therapeutische payload en vervolgens verkend voor drug delivery applicaties.
Abstract
Zijde is een veelbelovende biopolymeer voor biomedische en farmaceutische toepassingen vanwege zijn uitstekende mechanische eigenschappen, biologische verenigbaarheid en biologische afbreekbaarheid, en zijn vermogen om te beschermen en vervolgens de lading vrij te geven in reactie op een trigger. Terwijl zijde kan geformuleerd worden in verschillende formaten materiaal zijn zijde nanodeeltjes opkomst als veelbelovende geneesmiddelafgiftesystemen. Daarom dit artikel worden de procedures voor reverse engineering zijdecocons een zijde geregenereerde oplossing die kan worden gebruikt om stabiele zijde nanodeeltjes genereren opleveren. Deze nanodeeltjes worden vervolgens gekarakteriseerd met geneesmiddel beladen en onderzocht als potentiële antikanker geneesmiddelafgiftesysteem. In het kort worden zijdecocons omgekeerde eerst ontwikkeld door ontgommen de cocons, gevolgd door zijde ontbinding en schoon te maken, om een waterige zijde oplossing opleveren. Vervolgens wordt de geregenereerde oplossing zijde onderworpen aan nanoprecipitation aan zijde nanodeeltjes verkregen - een eenvoudige maar krachtige methodedat genereert uniforme nanodeeltjes. De zijden nanodeeltjes worden gekenmerkt volgens hun grootte, zèta-potentiaal, morfologie en stabiliteit in waterige media, evenals hun vermogen om een chemotherapeutisch payload vangen en doden van menselijke borstkankercellen. Kortom, de beschreven werkwijze levert uniform zijde nanodeeltjes die gemakkelijk kunnen worden onderzocht voor een groot aantal toepassingen, waaronder het gebruik als potentiële nanomedicine.
Introduction
Nanogrootte geneesmiddelafgiftesystemen worden vaak gebruikt om geneesmiddelafgifte te regelen en een diverse reeks therapeutische nuttige lading afgeven - bijvoorbeeld, eiwitten, peptiden en kleine moleculaire gewicht drugs - cellen en weefsels te richten. Deze therapeutische ladingen worden vaak verwerkt in verschillende macromoleculaire dragers voor geneesmiddelen, zoals liposomen, in water oplosbare polymeren (inclusief dendrimeren) en micro- en nanodeeltjes 1. Nanodeeltjes (meestal in een groot bereik van 1 nm tot 1000 nm) worden op grote schaal onderzocht als potentiële dragers voor geneesmiddelen, in het bijzonder voor anti-kanker drug delivery 2. De succesvolle introductie van Abraxane (120 nm en kleinbedrijf albumine-based nanodeeltjes geladen met paclitaxel) in de dagelijkse klinische praktijk 3 heeft het veld gekatalyseerd, zodat veel meer nanodeeltjes voor drug delivery nu zijn het invoeren van klinische proeven 4. Solide tumoren algemeen slechte lymfatische drainage en hebben lekkende bloedvaten waardoor nanoparticles tot 200 nm wordt passief worden gericht op deze tumoren na intraveneuze toediening. Deze passieve targeting verschijnsel heet de verhoogde permeabiliteit en retentie (EPR) effect en werd voor het eerst in 1986 5. De EPR effect kan leiden tot een 50- tot 100-voudige toename van de geneesmiddelconcentraties in de tumor micro-omgeving voor een gegeven dosis geneesmiddel indien het geneesmiddel lading wordt geleverd met een macromoleculair geneesmiddeldrager benadering dan het vrije geneesmiddel zonder de drager. Met geneesmiddel beladen nanodeeltjes gemaakt van anti-kanker drug delivery moet de tumor micro bereiken en moeten vaak een specifieke intracellulaire compartiment voeren gewoonlijk door endocytische opname voor het geneesmiddel zijn gewenste therapeutische effect te bereiken 3. Nanodeeltjes ontworpen voor intracellulaire afgifte van geneesmiddelen benutten endocytose als toegangspoort in de cel en een route naar geneesmiddelenresistentie mechanismen overwinnen. Geneesmiddelafgifte uit nanodeeltjes vaak specifiek ontworpen occur in lysosomen (dwz lysosomotrope drug delivery) 6, waar de pH gevoeligheid van de nanodeeltjes carrier (lysosomale pH ongeveer 4,5) als trigger voor geneesmiddelafgifte of lysosomale enzymen die de lading bevrijden van de drager 7 kan dienen.
