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Bioengineering

Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

doi: 10.3791/54669 Published: October 8, 2016

Summary

Le nanoparticelle stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti per una vasta gamma di indicazioni. Qui, descriviamo un metodo semplice ma potente per la produzione di nanoparticelle di seta con reverse engineering di seta Bombyx mori. Queste nanoparticelle di seta possono essere facilmente caricati con un carico utile terapeutica e successivamente esplorato per le applicazioni di consegna della droga.

Abstract

Seta è un biopolimero promettente per applicazioni biomediche e farmaceutiche per la sua eccellente proprietà meccaniche, biocompatibilità e biodegradabilità, nonché la sua capacità di proteggere e successivamente rilasciare il suo payload in risposta a un trigger. Mentre la seta può essere formulato in vari formati materiali, le nanoparticelle di seta stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti. Pertanto, questo articolo tratta le procedure per bachi da seta ingegneria inversa per produrre una soluzione di seta rigenerata che può essere utilizzato per generare nanoparticelle seta stabili. Queste nanoparticelle sono successivamente caratterizzati, droga caricata ed esplorato come un potenziale sistema di somministrazione di farmaci anticancro. In breve, bozzoli di seta sono reverse engineering prima dai sgommatura bozzoli, seguita da dissoluzione di seta e pulire, per produrre una soluzione acquosa di seta. Successivamente, la soluzione seta rigenerato viene sottoposto ad nanoprecipitation per produrre nanoparticelle seta - un metodo semplice ma potenteche genera le nanoparticelle uniformi. Le nanoparticelle di seta sono caratterizzati secondo la loro dimensione, potenziale zeta, morfologia e stabilità in mezzi acquosi, come pure la loro capacità di intrappolare un payload chemioterapico e uccidere cellule di carcinoma mammario umano. Nel complesso, la metodologia descritta produce nanoparticelle di seta uniformi che possono essere facilmente esplorato per una miriade di applicazioni, tra cui il loro uso come un potenziale nanomedicina.

Introduction

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sistemi di drug delivery di dimensioni nanometriche sono spesso utilizzati per controllare rilascio del farmaco e per fornire un insieme diversificato di payload terapeutici - per esempio, le proteine, peptidi e piccole droghe peso molecolare - per colpire le cellule e tessuti. Questi carichi terapeutiche sono spesso incorporati in vari trasportatori di farmaci macromolecolari, come liposomi, polimeri solubili in acqua (compresi i dendrimeri), e micro- e nanoparticelle 1. Nanoparticelle (tipicamente in una gamma di dimensioni di 1 nm a 1000 nm) sono ampiamente esplorati come portatori potenziali di droga, in particolare per la somministrazione di farmaci antitumorali 2. Il successo di Abraxane (120 dimensioni nanoparticelle di albumina nm basata caricati con paclitaxel) nella routine pratica clinica 3 è catalizzata sul campo, in modo che molte più nanoparticelle per la somministrazione di farmaci sono ora entrando studi clinici 4. Tumori solidi mostrano generalmente scarsa drenaggio linfatico e hanno vasi sanguigni che perde il che significa che nanoparticles fino a 200 nm saranno passivamente mirati a questi tumori in seguito a somministrazione per via endovenosa. Questo fenomeno di targeting passivo è chiamato la permeabilità migliorata e ritenzione effetto (EPR) ed è stata riportata nel 1986 5. L'effetto EPR può portare ad un incremento da 50 a 100 volte in concentrazioni del farmaco nel microambiente tumorale per una data dose farmaco quando il payload farmaco viene consegnata usando un approccio carrier macromolecolare farmaco piuttosto che il farmaco libero senza il vettore. Nanoparticelle Drug-caricato progettati per la somministrazione di farmaci antitumorali devono raggiungere il microambiente tumorale e spesso devono entrare in un compartimento intracellulare specifica, di solito per l'assorbimento endocytic, per il farmaco a raggiungere il suo effetto terapeutico desiderato 3. Nanoparticelle progettati per drug delivery intracellulare sfruttano endocitosi come gateway nella cella e un percorso per superare i meccanismi di resistenza ai farmaci. rilascio del farmaco da nanoparticelle è spesso specificamente progettato per oCCur nei lisosomi (vale a dire, lysosomotropic drug delivery) 6 in cui la capacità di risposta del pH del vettore nanoparticelle (lisosomiale pH circa 4,5) può servire come innesco per rilascio controllato di farmaci o lisosomiali enzimi che liberano il payload dal supporto 7.

