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Bioengineering

सिल्क नैनोकणों के निर्माण और दवा वितरण अनुप्रयोगों

doi: 10.3791/54669 Published: October 8, 2016

Summary

नैनोकणों संकेत की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए के रूप में होनहार दवा वितरण प्रणाली में उभर रहे हैं। यहाँ, हम एक सरल अभी तक शक्तिशाली विधि रिवर्स इंजीनियर बॉम्बिक्स मोरी रेशम का उपयोग रेशम नैनोकणों का निर्माण करने का वर्णन है। ये रेशम नैनोकणों आसानी से एक चिकित्सकीय पेलोड के साथ लोड किया जा सकता है और बाद में दवा वितरण के लिए आवेदन पत्र का पता लगाया।

Abstract

सिल्क अपने बकाया यांत्रिक गुणों, biocompatibility और biodegradability, के रूप में अच्छी तरह से रक्षा के लिए और बाद में इसकी पेलोड जारी करने के लिए एक ट्रिगर के जवाब में अपनी क्षमता के कारण जैव चिकित्सा और दवा अनुप्रयोगों के लिए एक होनहार biopolymer है। रेशम विभिन्न सामग्री प्रारूपों में तैयार किया जा सकता है, रेशम नैनोकणों के रूप में होनहार दवा वितरण प्रणाली में उभर रहे हैं। इसलिए, यह लेख एक पुनर्जीवित रेशम समाधान है कि स्थिर रेशम नैनोकणों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपज के लिए रिवर्स इंजीनियरिंग रेशम कोकून के लिए प्रक्रियाओं को शामिल किया। ये नैनोकणों बाद में विशेषता है, दवा भरी हुई है और एक संभावित कैंसर विरोधी दवा वितरण प्रणाली के रूप में पता लगाया। संक्षेप में, रेशम कोकून रिवर्स पहली कोकून degumming द्वारा, इंजीनियर रेशम विघटन के द्वारा पीछा किया और एक जलीय रेशम समाधान उपज को साफ कर रहे हैं। अगले, पुनर्जीवित रेशम समाधान रेशम नैनोकणों उपज के लिए nanoprecipitation के अधीन है - एक सरल लेकिन शक्तिशाली विधिकि वर्दी नैनोकणों उत्पन्न करता है। रेशम नैनोकणों उनके आकार, जीटा संभावित, आकृति विज्ञान और जलीय मीडिया में स्थिरता, साथ ही उनके एक chemotherapeutic पेलोड फंसाने और मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं को मारने के लिए क्षमता के अनुसार विशेषता है। कुल मिलाकर, वर्णित कार्यप्रणाली वर्दी रेशम नैनोकणों है कि आसानी से आवेदनों की एक बहुत बड़ी संख्या का पता लगाया जा सकता है, एक संभावित nanomedicine के रूप में उनके उपयोग सहित पैदावार।

Introduction

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उदाहरण के लिए, प्रोटीन, पेप्टाइड्स और छोटे आणविक वजन दवाओं के लिए - - कोशिकाओं और ऊतकों को लक्षित करने के नैनो आकार दवा वितरण प्रणाली अक्सर दवा रिहाई को नियंत्रित करने और चिकित्सीय पेलोड की एक विविध सेट वितरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। ये चिकित्सीय पेलोड अक्सर ऐसे liposomes, (dendrimers सहित) पानी में घुलनशील पॉलिमर, और सूक्ष्म और नैनोकणों 1 के रूप में विभिन्न macromolecular दवा वाहक, में शामिल कर रहे हैं। नैनोकणों (आम तौर पर 1 एनएम 1,000 एनएम का एक आकार रेंज में) व्यापक रूप से विशेष रूप से कैंसर विरोधी दवा वितरण के लिए 2, संभावित दवा वाहक के रूप में पता लगाया जा रहा है। (120 एनएम आकार एल्बुमिन आधारित नैनोकणों पैक्लिटैक्सेल के साथ भरी हुई) Abraxane की सफल शुरूआत नियमित नैदानिक अभ्यास 3 में क्षेत्र उत्प्रेरित किया है, तो यह है कि दवा वितरण के लिए कई और अधिक नैनोकणों अब क्लिनिकल परीक्षण 4 प्रवेश कर रहे हैं। ठोस ट्यूमर आम तौर पर गरीब लसीका जल निकासी दिखाने के लिए और टपका हुआ रक्त वाहिकाओं है जो कि n का मतलब200 एनएम के लिए ऊपर की anoparticles निष्क्रिय नसों में प्रशासन के बाद इन ट्यूमर को लक्षित किया जाएगा। यह निष्क्रिय लक्षित कर घटना बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण (EPR) प्रभाव कहा जाता है और पहली बार 1986 5 में बताया गया था। EPR प्रभाव एक 50 से 100 गुना एक दिया दवा खुराक जब ट्यूमर microenvironment के भीतर दवा सांद्रता में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं दवा पेलोड नि: शुल्क दवा एक macromolecular दवा वाहक दृष्टिकोण के बजाय वाहक के बिना उपयोग कर दिया है। दवा भरी हुई कैंसर विरोधी दवा वितरण के लिए डिज़ाइन किया गया नैनोकणों ट्यूमर microenvironment पहुँचना है और अक्सर दवा के अपने वांछित उपचारात्मक प्रभाव 3 को प्राप्त करने के लिए, एक विशिष्ट intracellular डिब्बे दर्ज करना होगा आमतौर पर endocytic तेज से। intracellular दवा वितरण के लिए डिज़ाइन किया गया नैनोकणों सेल में एक प्रवेश द्वार के रूप में भी एक मार्ग दवा प्रतिरोध तंत्र पर काबू पाने के रूप में endocytosis शोषण। नैनोकणों से दवा रिहाई अक्सर विशेष ओ करने के लिए डिज़ाइन किया गया हैलाइसोसोम में ccur (यानी, lysosomotropic दवा वितरण) 6 जहां nanoparticle वाहक का पीएच जवाबदेही (लाइसोसोमल पीएच लगभग 4.5) दवा रिहाई या लाइसोसोमल एंजाइमों कि वाहक 7 से पेलोड आजाद कराने के लिए ट्रिगर के रूप में सेवा कर सकते हैं।