Veel verschillende soorten materialen kunnen worden gebruikt om nanodeeltjes (bijvoorbeeld metalen en vele organische en anorganische stoffen) te genereren. Echter, biopolymeren opkomst als aantrekkelijke materialen vanwege hun bekende biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en lage toxiciteit 8. Veel biopolymeren worden onderzocht, met inbegrip van albumine, alginaat, chitosan en zijde. Daarvan heeft zijde ontpopt als een veelbelovende kandidaat voor ontwikkeling in drug delivery systemen 9. Zijde van verschillende soorten worden geproduceerd door een aantal geleedpotigen, zoals spinnen (bijvoorbeeld Nephila clavipes) en zijderupsen (bijvoorbeeld Bombyx mori). Zijderups zijde wordt gebruikt veel meer extensluitend dan spinnenzijde omdat de zijderups is volledig geacclimatiseerd en zijn zijde vormt aldus een reproduceerbaar uitgangsmateriaal. Zijderups zijde is een Food and Drug Administration (FDA) goedgekeurd materiaal voor menselijk gebruik, met name als hechtmateriaal; Het heeft een robuust veiligheidsniveau bij de mens en is bekend te worden afgebroken in vivo 10. De afbraak profiel van zijde kan worden afgestemd op variëren van uur (laag kristallijn zijde) tot 12 maanden of meer (hoog kristallijne zijde). Zijde afbraakproducten zijn niet giftig en worden gemetaboliseerd in het lichaam 10. De zijde structuur verleent het vermogen laag molecuulgewicht verbindingen en macromoleculaire eiwitgeneesmiddelen 11 te binden, waardoor het een goed materiaal voor gecontroleerde geneesmiddelafgifte. Eiwitgeneesmiddelen (bijvoorbeeld antilichamen) zijn gevoelig voor denaturatie, aggregatie, proteolytische splitsing en goedkeuring door het immuunsysteem. Echter, zijde stabiliseert therapeutische eiwitten door de buffercapaciteit van de nanokristallijne reregio's en zijn vermogen om watergehalte afstemmen op nanoschaal 11. Deze unieke functies bieden fysieke bescherming en verminderen payload mobiliteit 11 en zijn meestal niet gezien met andere (bio) polymeren. Veel anti-kanker drug delivery systemen, bijvoorbeeld-zijde gebaseerde hydrogels 12, films 13-15 en nanodeeltjes 16,17, zijn inmiddels ontwikkeld om deze mogelijkheden te benutten (beoordeeld in de referenties 18,19)
Hier werden zijde nanodeeltjes gekenmerkt door het bepalen van hun grootte en lading over een langere periode. Doxorubicine, een klinisch relevante geneesmiddel tegen kanker, werd gebruikt als een model geneesmiddel voor geneesmiddelbelading en cytotoxiciteit studies triple negatieve humane borstkankercellen behandeld met geneesmiddel beladen nanodeeltjes zijde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van een reverse engineered Silk Solution van Zijdevlinder cocons
LET OP: Deze methode is gebaseerd op protocollen elders 12,27 beschreven.
- Snijd 5 g gedroogde cocons met een schaar in 5 mm x 5 mm stuks. Verwijder alle vervuilde lagen.
- Weeg 4,24 g natriumcarbonaat en daarna wordt voorzichtig dit 2 liter kokend gedestilleerd water.
Opmerking: Dit levert een 0,02 M natriumcarbonaatoplossing. - Voeg de gesneden stukken de cocon kokende natriumcarbonaatoplossing en kook 60 minuten aan de zijde vezels degum. Roer de zijde af en toe homogeen monster verwerking te waarborgen.
- Verwijder de ontgomde zijde en wassen met 1 liter gedestilleerd water gedurende 20 min; Herhaal de wasstap minstens 3 keer.
- Verwijder de gewassen zijde en knijp het goed om overtollige vloeistof te verwijderen en vervolgens los te maken / trek de zijde met de hand. Plaats de ongebonden zijde in een zuurkast te drogen 's nachts de lucht. Dit geeft gewoonlijk 3,6 g ontgomde silk vezels.
- De volgende dag, afgewogen 5 g lucht gedroogd ontgomde zijde vezels en pak de zijde stevig in de bodem van een 50 ml beker.
- Bereid een verse 9,3 M LiBr oplossing. Los de zijde vezels in LiBr met behulp van een 1 g zijde tot 4 ml LiBr ratio. Bedek de zijde LiBr monster met aluminiumfolie om verdamping te voorkomen en laat de zijde volledig bij 60 ° C oplossen. Deze stap duurt maximaal 4 uur en wordt geholpen door af en toe roeren.
- Bevochtig een dialyse cassette (moleculair gewicht cut-off van 3500 Da) in water gedurende 5 minuten. Injecteer 15 ml van de zijde LiBr oplossing in de 15 ml dialyse cassette en het gebruik van een naald en spuit om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Dialyseren tegen 1 liter gedestilleerd water en het water veranderen 1, 3 en 6 uur (dat wil zeggen 3 wijzigingen op de eerste dag) en opnieuw op de volgende ochtend en avond (dwz 2 wijzigingen op de tweede dag) en weer de volgende ochtend (dwz 1 verandering op de derde dag).
- Verzamel de zijde Solutiop de dialyse cassette en centrifugeer de oplossing gedurende 20 minuten bij 5 ° C bij 9500 x g. Herstellen van de bovenstaande vloeistof en tweemaal meer herhalen dit centrifugeren proces.
- Bepaal het gewicht van een leeg gewicht van de boot (W1) en voeg 1 ml van de zijde oplossing. Registreer het gewicht opnieuw (W2) en droog het monster door het verlaten van het gewicht van de boot bij 60 ° C gedurende de nacht. Vervolgens bepaalt het totale droge gewicht (W3) (gedroogd zijde en weegschuitje). De concentratie van de zijde oplossing (w / v) is:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.