Molte diverse classi di materiali possono essere utilizzati per generare nanoparticelle (ad esempio, metalli e molti materiali organici ed inorganici). Tuttavia, biopolimeri stanno emergendo come materiali attraenti a causa della loro biocompatibilità noto, biodegradabilità e bassa tossicità 8. Molti biopolimeri sono allo studio, tra cui l'albumina, alginato, chitosano e seta. Di questi, la seta è emerso come un concorrente promettente per lo sviluppo in sistemi di drug delivery 9. Silks di vario tipo sono prodotte da un certo numero di artropodi, tra cui ragni (ad esempio, clavipes Nephila) e bachi da seta (ad esempio, Bombyx mori). la seta del baco da seta è usata molto più extensivamente di seta di ragno, perché il baco da seta è completamente addomesticato e la sua seta rappresenta quindi un materiale di partenza riproducibile. seta baco da seta è un Food and Drug Administration (FDA) ha approvato il materiale per uso umano, in particolare come materiale di sutura; ha un record di sicurezza robusta negli esseri umani ed è noto per degradare in vivo 10. Il profilo di degradazione della seta può essere messo a punto per variare da ore (basso seta cristallino) a 12 mesi o più (seta di alta cristallino). Seta prodotti di degradazione non sono tossici e sono metabolizzati nel corpo 10. La struttura di seta conferisce la capacità di legare piccoli composti con peso molecolare e farmaci proteici macromolecolari 11, che lo rende un buon materiale per il rilascio controllato di farmaci. Farmaci proteici (ad esempio, anticorpi) sono suscettibili di denaturazione, aggregazione, taglio proteolitico e passaggio del sistema immunitario. Tuttavia, la seta si stabilizza proteine ​​terapeutiche a causa della capacità di tamponamento del suo nanocristalli reregioni e la sua capacità di adattare il contenuto d'acqua su scala nanometrica 11. Queste caratteristiche uniche offrono una protezione fisica e ridurre la mobilità payload 11 e sono in genere non si vedono con altri polimeri (bio). Molti sistemi di somministrazione di farmaci antitumorali, ad esempio idrogel a base di seta 12, pellicole 13-15 e nanoparticelle 16,17, ora sono stati sviluppati per sfruttare queste caratteristiche (rivisto in riferimenti 18,19)

Qui, le nanoparticelle di seta sono stati caratterizzati da determinare la loro dimensione e la carica su un periodo di tempo prolungato. Doxorubicina, un farmaco antitumorale clinicamente rilevante, è stato utilizzato come modello per gli studi di droga carico di droga e citotossicità in cellule tumorali triple negative seno umano trattati con nanoparticelle di seta droga-caricato.

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Protocol

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1. Preparazione di una soluzione seta reverse engineering da Bombyx mori Bozzoli

NOTA: Questa metodologia si basa su protocolli descritti altrove 12,27.