सामग्री के कई अलग अलग वर्गों के नैनोकणों (जैसे, धातु और कई कार्बनिक और अकार्बनिक सामग्री) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, biopolymers अपने निर्धारित biocompatibility, biodegradability और कम विषाक्तता की वजह से 8 के रूप में आकर्षक सामग्री उभर रहे हैं। कई biopolymers एल्बुमिन, alginate, chitosan और रेशम सहित पता लगाया जा रहा है। इनमें से रेशम दवा वितरण प्रणाली 9 में विकास के लिए एक आशाजनक दावेदार के रूप में उभरा है। विभिन्न प्रकार के रेशम मकड़ियों (जैसे, Nephila clavipes) और रेशम के कीड़ों (जैसे, बॉम्बिक्स मोरी) सहित arthropods के एक नंबर से उत्पादित कर रहे हैं। रेशमकीट रेशम कहीं अधिक exten प्रयोग किया जाता हैsively मकड़ी के रेशम से क्योंकि रेशम के कीड़ों को पूरी तरह से पालतू है और इसकी रेशम इस प्रकार एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रारंभिक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है। रेशमकीट रेशम एक खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) विशेष रूप से एक सिवनी सामग्री के रूप में मानव उपयोग के लिए सामग्री को मंजूरी दे दी है; यह मानव में एक मजबूत सुरक्षा रिकॉर्ड है और इन विवो 10 में नीचा करने के लिए जाना जाता है। रेशम की गिरावट प्रोफ़ाइल 12 महीने या उससे अधिक (उच्च क्रिस्टलीय रेशम) घंटे (कम क्रिस्टलीय रेशम) से लेकर ठीक-देखते हो सकता है। सिल्क गिरावट उत्पादों गैर विषैले होते हैं और शरीर में 10 metabolized हैं। रेशम संरचना, छोटे आणविक भार यौगिकों और macromolecular प्रोटीन दवाओं 11 बाध्य करने की क्षमता प्रदान करता है इसे नियंत्रित दवा रिहाई के लिए एक अच्छी सामग्री बना रही है। प्रोटीन दवाओं (जैसे, एंटीबॉडी) विकृतीकरण, एकत्रीकरण, प्रोटिओलिटिक दरार और निकासी प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। हालांकि, रेशम अपनी nanocrystalline पुन की प्रतिरोधक क्षमता के कारण चिकित्सीय प्रोटीन स्थिरgions और nanoscale 11 में पानी की सामग्री से तैयार करने की इसकी क्षमता। इन अद्वितीय विशेषताओं के भौतिक सुरक्षा प्रदान करने और पेलोड गतिशीलता 11 को कम करने और आम तौर पर अन्य (जैव) पॉलिमर के साथ नहीं देखा जाता है। कई कैंसर विरोधी दवा वितरण प्रणाली, उदाहरण के रेशम आधारित हाइड्रोजेल 12, फिल्मों 13-15 और नैनोकणों 16,17 के लिए, अब (संदर्भ 18,19 में समीक्षा) इन सुविधाओं का फायदा उठाने के लिए विकसित किया गया है

इधर, रेशम नैनोकणों एक विस्तारित समय सीमा से अधिक उनके आकार और आरोप का निर्धारण करने की विशेषता थे। डॉक्सोरूबिसिन, एक चिकित्सकीय प्रासंगिक कैंसर विरोधी दवा, ट्रिपल नकारात्मक मानव स्तन कैंसर की दवा से भरी हुई रेशम नैनोकणों के साथ इलाज किया कोशिकाओं में नशीली दवाओं के लदान और cytotoxicity के अध्ययन के लिए एक मॉडल दवा के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

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Protocol

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1. बॉम्बिक्स मोरी कोकून से एक रिवर्स इंजीनियर सिल्क समाधान की तैयारी