2. Voorbereiding van Silk Nanodeeltjes van reverse-engineering Silk Solution
- Voeg een 5% (w / v) zijde druppelsgewijs aceton terwijl een> 75% (v / v) aceton oplossing. Voeg bijvoorbeeld 9 ml van een 5% (w / v) oplossing druppelsgewijs zijde (10 gl / druppelsgewijs met een snelheid van 50 druppels / min) tot 34 ml aceton.
- Centrifugeer het neerslag bij 48.000 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in gedestilleerd water door eerst de pellet losmaken met een spatel en vervolgens toevoegen 20 ml gedestilleerd water. Gebruik pipet tips om de pellet van de spatel verwijderen. Na vortexen gedurende 20 seconden gevolgd door twee cycli sonicatie gebruikmaking van een ultrasone sonde 30% amplitude gedurende 30 seconden, vul de centrifugebuis capaciteit met gedestilleerd water.
- Herhaal het centrifugeren en resuspensie stap ten minste tweemaal.
- Resuspendeer de pellet in 6 ml gedestilleerd water, zoals beschreven in 2,3 en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Voor celcultuur studies, kan zijde nanodeeltje voorraden zijn gamma bestraald 17.
3. Bepaling van Silk nanodeeltjes Concentratie
- Centrifugeer zijde nanodeeltjes bij 48.000 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Verzamel alle nanodeeltjes in 3 ml gedestilleerd water, gevolgd door sonicatie twee cycli bij 30% amplitude gedurende 30 sec.
- Verdeel de 3 ml voorraad van zijde nanodeeltjes in 2 ml en 1 ml veel en te zetten in pre gewogen 2 ml buizen. Noteer het totale gewicht van de 2 ml monster. Bewaar de partij 1 ml bij 4 ° C tot gebruik; deze 1 ml monster zal worden gebruikt om een kalibratiecurve te genereren.
- Snap bevriezen en vervolgens lyofiliseren de 2 ml zijde nanodeeltjes partij in een vriesdroger 's nachts. Na vriesdrogen, weeg de 2 ml buisje en bereken de hoeveelheid zijde nanodeeltjes (mg) die oorspronkelijk in de 2 ml monster.
- Verdun het 1 ml zijde nanodeeltjes voorraad met gedestilleerd water om een 5-punts kalibratie curve (0,04-7 mg / ml) te genereren. Zorg ervoor dat de monsters niet hoger zijn dan de maximale absorptie.
- Bepaal de absorptie van elke standaard verdunning 600 nm. Dit kan het beste gedaan met behulp van een 96-well plaat setup. Plot absorptie versus concentratie (mg / ml) voor de standaardcurve. gebruik dan deze routinematig standaardcurve om de concentratie van zijde nanodeeltjes in suspensies bepalen.
4. Voorbereiding van doxorubicine geladen Silk Nanodeeltjes
- Los op 1,2 mg doxorubicine HCl in 8 ml gedestilleerd water.
- Vul aan tot 10 ml met gedestilleerd water tot een werkvoorraad opbrengst van 116 ug / ml (0,2 umol / ml).
- Meng 2 ml 0,2 umol / ml doxorubicine oplossing met 200 ui 10, 30 of 50 mg / ml zijde nanodeeltjes in een 2 ml buisje.
- Incubeer de zijde doxorubicine suspensie bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende de nacht op een roterende mixer.
- Vervolgens centrifuge de zijde-doxorubicine suspensie bij 194.000 g gedurende 30 min. Was de doxorubicine beladen zijde nanodeeltjes met gedestilleerd water en twee keer herhaal deze procedure.
- Verzamel de supernatant en noteer het totale volume (het monster wordt gebruikt voor de inkapseling efficiëntie te bepalen).
- Resuspendeer de doxorubicine geladen zijde nanodeeltjes in gedestilleerd water, bescherming tegen licht en bewaar bij 4 ºC until gebruik.
- Pipetteer 200 ul van de supernatant uit stap 4.2.4 in een zwarte microtiterplaat.
- Gebruik een fluorescentie microplaat lezer-doxorubicine geassocieerde fluorescentie te meten op een vaste fotomultiplicator setting.
- Stel de excitatie golflengte 485 nm en emissie golflengte 590 nm en noteer de fluorescentiewaarden.
- Genereer een doxorubicine kalibratiecurve. Zorg ervoor dat metingen worden verworven met identieke instrument instellingen (dat wil zeggen, met een vaste fotomultiplicator instelling). Met de ijkgrafiek, bereken de concentratie doxorubicine in de gecombineerde supernatant. Herhaal deze meting in drie onafhankelijke experimenten.
- Met vergelijking (1) tot inkapselingsefficiëntie bepalen:
5. Analyse van Silk Nanodeeltjes
- Beoordeling van de grootte en de Zeta potentieel van vers bereid en opgeslagen Silk Nanodeeltjes.
- WINKEL zijde nanodeeltjes in gedestilleerd water bij 4 ° C en 25 ° C.
- Meet de grootte en het zeta potentiaal van de zijde nanodeeltjes op dagen 0, 14 en 28 via dynamische lichtverstrooiing (DLS). Stel brekingsindex tot 1,33 voor gedestilleerd water en 1,60 voor eiwit 17. Bereken deeltjesgrootte met de user interface software.