  1. Tagliare 5 g di bozzoli secchi con le forbici in 5 mm x 5 mm pezzi. Rimuovere eventuali strati sporchi.
  2. Pesare 4,24 g di carbonato di sodio e aggiungere cautela per 2 L di acqua distillata bollente.
    NOTA: Questo produce una soluzione di carbonato 0,02 M di sodio.
  3. Aggiungere i pezzi Cocoon taglio alla soluzione di carbonato di sodio bollente e fate bollire per 60 minuti per degum le fibre di seta. Mescolare di tanto in tanto la seta per garantire un trattamento campione omogeneo.
  4. Rimuovere la seta sgommata e lavare con 1 L di acqua distillata per 20 min; ripetere la fase di lavaggio, almeno 3 volte.
  5. Rimuovere la seta lavata e spremere bene per rimuovere il liquido in eccesso e quindi sciogliere / tirare la seta a mano. Posizionare la seta slegato in una cappa aspirante per aria secca durante la notte. Questo produce in genere 3,6 g di s degummedfibre risma.
  6. Il giorno successivo, pesare fibre di seta sgommata essiccati 5 g ed imballare la seta saldamente il fondo di un bicchiere da 50 ml.
  7. Preparare una nuova soluzione 9,3 M bromuro di litio. Sciogliere le fibre di seta in LiBr utilizzando un 1 g di seta al rapporto di 4 ml bromuro di litio. Coprire il campione di seta bromuro di litio con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione e consentire la seta per sciogliere completamente a 60 ° C. Questa fase dura fino a 4 ore ed è aiutata da mescolando di tanto in tanto.
  8. Bagnare una cassetta dialisi (peso molecolare di cut-off di 3.500 Da) in acqua per 5 minuti. Iniettare 15 ml della soluzione di seta LiBr in dialisi cassetto 15 ml e utilizzando un ago e siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria.
  9. Dializzare contro 1 L di acqua distillata e cambiare l'acqua a 1, 3 e 6 ore (cioè, 3 cambi il primo giorno) e di nuovo la mattina successiva e la sera (cioè, 2 cambi il secondo giorno), e di nuovo su la mattina seguente (cioè, 1 cambia il terzo giorno).
  10. Raccogliere i soluti setasul dalla cassetta di dialisi e centrifugare la soluzione per 20 minuti a 5 ° C a 9.500 x g. Recuperare il surnatante e ripetere questo processo di centrifugazione altre due volte.
  11. Determinare il peso di una barca dalla bilancia (W1) e aggiungere 1 ml di soluzione di seta. Registrare il peso di nuovo (W2) e poi asciugare il campione lasciando la barca pesa a 60 ° C durante la notte. Quindi, determinare il peso totale a secco (W3) (seta essiccato e barca pesatura). La concentrazione della soluzione di seta (w / v) è:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

2. Preparazione di seta nanoparticelle dalla soluzione Silk decodificato

  1. Aggiungere un 5% (w / v) di seta gocce ad acetone mantenendo a> 75% (v / v) di acetone. Ad esempio, aggiungere 9 ml di 5% (w / v) di seta goccia a goccia (10 ul / goccia ad una velocità di 50 gocce / min) a 34 ml di acetone.
  2. Centrifugare precipitato a 48.000 xg per 2 ore a 4 ° C.
  3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in acqua distillata dapprima staccare il pellet con una spatola e quindi aggiungendo 20 ml di acqua distillata. Utilizzare puntali per rimuovere il pellet dalla spatola. Dopo vortex per 20 secondi seguita da due cicli di sonicazione usando una sonda ultrasonica al 30% dell'ampiezza per 30 sec, rabboccare il tubo centrifuga per capacità con acqua distillata.
  4. Ripetere la centrifugazione e la risospensione passo almeno due volte.
  5. Risospendere il pellet in 6 ml di acqua distillata, come descritto al punto 2.3 e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Per gli studi di coltura cellulare, le scorte di nanoparticelle di seta possono essere gamma irradiato 17.

3. Determinazione della seta nanoparticelle Concentrazione

  1. nanoparticelle di seta centrifugare a 48.000 xg per 2 ore a 4 ° C.
  2. Raccogliere tutti nanoparticelle in 3 ml di acqua distillata, seguite da due cicli di sonicazione al 30% dell'ampiezza per 30 sec.
  3. Dividere lo stock di nanoparticelle di seta 3 ml in 2 ml e 1 ml sacco e trasferire in pre-pesava 2 ml tubi. Registrare il peso totale del campione 2 ml. Conservare il lotto 1 ml a 4 ° C fino al momento dell'uso; questo campione 1 ml viene utilizzato per generare una curva di calibrazione.
  4. Snap congelare e poi lyophilize il 2 ml di seta di nanoparticelle molto in un liofilizzatore durante la notte. Dopo liofilizzazione, pesare il tubo 2 ml e calcolare la quantità di nanoparticelle seta (mg) che era originariamente presente nel campione 2 ml.
  5. Diluire il 1 ml di seta nanoparticelle magazzino con acqua distillata per generare una curva di calibrazione a 5 punti (0,04-7 mg / ml). Assicurarsi che i campioni non superino la massima assorbanza.
  6. Determinare l'assorbanza di ogni diluizione standard a 600 nm. Questo è fatto meglio con un setup piastra da 96 pozzetti. assorbanza della trama rispetto alla concentrazione (mg / ml) per la curva standard. Quindi utilizzare questa curva standard di routine per determinare la concentrazione di nanoparticelle seta in sospensioni.