नोट: इस कार्यप्रणाली कहीं और 12,27 वर्णित प्रोटोकॉल पर आधारित है।

  1. 5 मिमी एक्स 5 मिमी टुकड़ों में कैंची के साथ सूखे कोकून के 5 ग्राम कट। किसी भी गंदे परतों निकालें।
  2. सोडियम कार्बोनेट की 4.24 ग्राम वजन और आसुत जल उबलते के 2 एल को ध्यान से इस जोड़ें।
    नोट: यह एक 0.02 एम सोडियम कार्बोनेट समाधान अर्जित करता है।
  3. उबलते सोडियम कार्बोनेट समाधान करने के लिए कटौती कोकून के टुकड़े जोड़ें और 60 मिनट के रेशम फाइबर degum करने के लिए फोड़ा। कभी कभी रेशम हिलाओ समरूप नमूना प्रसंस्करण सुनिश्चित करने के लिए।
  4. degummed रेशम निकालें और 20 मिनट के लिए आसुत पानी का 1 एल से धो लें; धोने कदम दोहराने में कम से कम 3 बार।
  5. धोया रेशम निकालें और यह अच्छी तरह निचोड़ अतिरिक्त तरल निकालने और फिर खोल दिया गया / हाथ से रेशम खींचने के लिए। सूखी रात भर हवा के लिए एक धूआं हुड में खुल रेशम रखें। यह आमतौर पर degummed एस के 3.6 ग्राम पैदावारजैसे लोग फाइबर।
  6. अगले दिन, 5 ग्राम हवा सूखे degummed रेशम फाइबर वजन और रेशम एक 50 मिलीलीटर बीकर के तल में कसकर पैक।
  7. एक ताजा 9.3 एम LiBr समाधान तैयार है। 4 मिलीलीटर LiBr अनुपात करने के लिए एक 1 ग्राम रेशम का उपयोग LiBr में रेशम फाइबर भंग। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ रेशम LiBr नमूना वाष्पीकरण को रोकने और रेशम पूरी तरह से 60 डिग्री सेल्सियस भंग करने के लिए अनुमति देने के लिए कवर। यह कदम 4 घंटा तक लग जाते हैं और कभी कभी क्रियाशीलता द्वारा सहायता प्राप्त है।
  8. 5 मिनट के लिए पानी में एक डायलिसिस कैसेट (3,500 दा की आणविक वजन कट ऑफ) गीला। 15 इंजेक्षन मिलीलीटर 15 मिलीलीटर डायलिसिस कैसेट में रेशम LiBr समाधान और किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक सुई और सिरिंज का उपयोग करें।
  9. आसुत जल के 1 एल के खिलाफ Dialyze और (यानी, पहले दिन 3 परिवर्तन) और फिर अगली सुबह और शाम को (यानी, दूसरे दिन 2 परिवर्तन), और फिर पर 1, 3 और 6 घंटा पर पानी बदल निम्नलिखित सुबह (यानी, 1 तीसरे दिन परिवर्तन)।
  10. रेशम soluti लीजिएडायलिसिस कैसेट और सेंट्रीफ्यूज पर 9500 x जी 5 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए समाधान से पर। सतह पर तैरनेवाला ठीक है और इस प्रक्रिया में दो बार centrifugation अधिक दोहराएँ।
  11. एक खाली वजन नाव (W1) का वजन निर्धारित और रेशम समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। फिर से (डब्ल्यू 2) वजन रिकॉर्ड और फिर 60 डिग्री सेल्सियस पर वजन नाव रात भर छोड़ कर नमूना सूखी। अगले, कुल सूखी वजन (डब्ल्यू 3) (सूखे रेशम और वजन नाव) का निर्धारण। रेशम समाधान की एकाग्रता (डब्ल्यू / वी) है:% = (डब्ल्यू 3-W1 / डब्ल्यू 2-W1) x 100।

रिवर्स इंजीनियर रेशम समाधान से सिल्क नैनोकणों के 2. तैयारी

  1. एक 5% (w / v) रेशम समाधान dropwise एसीटोन, जबकि एक> 75% (वी / वी) एसीटोन समाधान को बनाए रखने जोड़ें। उदाहरण के लिए, एक 5% के 9 मिलीलीटर जोड़ने (डब्ल्यू / वी) रेशम समाधान dropwise 34 मिलीलीटर एसीटोन (10 μl / 50 बूँदें / मिनट की दर से ड्रॉप)।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 48,000 XG पर वेग अपकेंद्रित्र।
  3. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पेले resuspendपहले एक रंग के साथ गोली dislodging और फिर 20 मिलीलीटर आसुत जल जोड़कर आसुत जल में टी। रंग से दूर करने के लिए गोली pipet सुझावों का प्रयोग करें। आसुत जल के साथ क्षमता को अपकेंद्रित्र ट्यूब 20 दो sonication चक्रों के बाद सेकंड के लिए vortexing 30 सेकंड के लिए 30% आयाम पर एक अल्ट्रासोनिक जांच का उपयोग, शीर्ष करने के बाद।
  4. centrifugation और मेजबान कदम पर कम से कम दो बार दोहराएँ।
  5. आसुत जल, के रूप में उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 2.3 और दुकान में विस्तृत 6 मिलीलीटर में गोली Resuspend। सेल संस्कृति के अध्ययन के लिए, रेशम nanoparticle शेयरों गामा किरणित 17 हो सकती है।

3. सिल्क Nanoparticle एकाग्रता का निर्धारण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 48,000 XG पर अपकेंद्रित्र रेशम नैनोकणों।
  2. आसुत जल के 3 मिलीलीटर, 30 सेकंड के लिए 30% आयाम पर दो sonication चक्रों के बाद में सभी नैनोकणों लीजिए।
  3. 2 मिलीग्राम और 1 मिलीलीटर बहुत सारी में रेशम नैनोकणों के 3 मिलीलीटर शेयर फूट डालो और जनसंपर्क में स्थानांतरित2 मिलीलीटर ट्यूबों ई-तौला। 2 मिलीलीटर नमूने के कुल वजन रिकॉर्ड। उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर बहुत स्टोर; इस 1 मिलीलीटर नमूना एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  4. स्नैप फ्रीज और फिर रात भर एक फ्रीज ड्रायर में 2 मिलीलीटर रेशम nanoparticle बहुत lyophilize। फ्रीज सुखाने के बाद, 2 मिलीलीटर ट्यूब reweigh और रेशम नैनोकणों (एमजी) कि मूल रूप से 2 मिलीलीटर नमूने में मौजूद था की राशि की गणना।
  5. आसुत जल के साथ 1 मिलीलीटर रेशम nanoparticle शेयर पतला एक 5 सूत्री अंशांकन वक्र (0.04-7 मिलीग्राम / एमएल) उत्पन्न करने के लिए। सुनिश्चित करें कि नमूने absorbance के अधिकतम से अधिक नहीं है।
  6. 600 एनएम पर प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के absorbance निर्धारित करते हैं। यह सबसे अच्छा एक 96 अच्छी तरह से थाली सेटअप का उपयोग किया जाता है। प्लॉट absorbance बनाम एकाग्रता (मिलीग्राम / एमएल) मानक वक्र के लिए। फिर निलंबन में रेशम नैनोकणों की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए नियमित रूप से इस मानक वक्र का उपयोग करें।

4. डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई सिल्क नैनोकणों की तैयारी

  1. आसुत जल 8 मिलीलीटर में डॉक्सोरूबिसिन एचसीएल की 1.2 मिलीग्राम भंग।
  2. आसुत जल के साथ 10 मिलीलीटर के लिए कर 116 माइक्रोग्राम / एमएल (0.2 μmol / एमएल) के एक काम शेयर उपज के लिए।
  • डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई सिल्क नैनोकणों की तैयारी
    1. 10, 30 या 50 मिलीग्राम / 2 मिलीलीटर ट्यूब में रेशम के नैनोकणों एमएल के 200 μl के साथ 0.2 μmol / एमएल डॉक्सोरूबिसिन समाधान के 2 मिलीलीटर मिक्स।
    2. कमरे के तापमान एक घूर्णन मिक्सर पर (25 डिग्री सेल्सियस) रातोंरात पर सिल्क डॉक्सोरूबिसिन निलंबन सेते हैं।
    3. इसके बाद, 30 मिनट के लिए 194,000 XG पर सिल्क डॉक्सोरूबिसिन निलंबन अपकेंद्रित्र। आसुत जल के साथ डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों धोएं और इस प्रक्रिया में दो बार अधिक दोहराएँ।
    4. सतह पर तैरनेवाला पूल और कुल मात्रा ध्यान दें (इस नमूने encapsulation क्षमता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है)।
    5. आसुत जल में डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों Resuspend, 4 डिग्री सेल्सियस संयुक्त राष्ट्र में प्रकाश और दुकान से बचाने केउपयोग तिल।
  • एन्कैप्सुलेशन दक्षता एवं औषधि लोड हो रहा है का निर्धारण
    1. Pipet एक काले रंग की microtiter थाली में कदम 4.2.4 से सतह पर तैरनेवाला के 200 μl।
    2. एक निश्चित photomultiplier सेटिंग में डॉक्सोरूबिसिन जुड़े प्रतिदीप्ति मापने के लिए एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का प्रयोग करें।
    3. 590 एनएम के लिए 485 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के लिए उत्तेजना तरंगदैर्ध्य सेट और प्रतिदीप्ति मूल्यों रिकॉर्ड है।
    4. एक डॉक्सोरूबिसिन अंशांकन वक्र उत्पन्न करता है। सुनिश्चित करें माप समान साधन सेटिंग्स (यानी, एक निश्चित photomultiplier की स्थापना के साथ) के साथ हासिल किया है। अंशांकन वक्र का उपयोग करना, संयुक्त सतह पर तैरनेवाला में डॉक्सोरूबिसिन एकाग्रता की गणना। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में इस माप दोहराएँ।
    5. encapsulation क्षमता का निर्धारण करने के लिए समीकरण (1) का उपयोग करें:
      1 समीकरण
  • 5. सिल्क नैनो की विशेषताकणों

    1. आकार और हौसले से तैयार और संग्रहित सिल्क नैनोकणों की क्षमता जीटा का आकलन।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस पर आसुत जल में स्टोर रेशम नैनोकणों।
      2. 0 दिन, 14 और 28 गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) के प्रयोग पर रेशम नैनोकणों के आकार और जीटा संभावित उपाय। प्रोटीन 17 के लिए आसुत जल के लिए 1.33 और 1.60 के लिए अपवर्तक सूचकांक निर्धारित करें। यूजर इंटरफेस सॉफ्टवेयर के साथ कण आकार की गणना।
    2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा सिल्क नैनोकणों के रूपात्मक आकलन (SEM)।
      1. एक SEM ठूंठ पर एक कार्बन चिपकने वाला डिस्क की जगह और बाद में एक सिलिकॉन वेफर देते हैं।
      2. 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए रेशम नैनोकणों पतला। पिपेट एक सिलिकॉन वेफर पर नमूना के 10 μl, -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज और रात भर निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक फ्रीज सुखाने प्रणाली का उपयोग करते हुए lyophilize।
      3. कोट एक सोने के साथ नमूना 20 एनएम मोटी परतएक कम निर्वात धूम coater का उपयोग कर।
        नोट: साधन सेटिंग्स मॉडलों के बीच बदलती हैं। यहां इस्तेमाल किया मॉडल पूरी तरह से स्वचालित है और केवल मोटाई से चल रही है।
      4. 5 केवी पर एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और एक 40,000 गुना बढ़ाई साथ छवि नमूने हैं।

    6. नियंत्रण के इन विट्रो cytotoxicity और डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई सिल्क नैनोकणों में