- Morfologische Beoordeling van Silk Nanodeeltjes door Scanning Electron Microscopy (SEM).
- Plaats een carbon lijm disc op een SEM stomp en vervolgens sluit een silicium wafer.
- Verdun zijde nanodeeltjes tot een concentratie van 1 mg / ml. Pipetteer 10 ul van het monster op een siliciumwafel, bevriezen het monster bij -80 ° C overnacht en lyofiliseren middels vriesdrogen systeem volgens de instructies van de fabrikant.
- Coat het monster met een goud laag tot 20 nm dikmet behulp van een lage onderdruk sputter coater.
OPMERKING: Instrument instellingen variëren tussen de modellen. Het model dat hier gebruikt wordt is volledig geautomatiseerd en werkt door alleen de dikte. - Beeldsamples met een rasterelektronenmicroscoop in 5 kV en een 40.000-voudige vergroting.
6. In Vitro Cytotoxiciteit van Control and doxorubicine geladen Silk Nanodeeltjes
- Levensvatbaarheid van de cellen na blootstelling aan Silk Nanodeeltjes.
- Cultuur MDA-MB-231 cellen in RPMI 1640 met 10% v / v FBS. Plaat cellen op met weefselkweek behandelde polystyreen en incuberen in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer bij 37 ° C. Routinematig subcultuur op 80% confluentie om de 2-3 dagen.
- Plaat MDA-MB-231 cellen bij een dichtheid van 2 x 10 4 cellen / cm2 in 96-well platen. Laat de cellen om 's nachts te herstellen.
- Voeg (i) 0,001-1 ug vrij diffundeerbare doxorubicine, (ii) 0,001-0,5 mg zijde nanodeeltjes en 0,1 mg zijde nanodeeltjesgeladen met 0,001-1 ug doxorubicine in 96-wells platen (eindvolume 100 ul per putje).
- Bepalen cellevensvatbaarheid en helft maximale remmende concentratie (IC 50) door toevoeging van (3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT 5 mg / ml in PBS) en 72 uur. Incubate 5 uur voorzichtig laat de putjes met een pipet en los de formazan met 100 pl dimethylsulfoxide. Meet de absorptie bij 560 nm. Herhaal deze meting in drie onafhankelijke experimenten.
NB: De absorptie waarden van onbehandelde controles dienen als referentiewaarde voor 100% levensvatbaarheid van de cellen.
- SEM van cellen blootgesteld aan Silk Nanodeeltjes.
- Zaad MDA-MB-231 cellen op steriele dekglaasjes bij een dichtheid van 2 x 10 4 cellen / cm2. Laat de cellen om 's nachts te herstellen. Blootstellen van de cellen aan de gewenste behandelingsomstandigheden voor 72 uur.
- Fixeer de cellen met 2% v / v glutaaraldehyde in PBS gedurende 30 minuten, wassen met diverstilde water tweemaal, dehydrateren met een ethanol-serie, en kritisch punt drogen van de monsters, zoals elders 28 beschreven.
- Sputteren de vacht van de monsters met een gouden laag tot 20 nm dik met een laag vacuüm sputter coater.
OPMERKING: Instrument instellingen variëren tussen de modellen. Het model dat hier gebruikt wordt is volledig geautomatiseerd en werkt door alleen de dikte. - Afbeelding de monsters met SEM met een elektronenmicroscoop versnelling van 5 kV en 700-voudige vergroting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gegevens werden statistisch geanalyseerd zoals eerder 17 beschreven. t-test van de Student's werd gebruikt voor monster paren en one-way variantie-analyse (ANOVA), gevolgd door meervoudige vergelijking Bonferroni's post hoc test voor meerdere monsters. Een sterretje geeft statistische significantie als volgt: * p <0,05 en ** p <0,001. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) en de getallen tussen haakjes geven het aantal onafhankelijke experimenten.
Geregenereerde zijde werd bereid en vervolgens druppelsgewijs toegevoegd aan aceton zijde nanodeeltjes via nanoprecipitation (figuur 1) te genereren. Deze werkwijze leverde uniform (index van polydispersiteit: 0,1), sferische, zijde nanodeeltjes (106,5 nm ± 1,1) met een negatieve oppervlaktelading (-49,57 ± 0,6 mV) (figuren 2 en 3). Silk nanodeeltjes stvermogen in water werd beoordeeld tot 28 dagen door het bewaken deeltjesgrootte, zeta potentiaal en morfologie (figuren 2 en 3). Via 28 dagen opslagperiode bij ofwel 4 ° C of 25 ° C, geen significante verandering in deeltjesgrootte, lading (figuur 2) of morfologie werd waargenomen (Figuur 3).