4. Preparazione di doxorubicina-caricato Seta nanoparticelle

  1. Sciogliere 1,2 mg di doxorubicina cloridrato in 8 ml di acqua distillata.
  2. Portare a 10 ml con acqua distillata per ottenere una azione di lavoro di 116 pg / ml (0,2 mmol / ml).
  • Preparazione di doxorubicina-caricato Seta nanoparticelle
    1. Mescolare 2 ml di 0,2 mmol / soluzione doxorubicina ml con 200 ml di 10, 30 o 50 mg / ml di nanoparticelle seta in una provetta 2 ml.
    2. Incubare la sospensione seta doxorubicina a temperatura ambiente (25 ° C) per una notte su un agitatore rotante.
    3. Successivamente, centrifugare la sospensione seta doxorubicina a 194.000 xg per 30 min. Lavare le nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato con acqua distillata e ripetere la procedura altre due volte.
    4. PISCINA La surnatante e prendere nota del volume totale (in questo esempio viene utilizzato per determinare l'efficienza di incapsulamento).
    5. Risospendere le nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato in acqua distillata, riparo dalla luce e conservare a 4 ° C delle Nazioni Unitetil uso.
  • Determinazione di incapsulamento Efficienza and Drug Caricamento
    1. Dispensare 200 ml di surnatante dal punto 4.2.4 in un micropiastra nero.
    2. Utilizzare un lettore di micropiastre a fluorescenza per misurare la fluorescenza doxorubicina associata ad una regolazione fotomoltiplicatore fissa.
    3. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm ed emissione lunghezza d'onda a 590 nm e registrare i valori di fluorescenza.
    4. Genera una curva di calibrazione doxorubicina. Garantire misurazioni vengono acquisiti con le stesse impostazioni dello strumento (ad esempio, con un ambiente fotomoltiplicatore fisso). Usando la curva di calibrazione, calcolare la concentrazione doxorubicina nel surnatante combinato. Ripetere questa misurazione in tre esperimenti indipendenti.
    5. Utilizzare l'equazione (1) per determinare l'efficienza di incapsulamento:
      Equazione 1
  • 5. Caratterizzazione di seta Nanoparticelle

    1. La valutazione delle dimensioni e Zeta Potenziale di preparati e memorizzati in seta nanoparticelle.
      1. nanoparticelle Silk Store in acqua distillata a 4 ° C e 25 ° C.
      2. Misurare le dimensioni e potenziale zeta delle nanoparticelle seta nei giorni 0, 14 e 28 utilizzando light scattering dinamico (DLS). Impostare gli indici di rifrazione di 1,33 per l'acqua distillata e 1,60 per le proteine 17. Calcola dimensioni delle particelle con il software di interfaccia utente.
    2. La valutazione morfologica delle nanoparticelle di seta da microscopia elettronica a scansione (SEM).
      1. Posizionare un disco adesivo carbonio su un stub SEM e successivamente collegare un wafer di silicio.
      2. Diluire nanoparticelle seta ad una concentrazione di 1 mg / ml. Pipettare 10 ml di campione su un wafer di silicio, congelare il campione a -80 ° C e lyophilize notte utilizzando un sistema di liofilizzazione secondo le istruzioni del produttore.
      3. Rivestire il campione con un strato di oro fino a uno spessore di 20 nmutilizzando un dispositivo a induzione basso vuoto sputtering.
        NOTA: Le impostazioni dello strumento variano tra i modelli. Il modello utilizzato qui è completamente automatizzato e funziona da solo lo spessore.
      4. campioni di immagine con un microscopio elettronico a scansione a 5 kV ed un ingrandimento di 40.000 volte.