    1. सेल व्यवहार्यता सिल्क नैनोकणों के लिए जोखिम के बाद।
      1. के साथ 10% वी / वी FBS RPMI 1640 में संस्कृति एमडीए MB-231 कोशिकाओं। टिशू कल्चर पर प्लेट कोशिकाओं polystyrene इलाज किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5% सीओ 2 माहौल में सेते हैं। नियमित तौर पर हर 2-3 दिन में 80% संगम पर उपसंस्कृति।
      2. 96 अच्छी तरह से प्लेट में 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व पर थाली एमडीए MB-231 कोशिकाओं। कोशिकाओं रात भर ठीक करने के लिए अनुमति दें।
      3. (I) माइक्रोग्राम स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन .001-1 जोड़ें, (ii) 0.001-0.5 मिलीग्राम रेशम नैनोकणों और 0.1 मिलीग्राम रेशम नैनोकणों96 अच्छी तरह प्लेटें (अंतिम मात्रा अच्छी तरह से प्रति 100 μl) में माइक्रोग्राम डॉक्सोरूबिसिन .001-1 के साथ भरा हुआ है।
      4. सेल व्यवहार्यता और आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी 50) (3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT 5 मिलीग्राम / पीबीएस में एमएल) पर 72 घंटा जोड़कर निर्धारित करते हैं। सेते 5 घंटे के लिए, ध्यान से एक विंदुक के साथ कुओं नाली और dimethylsulfoxide के 100 μl के साथ formazan भंग। 560 एनएम पर absorbance के उपाय। तीन स्वतंत्र प्रयोगों में इस माप दोहराएँ।
        ध्यान दें: अनुपचारित नियंत्रण के absorbance मूल्यों 100% सेल व्यवहार्यता के लिए एक संदर्भ मूल्य के रूप में सेवा करते हैं।
    2. सिल्क नैनोकणों के संपर्क में कोशिकाओं के SEM।
      1. 2 एक्स 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी के घनत्व पर बाँझ कांच coverslips पर बीज एमडीए MB-231 कोशिकाओं। कोशिकाओं रात भर ठीक करने के लिए अनुमति दें। 72 घंटे के लिए वांछित उपचार की स्थिति के लिए कोशिकाओं को बेनकाब।
      2. 30 मिनट के लिए साथ पीबीएस में 2% वी / वी glutaraldehyde कोशिकाओं को ठीक करें, Di से धो लेंसुन्न पानी में दो बार, एक इथेनॉल श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण, और के रूप में कहीं 28 विस्तृत महत्वपूर्ण बिंदु, नमूने सूखी।
      3. कोट एक स्वर्ण के साथ नमूने 20 एनएम के लिए ऊपर परत मोटी एक कम निर्वात धूम coater का उपयोग कर धूम।
        नोट: साधन सेटिंग्स मॉडलों के बीच बदलती हैं। यहां इस्तेमाल किया मॉडल पूरी तरह से स्वचालित है और केवल मोटाई से चल रही है।
      4. छवि SEM द्वारा नमूने 5 केवी और 700 गुना बढ़ाई के एक इलेक्ट्रॉन त्वरण का उपयोग कर।

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    Representative Results

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    डेटा सांख्यिकीय रूप में पहले 17 में विस्तृत विश्लेषण किया गया। छात्र की टी परीक्षण नमूना जोड़े और विचरण (एनोवा) की एक तरह से विश्लेषण Bonferroni एकाधिक तुलना कई नमूने के लिए पोस्ट अस्थायी परीक्षण के बाद के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस प्रकार के रूप में एक तारांकित सांख्यिकीय महत्व को दर्शाता है: * पी <0.05 और ** पी <0.001। सभी डेटा मतलब मूल्यों ± मानक विचलन (एसडी) और कोष्ठक में संख्या स्वतंत्र प्रयोगों की संख्या का संकेत के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं।

    पुनर्जीवित रेशम समाधान तैयार किया गया था और बाद में nanoprecipitation के माध्यम से रेशम नैनोकणों (चित्रा 1) उत्पन्न करने के लिए एसीटोन के लिए dropwise जोड़ा। इस विधि झुकेंगे वर्दी (polydispersity सूचकांक: 0.1) एक नकारात्मक सतह प्रभारी के साथ, गोलाकार, रेशम नैनोकणों (1.1 ± 106.5 एनएम) (-49.57 एम वी ± 0.6) (आंकड़े 2 और 3)। सिल्क nanoparticle सेंटपानी में क्षमता कणों आकार, जीटा संभावित और आकृति विज्ञान (आंकड़े 2 और 3) की निगरानी के द्वारा अप करने के लिए 28 दिनों के लिए मूल्यांकन किया गया था। 28 दिन के भंडारण अवधि के दौरान, या तो 4 डिग्री सेल्सियस या 25 डिग्री सेल्सियस पर, कण आकार, प्रभारी (चित्रा 2) या आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन (चित्रा 3) मनाया गया।

    डॉक्सोरूबिसिन दवा लोड करने के लिए एक चिकित्सकीय प्रासंगिक कीमोथेराप्युटिक मॉडल दवा के रूप में और इन विट्रो cytotoxicity अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। तीन अलग अलग रेशम nanoparticle सांद्रता (10, 30 और 50 मिलीग्राम / एमएल) रेशम नैनोकणों दवा लदान क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। 10, 30 और 50 मिलीग्राम / एमएल रेशम नैनोकणों के लिए डॉक्सोरूबिसिन encapsulation दक्षता (यानी, 2, 6 या रेशम के 10 मिलीग्राम और डॉक्सोरूबिसिन की 232 माइक्रोग्राम) 73 ± 2.2, 87 ± 1.8 और 97 ± 0.2%, क्रमशः (चित्रा -4 ए था )। कण आकार और डॉक्सोरूबिसिन लो की क्षमता जीटाaded रेशम नैनोकणों (10 मिलीग्राम) मापा और 10 मिलीग्राम रेशम nanoparticle नियंत्रण करने के लिए की तुलना में थे। जबकि डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों के जीटा संभावित काफी 43.52 ± 0.37 एम वी (चित्रा 4C) को 49.57 ± 0.6 एम वी से कम हो गया था कण आकार, दवा लोड हो रहा है (चित्रा 4 बी) के बाद भी नहीं बदला।