Doxorubicine werd als klinisch relevant chemotherapeutisch model geneesmiddel voor geneesmiddelbelading en cytotoxiciteit in vitro studies. Drie verschillende concentraties nanodeeltjes zijde (10, 30 en 50 mg / ml) werden gebruikt om de geneesmiddelbelading capaciteit van de zijde nanodeeltjes beoordelen. De doxorubicine inkapselingsefficiëntie voor 10, 30 en 50 mg / ml zijden nanodeeltjes (dat wil zeggen, 2, 6 of 10 mg zijde en 232 ug doxorubicine) was 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 en 97 ± 0,2%, respectievelijk (Figuur 4A ). De deeltjesgrootte en zetapotentiaal van doxorubicine-loADED zijde nanodeeltjes (10 mg) werden gemeten en vergeleken met 10 mg zijde nanodeeltjes controles. De deeltjesgrootte veranderde niet na geneesmiddelbelading (figuur 4B), terwijl de zeta potentieel van doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde aanzienlijk werd verlaagd van 49,57 ± 0,6 mV tot 43,52 ± 0,37 mV (figuur 4C).
Het vermogen van met geneesmiddel beladen zijde nanodeeltjes doxorubicine leveren en vervolgens doden kankercellen werd in vitro. Menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellen werden blootgesteld aan zijde nanodeeltjes, vrij diffundeerbare doxorubicine en doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde. Levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald na een periode van 72 uur blootstelling. De IC 50-waarden van vrij diffundeerbare doxorubicine en doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde was 0,48 pg / ml en 0,24 pg / ml terwijl de zijde nanodeeltjes hadden een IC50> 5 mg / ml (Figuur 5A).Bij equivalente doses geneesmiddel van 0,1 ug vrij diffundeerbare doxorubicine en doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde veroorzaakte significante dalingen van cellevensvatbaarheid van 83 ± 11 en 65 ± 11%, respectievelijk (figuur 5B). Echter vrij diffundeerbare doxorubicine vertoonden aanzienlijk grotere cytotoxiciteit dan doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde. Deze kwantitatieve metingen werden bevestigd door kwalitatieve SEM beeldvorming (figuur 5c). Hier controlekweken vertoonden hoge celdichtheid en een overheersende mesenchymale MDA-MB-231 fenotype; soortgelijke waarnemingen werden gedaan voor het kweken blootgesteld aan zijde nanodeeltjes. Echter, culturen blootgesteld aan doxorubicine toonde een duidelijk andere cel fenotype. Bij de equivalente dosis doxorubicine, MDA-MB-231 cellen behandeld met vrij diffundeerbaar doxorubicine en doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde toonde een aanzienlijke vermindering van celaantallen. Bovendien hebben veel cellen had een zeer breed en verspreid morfologie. culturen exposed naar doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde vertoonden tekenen van nanodeeltjes (en aggregaten) gekoppeld aan het plasmamembraan (Figuur 5C).
Figuur 1: De belangrijkste stappen om een reverse engineered zijde oplossing en zijde nanodeeltjes genereren Eerst worden zijdecocons reverse engineered door het snijden en vervolgens ontgommen ze gedurende 60 minuten (dat wil zeggen, het koken) tot ontgomde zijde vezels opleveren.. De vezels worden opgelost in 9.3 M LiBr en vervolgens gedialyseerd tegen water gedurende 72 uur. Een waterige 5% w / v oplossing zijde wordt gebruikt om zijde nanodeeltjes genereren. De druppelsgewijze toevoeging van zijde in aceton leidt tot zijde nanoprecipitation. Silk nanodeeltjes worden gewassen en te verzamelen voor later gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze fotofiguur.
Figuur 2:. Grootte en lading karakterisatie van zijde nanodeeltjes Deeltjesgrootte en zeta potentiaal van zijde nanodeeltjes bij 4 ° C en 25 ° C gedurende 28 dagen. ± SD; error bars zijn verborgen binnen het perceel symbool wanneer niet zichtbaar is, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Kwaliteitscontrole zijde nanodeeltjes bewaard bij 4 ° C en 25 ° C gedurende 28 dagen Zijde nanodeeltjes werden afgebeeld met behulp van scanning elektronenmicroscopie (schaal bar = 1 pm). Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Karakterisering van doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde (Dox-SNPs) (A) inkapselingsefficiëntie van 232 ug doxorubicine in reactie op verschillende hoeveelheden zijde nanodeeltjes (SNPs). 2, 6 en 10 mg zijde nanodeeltjes. De inkapselingsefficiëntie van 10 mg en 5 mg zijde nanodeeltjes aanzienlijk toegenomen in vergelijking met 2 mg zijde nanodeeltjes. (B) Deeltjesgrootte en (C) zetapotentiaal van doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde tegenover zijde nanodeeltjes controle (10 mg zijde nanodeeltjes). Statistisch significante verschillen monsterparen werden bepaald met t-test van Student. Meerdere monsters werden beoordeeld door one-way ANOVA gevolgd door meervoudige vergelijkingstest post hoc-test Bonferroni's; * P #60; 0,05, ** p <0,001, ± SD; error bars zijn verborgen binnen de plot-symbool wanneer niet zichtbaar is, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: In vitro cytotoxiciteit van zijde nanodeeltjes en doxorubicine beladen zijde nanodeeltjes in humane borstkankercellen (A) Cellevensvatbaarheid van MDA-MB-231-cellen na 72 uur