    6. In Vitro citotossicità di controllo e di doxorubicina-caricato Seta nanoparticelle

    1. La vitalità cellulare in seguito all'esposizione a nanoparticelle Seta.
      1. Culture MDA-MB-231 cellule in RPMI 1640 con 10% v / v FBS. Cellule piastra su colture di tessuti trattati polistirolo e incubare in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C. Di routine sottocultura al 80% confluenza ogni 2-3 giorni.
      2. Piatto MDA-MB-231 cellule ad una densità di 2 x 10 4 cellule / cm 2 in piastre da 96 pozzetti. Permettono alle cellule di recuperare durante la notte.
      3. Aggiungere (i) ,001-1 mg doxorubicina liberamente diffusibile, (ii) 0.001-0.5 nanoparticelle di seta mg e 0,1 mg di nanoparticelle di setacaricato con ,001-1 mg doxorubicina in piastre da 96 pozzetti (volume di 100 ml per pozzetto).
      4. Determinare la vitalità cellulare e la metà massima concentrazione inibitoria (IC 50) aggiungendo (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT 5 mg / ml in PBS) a 72 hr. Incubare per 5 ore, svuotare accuratamente i pozzetti con una pipetta e sciogliere il formazano con 100 ml di dimetilsolfossido. Misurare l'assorbanza a 560 nm. Ripetere questa misurazione in tre esperimenti indipendenti.
        NOTA: I valori di assorbanza dei controlli non trattati servono come valore di riferimento per la vitalità cellulare 100%.
    2. SEM di cellule esposte a Silk nanoparticelle.
      1. Seme MDA-MB-231 cellule su vetrini sterili a una densità di 2 x 10 4 cellule / cm 2. Permettono alle cellule di recuperare durante la notte. Esporre le cellule alle condizioni di trattamento desiderate per 72 ore.
      2. Fissare le cellule con 2% v / v glutaraldeide in PBS per 30 minuti, lavare con diacqua calmato due volte, disidratano con una serie di etanolo, e punto critico asciugare i campioni, come descritto altrove 28.
      3. Polverizzazione catodica cappotto i campioni con un oro strato fino a 20 nm di spessore utilizzando un dispositivo a induzione basso vuoto sputtering.
        NOTA: Le impostazioni dello strumento variano tra i modelli. Il modello utilizzato qui è completamente automatizzato e funziona da solo lo spessore.
      4. Immagine campioni di SEM utilizzando una accelerazione degli elettroni di 5 kV e l'ingrandimento di 700 volte.

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    Representative Results

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    I dati sono stati analizzati statisticamente come descritto in precedenza 17. t-test di Student è stato utilizzato per coppie di campioni e analisi della varianza ad una via (ANOVA) seguita da confronto multiplo di Bonferroni test post hoc per campioni multipli. Un asterisco indica la significatività statistica come segue: * P <0.05 e ** P <0.001. Tutti i dati sono presentati come valori medi ± deviazione standard (SD) e i numeri tra parentesi indicano il numero di esperimenti indipendenti.

    Soluzione seta rigenerata è stata preparata e successivamente aggiunto goccia a goccia ad acetone per generare nanoparticelle seta tramite nanoprecipitation (Figura 1). Questo metodo ha prodotto uniforme (indice di polidispersità: 0,1), sferica, nanoparticelle seta (106,5 nm ± 1.1) con una carica superficiale negativa (-49,57 mV ± 0,6) (figure 2 e 3). Seta nanoparticelle stcapacità in acqua è stata valutata fino a 28 giorni monitorando dimensioni delle particelle, potenziale zeta e (figure 2 e 3) morfologia. Durante il periodo di conservazione di 28 giorni, sia a 4 ° C o 25 ° C, nessun cambiamento significativo nella dimensione delle particelle, di carica (figura 2) o la morfologia stato osservato (Figura 3).

    La doxorubicina è stato usato come modello clinicamente rilevante chemioterapico per il carico di droga e studi di citotossicità in vitro. Tre diverse concentrazioni seta nanoparticelle (10, 30 e 50 mg / ml) sono stati utilizzati per valutare la capacità droga carico delle nanoparticelle seta. L'efficienza doxorubicina incapsulamento per 10, 30 e 50 mg / nanoparticelle seta ml (cioè, 2, 6 o 10 mg di seta e 232 mg di doxorubicina) era 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 e 97 ± 0,2%, rispettivamente (Figura 4A ). La dimensione delle particelle e il potenziale zeta di doxorubicina-lonanoparticelle di seta ADED (10 mg) sono stati misurati e confrontati con i controlli di seta nanoparticelle 10 mg. La dimensione delle particelle non è cambiato dopo farmaco carico (Figura 4B), mentre il potenziale zeta delle nanoparticelle seta doxorubicina caricato è stato significativamente ridotto da 49.57 ± 0,6 mV a 43.52 ± 0.37 mV (Figura 4C).