    दवा भरी हुई रेशम नैनोकणों की क्षमता डॉक्सोरूबिसिन देने और बाद में मारने के लिए कैंसर की कोशिकाओं को इन विट्रो में मूल्यांकन किया गया था। मानव स्तन कैंसर एमडीए MB-231 कोशिकाओं रेशम नैनोकणों, स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन या डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों से अवगत कराया गया। सेल व्यवहार्यता एक 72 घंटा जोखिम अवधि के बाद मूल्यांकन किया गया था। स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन और डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों के आईसी 50 मूल्यों, 0.48 माइक्रोग्राम / एमएल और 0.24 माइक्रोग्राम / एमएल थे क्रमशः जबकि रेशम नैनोकणों एक आईसी 50> 5 मिलीग्राम / एमएल (चित्रा 5 ए) था।0.1 माइक्रोग्राम के बराबर दवा खुराक में, स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन और डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों के 83 ± 11 और 65 ± 11%, क्रमशः (चित्रा 5 ब) सेल व्यवहार्यता में महत्वपूर्ण घटने का कारण बना। हालांकि, स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों से पर्याप्त अधिक से अधिक cytotoxicity दिखाया। ये मात्रात्मक मापन गुणात्मक SEM इमेजिंग (चित्रा 5C) से मंडित कर रहे थे। इधर, नियंत्रण संस्कृतियों उच्च सेलुलर घनत्व और एक predominating mesenchymal एमडीए MB-231 phenotype दिखाया, इसी तरह की टिप्पणियों रेशम नैनोकणों से अवगत कराया संस्कृतियों के लिए किए गए थे। हालांकि, डॉक्सोरूबिसिन से अवगत कराया संस्कृतियों एक स्पष्ट रूप से अलग सेल phenotype दिखाया। बराबर डॉक्सोरूबिसिन खुराक में एमडीए MB-231 कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन और डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों के साथ इलाज सेल संख्या में काफी कमी देखी गई। इसके अलावा, कई कोशिकाओं को एक बहुत व्यापक था और आकृति विज्ञान फैल गए। संस्कृतियों ऍक्स्पडॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों के लिए osed नैनोकणों (और उनके समुच्चय) प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 5C) के साथ जुड़े का सबूत से पता चला है।

    आकृति 1
    चित्रा 1: महत्वपूर्ण कदम एक रिवर्स इंजीनियर रेशम समाधान और रेशम नैनोकणों उत्पन्न करने के लिए सबसे पहले, रेशम कोकून रिवर्स 60 मिनट के लिए और फिर काटने degumming उन्हें (यानी, उबलते) degummed रेशम फाइबर उपज से इंजीनियर हैं।। फाइबर 9.3 एम LiBr में भंग कर दिया और उसके बाद 72 घंटे के लिए पानी के खिलाफ dialyzed रहे हैं। एक जलीय 5% w / v रेशम समाधान रेशम नैनोकणों उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एसीटोन में रेशम की dropwise अलावा रेशम nanoprecipitation की ओर जाता है। सिल्क नैनोकणों धोया और बाद में उपयोग के लिए इकट्ठा कर रहे हैं। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंचित्रा।

    चित्र 2
    चित्रा 2:। आकार और रेशम नैनोकणों के आरोप लक्षण वर्णन कण आकार और 4 डिग्री सेल्सियस पर रेशम नैनोकणों के जीटा संभावित और 28 दिनों में 25 डिग्री सेल्सियस। ± एसडी; त्रुटि सलाखों साजिश प्रतीक के भीतर छिपे हुए हैं जब दिखाई नहीं, एन = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3:। 4 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत रेशम नैनोकणों की गुणवत्ता के आकलन के 28 से अधिक दिनों सिल्क नैनोकणों स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged थे (स्केल बार = 1 माइक्रोन)। मिसालएएसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों की विशेषता (Dox-SNPs) (ए) एन्कैप्सुलेशन अलग (SNPs) रेशम नैनोकणों की मात्रा के जवाब में 232 माइक्रोग्राम डॉक्सोरूबिसिन की क्षमता;। रेशम नैनोकणों के 2, 6 और 10 मिग्रा। जब 2 मिलीग्राम रेशम नैनोकणों की तुलना में 10 मिलीग्राम और 5 मिलीग्राम रेशम नैनोकणों के लिए encapsulation दक्षता में काफी वृद्धि हुई है। (बी) के कण आकार और (सी) जीटा रेशम नैनोकणों पर नियंत्रण की तुलना में डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों की क्षमता (रेशम नैनोकणों के 10 मिलीग्राम)। सांख्यिकीय नमूना जोड़े के लिए महत्वपूर्ण मतभेद छात्र टी-परीक्षण के साथ निर्धारित किया गया है। कई नमूने एक तरह से एनोवा, Bonferroni एकाधिक तुलना पोस्ट अस्थायी परीक्षण के बाद द्वारा मूल्यांकन किया गया; * पी & #60, 0.05, ** पी <0.001, ± एसडी; त्रुटि सलाखों साजिश प्रतीक के भीतर छिपे हुए हैं जब दिखाई नहीं, एन = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 5
    चित्रा 5: रेशम नैनोकणों और मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं में डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों के इन विट्रो cytotoxicity में (ए) सेल रेशम नैनोकणों (SNPs) के साथ एक 72 घंटा उपचार चक्र के बाद एमडीए MB-231 कोशिकाओं की व्यवहार्यता (0.01-5 मिलीग्राम। / एमएल); अच्छी तरह से प्रति की मात्रा 100 μl थे। (बी) 0.1 मिलीग्राम रेशम नैनोकणों के साथ एक 72 घंटा उपचार चक्र के बाद एमडीए MB-231 कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता, स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन के 0.1 माइक्रोग्राम (Dox) या 0.1 माइक्रोग्राम डॉक्सोरूबिसिन की (Dox-एस के साथ भरी हुई रेशम नैनोकणों के 0.1 मिलीग्रामएनपीएस)। सेल व्यवहार्यता सांख्यिकीय रूप से स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन के 0.1 माइक्रोग्राम और डॉक्सोरूबिसिन के 0.1 माइक्रोग्राम के साथ भरी हुई रेशम नैनोकणों के 0.1 मिलीग्राम तक प्रदर्शन के बाद कम था जब नियंत्रण की तुलना में। एमडीए MB-231 (i) मध्यम (नियंत्रण) के संपर्क में कोशिकाओं, (ii) 0.1 मिलीग्राम रेशम नैनोकणों, (iii) 0.1 स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन की माइक्रोग्राम, और (iv) डॉक्सोरूबिसिन-लोडेड पर रेशम के नैनोकणों (सी) SEM छवियों बराबर खुराक (स्केल बार = 50 माइक्रोन)। सांख्यिकीय विश्लेषण ± एसडी, एक तरह से एनोवा एनएस = महत्वपूर्ण नहीं, Bonferroni एकाधिक तुलना पोस्ट अस्थायी परीक्षण के बाद, * पी <0.05, ** पी <0.001 द्वारा किया गया था; त्रुटि सलाखों साजिश प्रतीक के भीतर छिपे हुए हैं जब दिखाई नहीं, एन = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