behandelingscyclus met zijden nanodeeltjes (SNPs) (0,01-5 mg. / ml); volumes per putje waren 100 ul. (B) Levensvatbaarheid van de cellen van MDA-MB-231-cellen na 72 uur behandelingscyclus met 0,1 mg zijde nanodeeltjes, 0,1 ug vrij diffundeerbare doxorubicine (Dox) of 0,1 mg zijde nanodeeltjes geladen met 0,1 ug doxorubicine (Dox-SNP). Cellevensvatbaarheid werd statistisch verminderd na blootstelling aan 0,1 ug vrij diffundeerbare doxorubicine en 0,1 mg zijde nanodeeltjes geladen met 0,1 ug doxorubicine vergeleken met de controle. (C) SEM beelden van MDA-MB-231 cellen blootgesteld aan (i) medium (controle), (ii) 0,1 mg zijde nanodeeltjes, (iii) 0,1 ug vrij diffundeerbare doxorubicine, en (iv) doxorubicine beladen zijde nanodeeltjes op equivalente doses (Schaal bar = 50 pm). Statistische analyse werd uitgevoerd door one-way ANOVA gevolgd door meervoudige vergelijkingstest post hoc-test Bonferroni's, ns = niet significant, * P <0,05, ** P <0,001, ± SD; error bars zijn verborgen binnen de plot-symbool wanneer niet zichtbaar is, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor zijde nanodeeltjes, zoals polyvinylalcohol mengen 20 produceren, sproeidrogen 21, uitzouten 22, capillaire microdot bedrukt 23, superkritisch CO2 precipitatie 24 en nanoprecipitation 16,25 (besproken in referentie 26). Echter, nanoprecipitation door zijn totale eenvoud, is de meest populaire techniek voor het genereren zijde nanodeeltjes. Daarom is het doel van deze studie was te passen nanoprecipitation op reverse-engineered zijde naar zijde gebaseerde nanopartikels die kan worden gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder kanker lysosomotrope geneesmiddelafgifte vervaardigen.
In het afgelopen decennium is nanoprecipitation een van de meest algemene procedures voor de bereiding van op eiwit gebaseerde nanopartikels 29. Onze onderzoeksgroep 16,17 en anderen 25,26,30,31 hebben met succes deze technologie toegepastgie om zijde; Hier presenteren we een eenvoudig maar robuust stapsgewijze protocol voor het genereren van zijde nanodeeltjes. Aceton nanoprecipitation levert bolvormige zijde deeltjes die homogeen in grootte zijn en vallen meestal in de nanometer grootte. Aceton heeft zich ontwikkeld tot de gewenste continue fase boven oplosmiddelen zoals methanol, ethanol, isopropanol en butanol 16,25. Aceton levert nanodeeltjes die een verlaagd niveau van hydratatie vastgesteld vergeleken met de metastabiele 100-200 nm bemeten bolvormige micellaire structuren aanwezig zijn in natieve en geregenereerd zijde 32 oplossingen. Er is echter ruimte om oplosmiddelmengsels en variaties in ontgommen tijd om zijde (nano) deeltjes genereren met mogelijk andere eigenschappen dan de hier beschreven onderzoeken. De hier beschreven protocol maakt gebruik van aceton als de continue fase, die de productie van uniform bolvormige nano-sized zijde deeltjes (106,5 ± 1,1 nm), die een negatieve oppervlaktelading dragen toestaat (-49,5777; 0,6 mV) en die een nauwe pakking van de hydrofobe, kristallijne zijde ketens 16,17. Kortom, de beschreven werkwijze vergt weinig praktische tijd en levert zijde nanodeeltjes van een reverse-engineered zijde waterige oplossing (figuur 1). Enkele belangrijke kenmerken van deze procedure omvatten het gebruik van 60 minuten ontgomd zijde, de geschikte druppelgrootte (ongeveer 10 pl / drop) en een maximale dalende snelheid van 50 druppels / min. Naleving van deze belangrijke functies resulteert in een typische opbrengst van 14%. Deze nanodeeltjes zijn robuust en we kunnen aantonen dat ze stabiel zijn en niet hun fysieke kenmerken over een 28 dagen opslagperiode niet te wijzigen. Echter, een potentieel nadeel van de beschreven werkwijze is de afwezigheid deeltjes over een breed groottetraject (dwz genereren deeltjes van nanometer tot micrometer schaal met behoud van een smalle polydispersiteit index) te genereren.
Controlling deeltjesgrootte, opladen en vorm is important voor afgifte van geneesmiddelen, in het bijzonder wanneer de doelgroep vaste tumoren 33. Deeltjes in de 100 nm orde van grootte zijn in opkomst als ideale kandidaten voor tumor targeting. Daarom, 100 nm en kleinbedrijf zijde nanodeeltjes zijn potentiële kanshebbers als antikanker drug delivery systemen voor de vaste tumor behandelingen. Zijde nanodeeltjes een negatieve oppervlaktelading betreft, waardoor ze gemakkelijk geladen met positief geladen geneesmiddelen door benutting van de elektrostatische interactie 16. Echter, naast kosten, extra drug eigenschappen (bv logD) is ook bekend dat geneesmiddelbelading beïnvloeden en vrijgeven 34. In deze studie, doxorubicine, een zwak basische geneesmiddel tegen kanker, werd gekozen als een model geneesmiddel kandidaat. De geneesmiddelbelading studie (figuur 4) toonde aan dat het verhogen van de concentratie nanodeeltjes zijde geleid tot meer doxorubicine inkapselefficiëntie; 10 mg zijde nanodeeltjes inkapselen 232 ug doxorubicine. Drug laden van de zijde nanoparticles beurt geleid zijde nanodeeltjes met een aanzienlijk verminderd oppervlaktelading die direct experimenteel bewijs bevestigt dat de doxorubicine-zijde lading interactie van belang voor deze specifieke geneesmiddeldrager combinatie was.