    La capacità delle nanoparticelle di seta farmaco-caricata per fornire doxorubicina e successivamente uccidere le cellule tumorali è stata valutata in vitro. cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule sono state esposte alle nanoparticelle di seta, doxorubicina liberamente diffusibile o nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato. La vitalità cellulare è stata valutata dopo un periodo di esposizione 72 ore. I valori di IC 50 di doxorubicina liberamente diffusibile e nanoparticelle seta doxorubicina caricata erano 0,48 mg / ml e 0,24 ug / ml, rispettivamente, mentre le nanoparticelle seta avevano un IC 50> 5 mg / ml (Figura 5A).A dosi di farmaci equivalenti di 0,1 mg, doxorubicina liberamente diffusibile e nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato causato una diminuzione significativa nella vitalità delle cellule di 83 ± 11 e 65 ± 11%, rispettivamente (Figura 5B). Tuttavia, la doxorubicina liberamente diffusibile ha mostrato una maggiore citotossicità sostanzioso di nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato. Queste misurazioni quantitative sono state corroborate da immagini qualitativa SEM (Figura 5c). Qui, colture di controllo hanno mostrato alta densità cellulare e un mesenchimale prevalenza di MDA-MB-231 fenotipo; Osservazioni analoghe sono state fatte per colture esposte alle nanoparticelle di seta. Tuttavia, colture esposte a doxorubicina hanno mostrato un marcatamente diverso fenotipo delle cellule. Alla dose doxorubicina equivalente, MDA-MB-231 cellule trattate con doxorubicina liberamente diffusibile e nanoparticelle seta doxorubicina caricata mostrato una riduzione sostanziale del numero di cellule. Inoltre, molte cellule avevano una molto ampia e sparsi morfologia. culture exposed alle nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato mostrato evidenza di nanoparticelle (ei loro aggregati) associati con la membrana plasmatica (Figura 5C).

    Figura 1
    Figura 1: I passaggi chiave per generare una soluzione di seta reverse engineering e nanoparticelle di seta In primo luogo, bozzoli di seta sono reverse engineering tagliando e poi sgommatura loro per 60 minuti (vale a dire, bollente) per produrre fibre di seta degummed.. Le fibre vengono sciolti in 9.3 M LiBr e quindi dializzato contro acqua per 72 ore. Un acquosa al 5% w / v soluzione seta viene utilizzato per generare nanoparticelle seta. L'aggiunta goccia a goccia della seta in acetone porta a nanoprecipitation seta. Nanoparticelle di seta vengono lavati e raccogliere per un uso successivo. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questafigura.