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    विभिन्न तरीकों polyvinyl शराब 20 सम्मिश्रण सहित रेशम नैनोकणों, उत्पादन करने के लिए उपलब्ध हैं, 21 सुखाने के 22 बाहर नमकीन, केशिका microdot मुद्रण 23 स्प्रे, सुपरक्रिटिकल सीओ 2 वर्षा 24 और nanoprecipitation 16,25 (संदर्भ 26 में समीक्षा)। हालांकि, nanoprecipitation, अपने समग्र सादगी के कारण, रेशम नैनोकणों पैदा करने के लिए सबसे लोकप्रिय तकनीक है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य लागू करने के लिए nanoprecipitation रिवर्स इंजीनियर को रेशम रेशम आधारित नैनोकणों, lysosomotropic कैंसर विरोधी दवा वितरण सहित कि आवेदनों की एक श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का निर्माण करने के लिए किया गया था।

    पिछले दशक के दौरान, nanoprecipitation प्रोटीन आधारित नैनोकणों 29 के निर्माण के लिए सबसे आम प्रक्रियाओं में से एक बन गया है। हमारे शोध समूह 16,17 और दूसरों 25,26,30,31 सफलतापूर्वक इस तकनीक आवेदन किया हैरेशम के जरिए; यहाँ, हम रेशम नैनोकणों की पीढ़ी के लिए एक सरल लेकिन मजबूत stepwise प्रोटोकॉल उपस्थित थे। एसीटोन nanoprecipitation गोलाकार रेशम कणों कि आकार में सजातीय हैं और नैनोमीटर आकार रेंज में आम तौर पर गिरावट अर्जित करता है। एसीटोन मेथनॉल, इथेनॉल, isopropanol और butanol 16,25 के रूप में सॉल्वैंट्स अधिक पसंद निरंतर चरण के रूप में उभरा है। एसीटोन नैनोकणों कि हाइड्रेशन का एक कम स्तर है जब metastable 100-200 एनएम आकार देशी और पुनर्जीवित रेशम समाधान 32 में मौजूद गोलाकार micellar संरचनाओं की तुलना में पैदावार। हालांकि, वहाँ आदेश यहाँ वर्णित उन लोगों के लिए संभावित विभिन्न गुणों के साथ रेशम (नैनो) कणों को उत्पन्न करने में विलायक मिश्रण और degumming समय में बदलाव का पता लगाने गुंजाइश है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल निरंतर चरण है, जो वर्दी गोलाकार नैनो आकार रेशम कणों (106.5 ± 1.1 एनएम) है कि एक नकारात्मक सतह प्रभारी ले जाने के निर्माण के लिए परमिट के रूप में एसीटोन (-49.57 का इस्तेमाल77; 0.6 एम वी) और उस हाइड्रोफोबिक, क्रिस्टलीय रेशम चेन 16,17 के एक तंग पैकिंग है। कुल मिलाकर, वर्णित प्रक्रिया थोड़ा हाथ पर समय की आवश्यकता है और एक रिवर्स इंजीनियर जलीय रेशम समाधान (चित्रा 1) से रेशम नैनोकणों अर्जित करता है। इस प्रक्रिया की प्रमुख विशेषताओं में से कुछ 60 मिनट degummed रेशम, उचित बूंद आकार (लगभग 10 μl / ड्रॉप) और 50 बूँदें / मिनट की एक अधिकतम छोड़ने की दर का उपयोग शामिल है। इन महत्वपूर्ण सुविधाओं के पालन में 14% की एक ठेठ उपज में परिणाम है। ये नैनोकणों मजबूत कर रहे हैं और हम सबूत है कि वे स्थिर हैं और एक 28 दिन के भंडारण की अवधि में अपनी शारीरिक विशेषताओं को बदल नहीं है प्रदान करते हैं। हालांकि, वर्णित विधि का एक संभावित चेतावनी अभाव एक व्यापक आकार सीमा से अधिक कणों (यानी, नैनोमीटर से कण पैदा पैमाने माइक्रोमीटर, जबकि एक संकीर्ण polydispersity सूचकांक बनाए रखने) उत्पन्न करने के लिए है।