We hebben eerder aangetoond dat zijden nanodeeltjes als lysosomotrope drug delivery systeem 16,17 kan dienen. Hier tonen we een test met doxorubicine beladen zijde nanodeeltjes aan de menselijke borstkanker MDA-MB-231 cellijn te behandelen. Deze cellen zijn afgeleid van een zeer invasieve triple negatieve borstkanker (ER - / PR - / HER2 -) die moeilijk te behandelen in de kliniek 35. Daarom ontwerpen van een geneesmiddelafgiftesysteem ontworpen met deze patiëntengroep verwachting enorme voordelen opleveren. Bij gebrek aan geneesmiddelbelading heeft zijden nanodeeltjes laat levensvatbaarheid van de cellen (IC 50-waarden> 5 mg / ml) (Figuur 5a, c). Echter, op equivalent doses significant grotere cytotoxiciteit waargenomen met vrij diffundeerbaar doxorubicine dan met doxorubicine beladen nanodeeltjes zijde (figuur 5b). De verschillen tussen de in vitro cellulaire farmacokinetiek van vrij diffundeerbare en deeltjes gebonden drug uitleggen deze waarneming. De vrij diffundeerbare geneesmiddel kan snel steken de plasmamembraan via diffusie, terwijl de opname van het geneesmiddel beladen nanodeeltjes is gebaseerd op endocytose. Toch kan endocytische opname van nanodeeltjes retentie drug te verbeteren en het overwinnen van resistentie tegen geneesmiddelen mechanismen 3. De werkelijke voordelen van nanodeeltjes gemedieerde antikanker drug delivery is dat exploiteert de EPR effect passieve tumortargeting vergemakkelijken en farmacokinetiek te verbeteren. Daarom wordt het gebruik van nanodeeltjes gebaseerde geneesmiddelafgiftesystemen benadering slechts volledig in vivo bepaald. In vitro studies hebben beperkingen (dat wil zeggen, de afwezigheid van de EPR-effect) dat de volledige charact beletselerization van dit soort geneesmiddelafgiftesystemen 7.
Samengevat, de beschreven methodologie maakt de gemakkelijke bereiding van bolvormige nanodeeltjes zijde van consistente grootte en oppervlaktelading. Deze zijde nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor een groot aantal toepassingen (bijvoorbeeld cosmetica, sjablonen voor nano patroonvorming theranostics, smeermiddelen, Controledeeltjes voor nanotoxiciteit studies), waaronder hun gebruik als anti-kanker drug delivery platforms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR International, Radnor, PA, USA | 20066.33 | |
| Automated Critical Point Dryer | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM CPD300 | |
| Balancing | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | NewClassic MS | |
| Black polystyrene microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3991 | |
| Capillary cell (DTS 1070) | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | DTS107 | |
| Carbon adhesive disc | Agar Scientific, Essex, UK | G3347N | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany | Z323K | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Avanti J-E, Rotor: J20 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392 | |
| Coater, low vacuum | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM ACE200 | |
| Cuvettes, polystyrene, disposable | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | FB55147 | |
| Doxorubixin | LC Laboratories, Boston, MA, USA | D4000 | |
| Electronic pipetting, Easypet | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| FE-SEM | Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany | SU6600 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 16000-044 | |
| Freeze dryer | Martin Christ, Osterode, Germany | Epsilon 2-4 | |
| Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons | Tajima Shoji, Kanagawa, Japan | N/A | |
| Hotplate with Stirrer | Bibby Scientific, Stanffordshire, UK | US 152 | |
| Incubator | Memmert, Schwabach, Germany | INB 200 | |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 12585-014 | |
| Lithium bromide | Acros Organics, Geel, Belgium | AC199870025 | |
| MDA-MB-231 | ATCC, Manassas, VA, U.S.A | N/A | |
| Micropipette and tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| Microplate Reader | Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA | SpectraMax M5 | |
| Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | N/A | |
| Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | 355645 | |
| Penicilin/streptomycin | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| RPMI medium | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 11875-093 | |
| Serological pipettes, 5 ml | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Silicon wafers | Agar Scientific, Essex, UK | G3391 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 87724 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S/2840/62 | |
| Specimen stubs for SEM | Agar Scientific, Essex, UK | G301 | |
| Ultrasonic homogenizer | Bandelin, Berlin, Germany | Sonoplus HD 2070 | |
| UV transparent microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3635 | |
| Vortex | IKA, Staufen, Germany | Genius 3 | |
| Zetasizer | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | Nano ZS | |
| Zetasizer Software version 7.11 | DLS software | ||
| Micro Modulyo | Thermo Fisher | 230 | Freeze drying system |
References
- Haley, B., Frenkel, E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 26 (1), 57-64 (2008).