    figura 2
    Figura 2:. Dimensione e caratterizzazione carica di nanoparticelle seta Dimensione delle particelle e il potenziale zeta delle nanoparticelle seta a 4 ° C e 25 ° C per 28 giorni. ± SD; barre di errore sono nascosti all'interno del simbolo grafico, quando non è visibile, n = 3. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3:. Valutazione della qualità di nanoparticelle di seta conservati a 4 ° C e 25 ° C per 28 giorni nanoparticelle di seta sono stati ripresi utilizzando la microscopia elettronica a scansione (Barra di scala = 1 micron). Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: Caratterizzazione di nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato (Dox-SNP) (A) Encapsulation efficienza di 232 mg doxorubicina in risposta a diverse quantità di nanoparticelle di seta (SNP);. 2, 6 e 10 mg di nanoparticelle di seta. L'efficienza di incapsulamento per 10 mg e nanoparticelle di seta 5 mg significativamente aumentata rispetto alle nanoparticelle di seta 2 mg. (B) Dimensione delle particelle e (C) potenziale zeta delle nanoparticelle seta doxorubicina caricata rispetto ai controlli nanoparticelle seta (10 mg di nanoparticelle di seta). Differenze statisticamente significative per coppie di campioni sono stati determinati con il test t di Student. campioni multipli sono stati valutati da una via ANOVA, seguito dal test di confronto multipli post hoc di Bonferroni; * P & #60; 0.05, ** p <0.001, ± DS; barre di errore sono nascosti all'interno della trama-simbolo, quando non è visibile, n = 3. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5: In vitro citotossicità delle nanoparticelle di seta e nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato nelle cellule umane di cancro al seno (A) La vitalità cellulare di MDA-MB-231 cellule dopo un ciclo di trattamento 72 ore con le nanoparticelle di seta (SNP) (0,01-5 mg. / ml); volumi per ben erano 100 l. (B) La vitalità cellulare di MDA-MB-231 cellule dopo un ciclo di trattamento 72 hr con nanoparticelle seta 0,1 mg, 0,1 mg di doxorubicina liberamente diffusibile (Dox) o 0,1 mg di nanoparticelle seta caricato con 0,1 mg di doxorubicina (Dox-SNPS). La vitalità cellulare è stata statisticamente diminuito dopo l'esposizione a 0,1 mg di doxorubicina liberamente diffusibile e 0,1 mg di nanoparticelle seta caricato con 0,1 mg di doxorubicina rispetto al controllo. Immagini (C) SEM di MDA-MB-231 cellule esposte a (i) mezzo (di controllo), (ii) nanoparticelle 0,1 mg di seta, (iii) 0,1 mg di doxorubicina liberamente diffusibile, e (iv) nanoparticelle di seta doxorubicina-caricati a dosi equivalenti (scala bar = 50 micron). L'analisi statistica è stata effettuata da una via ANOVA seguito dal test di confronto hoc dopo multipla di Bonferroni, ns = non significativo, * p <0.05, ** p <0.001, ± DS; barre di errore sono nascosti all'interno della trama-simbolo, quando non è visibile, n = 3. Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

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    Vari metodi sono disponibili per la produzione di nanoparticelle di seta, tra cui alcol polivinilico miscelazione 20, essiccazione a spruzzo 21, salatura fuori 22, microdot capillare stampa 23, supercritica CO 2 precipitazioni 24 e nanoprecipitation 16,25 (rivisto in riferimento 26). Tuttavia, nanoprecipitation, grazie alla sua semplicità generale, è la tecnica più diffusa per la generazione di nanoparticelle seta. Pertanto, lo scopo di questo studio era di applicare nanoprecipitation alla seta decodificato per la produzione di nanoparticelle di seta-based che possono essere utilizzati per una vasta gamma di applicazioni, tra cui lysosomotropic antitumorale somministrazione di farmaci.

    Negli ultimi dieci anni, nanoprecipitation è diventata una delle procedure più comuni per la produzione di nanoparticelle a base di proteine 29. Il nostro gruppo di ricerca 16,17 e altri 25,26,30,31 hanno applicato con successo questa tecnologialogia alla seta; Qui, vi presentiamo un semplice ma robusto protocollo graduale per la generazione di nanoparticelle di seta. Acetone nanoprecipitation produce particelle sferiche di seta che sono omogenee in termini di dimensioni e rientrano generalmente nella gamma di dimensioni nanometriche. Acetone è emerso come fase continua preferito su solventi quali metanolo, etanolo, isopropanolo e butanolo 16,25. Acetone produce nanoparticelle che hanno un ridotto livello di idratazione rispetto al metastabile 100-200 nm dimensionato strutture micellari sferiche presenti nelle soluzioni seta native e rigenerati 32. Tuttavia, vi è la possibilità di esplorare miscele di solventi e variazioni nel tempo sgommatura per generare seta particelle (nano) con potenzialmente proprietà diverse da quelle qui descritte. Il protocollo qui descritto utilizza acetone come fase continua, che permette la produzione di particelle uniformi sferiche di dimensioni nanometriche seta (106,5 ± 1,1 nm) che portano una carica superficiale negativa (-49,5777; 0,6 mV) e che hanno una guarnizione a tenuta delle catene, seta cristallino idrofobiche 16,17. Nel complesso, la procedura descritta richiede poco hands-on tempo e produce nanoparticelle di seta da una soluzione acquosa di seta reverse engineering (Figura 1). Alcune delle caratteristiche chiave di questo procedimento includono l'uso di 60 minuti di seta sgommata, la dimensione della goccia appropriata (circa 10 ml / drop) e una velocità massima di caduta di 50 gocce / min. L'adesione a queste caratteristiche fondamentali traduce in una resa tipica di 14%. Queste nanoparticelle sono robusti e ci forniscono la prova che essi sono stabili e non cambiano le loro caratteristiche fisiche nel corso di un periodo di conservazione di 28 giorni. Tuttavia, un potenziale avvertimento del metodo descritto è l'assenza di generare particelle in un intervallo di dimensioni ampia (cioè, generando particelle dal nanometro al micrometro scala mantenendo un indice di polidispersità stretto).