    को नियंत्रित करने के कण आकार, प्रभारी और आकार मैं हैदवा वितरण के लिए mportant, खासकर जब ठोस ट्यूमर 33 निशाना। 100 एनएम आकार रेंज में कण ट्यूमर को निशाना बनाने के लिए आदर्श के रूप में उम्मीदवारों में उभर रहे हैं। इसलिए, 100 एनएम आकार रेशम नैनोकणों ठोस ट्यूमर के उपचार के लिए कैंसर विरोधी दवा वितरण प्रणाली के रूप में संभावित दावेदार हैं। सिल्क नैनोकणों एक नकारात्मक सतह प्रभारी, जो उन्हें आसानी से इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत 16 के शोषण के माध्यम से सकारात्मक आरोप लगाया दवाओं के साथ भरी हुई renders है। हालांकि, इस आरोप के अलावा, अतिरिक्त दवा विशेषताओं (जैसे, logD) भी दवा लोडिंग प्रभावित करते हैं और रिहाई 34 को जाना जाता है। वर्तमान अध्ययन में, डॉक्सोरूबिसिन, एक कमजोर बुनियादी कैंसर विरोधी दवा, एक मॉडल दवा उम्मीदवार के रूप में चुना गया था। दवा लोडिंग अध्ययन (चित्रा 4) से पता चला है कि रेशम nanoparticle एकाग्रता में वृद्धि हुई डॉक्सोरूबिसिन encapsulation दक्षता के लिए नेतृत्व बढ़ रही है; रेशम नैनोकणों के 10 मिलीग्राम डॉक्सोरूबिसिन की 232 माइक्रोग्राम encapsulate कर सकते हैं। रेशम की दवा लोड हो रहा NAnoparticles, बारी में, एक काफी कम सतह प्रभारी, जो सीधे प्रयोगात्मक सबूत इस बात की पुष्टि है कि डॉक्सोरूबिसिन-रेशम प्रभारी बातचीत इस विशेष दवा वाहक संयोजन के लिए महत्वपूर्ण है था के साथ रेशम नैनोकणों में हुई।

    हम पहले सबूत है कि रेशम नैनोकणों एक lysosomotropic दवा वितरण प्रणाली 16,17 के रूप में सेवा कर सकते हैं प्रदान की है। यहाँ, हम डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों का उपयोग मानव स्तन कैंसर एमडीए MB-231 सेल लाइन के इलाज के लिए एक परीक्षण दिखा। इन कोशिकाओं को एक बेहद आक्रामक ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर से निकाली गई है (ईआर - / पीआर - / HER2 -) है कि मुश्किल है क्लिनिक 35 में इलाज के लिए। इसलिए, इस रोगी जनसंख्या के अनुरूप एक दवा वितरण प्रणाली को डिजाइन करने जबरदस्त लाभ उपज की उम्मीद है। दवा लोडिंग के अभाव में, रेशम नैनोकणों सेल व्यवहार्यता (आईसी 50 मूल्यों> 5 मिलीग्राम / एमएल) (चित्रा 5 ए, सी) को प्रभावित नहीं किया। हालांकि, सम परवैलेंट खुराक, काफी अधिक cytotoxicity डॉक्सोरूबिसिन से भरी हुई रेशम नैनोकणों (चित्रा 5 ब) के साथ की तुलना में स्वतंत्र रूप से प्रसारण डॉक्सोरूबिसिन के साथ मनाया गया। इन विट्रो स्वतंत्र रूप से प्रसारण और कण बाध्य दवा के सेलुलर फार्माकोकाइनेटिक्स के बीच मतभेद इस अवलोकन समझाओ। स्वतंत्र रूप से प्रसारण दवा तेजी से प्रसार के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को पार कर सकते हैं, जबकि दवा भरी हुई नैनोकणों के तेज endocytosis पर निर्भर करता है। बहरहाल, नैनोकणों के endocytic तेज दवा प्रतिधारण बढ़ाने और दवा प्रतिरोध तंत्र 3 दूर कर सकते हैं। हालांकि, nanoparticle की मध्यस्थता कैंसर विरोधी दवा वितरण का असली लाभ यह है कि ई पी आर प्रभाव का लाभ उठाते निष्क्रिय ट्यूमर लक्ष्य-निर्धारण की सुविधा के लिए और फार्माकोकाइनेटिक्स में सुधार है। इसलिए, एक nanoparticle आधारित दवा वितरण दृष्टिकोण का उपयोग केवल पूरी तरह से विवो में मूल्यांकन किया जा सकता है। इन विट्रो अध्ययन में सीमाएं हैं (यानी, EPR प्रभाव के अभाव) है कि पूरा charact में बाधादवा वितरण प्रणाली 7 के इन प्रकार के erization।

    सारांश में, वर्णित कार्यप्रणाली अनुरूप आकार और सतह के प्रभार से गोलाकार रेशम नैनोकणों के लिए आसान निर्माण की अनुमति देता है। ये रेशम नैनोकणों आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, सौंदर्य प्रसाधन, नैनो patterning, theranostics, स्नेहक, nanotoxicity अध्ययन के लिए नियंत्रण कणों के लिए टेम्पलेट्स), कैंसर विरोधी दवा वितरण प्लेटफॉर्म के रूप में उनके उपयोग भी शामिल है।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

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    References

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    सिल्क नैनोकणों के निर्माण और दवा वितरण अनुप्रयोगों
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    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).More

    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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