- Sun, T., Zhang, Y. S., Pang, B., Hyun, D. C., Yang, M., Xia, Y. Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (46), 12320-12364 (2014).
- Davis, M. E., Chen, Z. G., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (9), 771-782 (2008).
- Sheridan, C. Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nature Biotechnol. 30 (6), 471-473 (2012).
- Matsumura, Y., Hitoshi, M. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res. 46, 6387 (1986).
- De Duve, C., De Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., Van Hoof, F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 23 (18), 2495-2531 (1974).
- Duncan, R., Richardson, S. C. W. Endocytosis and intracellular trafficking as gateways for nanomedicine delivery: opportunities and challenges. Mol. Pharm. 9 (9), 2380-2402 (2012).
- Vishakha, K., Kishor, B., Sudha, R. Natural Polymers - A Comprehensive Review. Int. J. Pharm. Biomed. Res. 3 (4), 1597-1613 (2012).
- Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery. Expert. Opin. Drug Del. 8 (6), 797-811 (2011).
- Thurber, A. E., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157 (2015).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Seib, F. P., Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Self-Assembling Doxorubicin Silk Hydrogels for the Focal Treatment of Primary Breast. Adv. Funct. Mater. 23 (1), 58-65 (2013).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Doxorubicin-loaded silk films: drug-silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials. 33 (33), 8442-8450 (2012).
- Seib, F. P., Coburn, J., et al. Focal therapy of neuroblastoma using silk films to deliver kinase and chemotherapeutic agents in vivo. Acta. Biomater. 20, 32-38 (2015).
- Coburn, J. M., Na, E., Kaplan, D. L. Modulation of vincristine and doxorubicin binding and release from silk films. J. Control. Release. 220, 229-238 (2015).
- Seib, F. P., Jones, G. T., Rnjak-Kovacina, J., Lin, Y., Kaplan, D. L. pH-dependent anticancer drug release from silk nanoparticles. Adv. Healthc. Mater. 2 (12), 1606-1611 (2013).
- Wongpinyochit, T., Uhlmann, P., Urquhart, A. J., Seib, F. P. PEGylated Silk Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery. Biomacromolecules. 16 (11), 3712-3722 (2015).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Silk for Drug Delivery Applications: Opportunities and Challenges. Isr. J. Chem. 53 (9-10), 1-12 (2013).
- Yucel, T., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Silk-based biomaterials for sustained drug delivery. J. Control. Release. 190, 381-397 (2014).
- Wang, X., Yucel, T., Lu, Q., Hu, X., Kaplan, D. L. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials. 31 (6), 1025-1035 (2010).
- Qu, J., Wang, L., Hu, Y., You, R., Li, M. Preparation of Silk Fibroin Microspheres and Its Cytocompatibility. J. Biomater. Nanobiotechnol. 4, 84-90 (2013).
- Lammel, A., Hu, X., Park, S., Kaplan, D., Scheibel, T. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31 (16), 4583-4591 (2010).
- Gupta, V., Aseh, A., Rìos, C. N., Aggarwal, B. B., Mathur, A. B. Fabrication and characterization of silk fibroin-derived curcumin nanoparticles for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine. 4, 115-122 (2009).
- Zhao, Z., et al. Generation of silk fibroin nanoparticles via solution-enhanced dispersion by supercritical CO2. Ind. Eng. Chem. Res. 52 (10), 3752-3761 (2013).
- Tudora, M., Zaharia, C., Stancu, I. Natural silk Fibroin micro-and nanoparticles with potential uses in drug delivery systems. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 75 (1), 43-52 (2013).
- Zhao, Z., Li, Y., Xie, M. B. Silk Fibroin-Based Nanoparticles for Drug Delivery. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4880-4903 (2015).
- Rockwood, D., Preda, R., Yücel, T. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6 (10), 1-43 (2011).
- Seib, F. P., Müller, K., Franke, M., Grimmer, M., Bornhäuser, M., Werner, C. Engineered extracellular matrices modulate the expression profile and feeder properties of bone marrow-derived human multipotent mesenchymal stromal cells. Tissue. Eng. Part A. 15 (10), 3161-3171 (2009).
- Lai, P., Daear, W., Löbenberg, R., Prenner, E. J. Overview of the preparation of organic polymeric nanoparticles for drug delivery based on gelatine, chitosan, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) and polyalkylcyanoacrylate. Colloids Surf., B, Biointerfaces. 118, 154-163 (2014).
- Subia, B., Kundu, S. C. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers. Nanotechnology. 24 (3), 035103 (2013).
- Zhang, Y. Q., Shen, W. D., Xiang, R. L., Zhuge, L. J., Gao, W. J., Wang, W. B. Formation of silk fibroin nanoparticles in water-miscible organic solvent and their characterization. J. Nanopart. Res. 9 (5), 885-900 (2006).
- Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
- Yhr Bae,, Park, K. Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility. J. Control. Release. 153 (3), 198-205 (2011).
- Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials. 32 (8), 2233-2240 (2011).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).