    Controllare la dimensione delle particelle, carica e la forma sono iomportante per la consegna della droga, in particolare quando il targeting tumori solidi 33. Le particelle nella gamma di dimensioni 100 nm stanno emergendo come candidati ideali per tumore targeting. Pertanto, 100 nanoparticelle di seta dimensioni nm sono potenziali contendenti come sistemi di somministrazione di farmaci antitumorali per i trattamenti di tumori solidi. Nanoparticelle di seta hanno una carica superficiale negativa, che li rende facilmente caricate con farmaci carica positiva attraverso lo sfruttamento della interazione elettrostatica 16. Tuttavia, oltre carica, sono noti anche caratteristiche farmacologiche aggiuntive (ad esempio, LoGD) per influenzare carico di droga e rilasciare 34. Nel presente studio, doxorubicina, un farmaco antitumorale debolmente basica, è stato scelto come candidato farmaco modello. Il farmaco in studio carico (figura 4) ha mostrato che l'aumento della concentrazione di seta nanoparticelle portato ad una maggiore efficienza doxorubicina incapsulamento; 10 mg di nanoparticelle di seta può incapsulare 232 mg di doxorubicina. carico di droga della seta nananoparticelle di, a sua volta, determinato nanoparticelle seta con una carica superficiale significativamente ridotta, che era evidenza sperimentale diretta conferma che l'interazione carica doxorubicina-seta è importante per questa particolare combinazione veicolo per medicamenti.

    Abbiamo già dimostrato che le nanoparticelle di seta può servire come un sistema di consegna della droga 16,17 lysosomotropic. Qui, vi mostriamo un test utilizzando nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato per trattare la linea di cellule MDA-MB-231 cancro al seno umano. Queste cellule sono derivate da un carcinoma mammario negativo altamente invasiva tripla (ER - / PR - / HER2 -) che è difficile da trattare nella clinica 35. Pertanto, la progettazione di un sistema di somministrazione di farmaci su misura per questa popolazione di pazienti si prevede che produrrà enormi benefici. In assenza di caricamento del farmaco, nanoparticelle seta non incidono vitalità cellulare (valori di IC 50> 5 mg / ml) (Figura 5a, c). Tuttavia, a equidosi valente, significativamente maggiore citotossicità è stata osservata con doxorubicina liberamente diffusibile che con nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato (figura 5b). Le differenze tra la farmacocinetica in vitro cellulari liberamente diffusibile e particelle di droga legato spiegare questa osservazione. Il farmaco liberamente diffusibile può rapidamente attraversare la membrana plasmatica via di diffusione, mentre l'assorbimento delle nanoparticelle droga caricata si basa su endocitosi. Ciò nonostante, l'assorbimento di nanoparticelle endocitico può aumentare la ritenzione di droga e di superare i meccanismi di resistenza ai farmaci 3. Tuttavia, il vero beneficio di nanoparticelle mediata consegna antitumorale farmaco è che sfrutta l'effetto EPR per facilitare il targeting tumorale passiva e per migliorare la farmacocinetica. Pertanto, l'uso di un approccio drug delivery a base di nanoparticelle possono essere pienamente valutato solo in vivo. Studi in vitro hanno limitazioni (cioè, l'assenza di effetto EPR) che preclude la piena characterization di questi tipi di sistemi di drug delivery 7.

    In sintesi, la metodologia descritta consente la facile fabbricazione di nanoparticelle seta sferiche di dimensioni coerenti e carica superficiale. Queste nanoparticelle di seta possono essere utilizzati per una vasta gamma di applicazioni (ad esempio, i cosmetici, i modelli per nano patterning, theranostics, lubrificanti, particelle di controllo per gli studi nanotoxicity), compreso il loro uso come piattaforme di distribuzione di farmaci antitumorali.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

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    References

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    Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle
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    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).More

    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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