Summary
Nanopartiklar växer fram som lovande läkemedelstillförselsystem för ett brett spektrum av indikationer. Här beskriver vi en enkel men kraftfull metod för att tillverka silke nanopartiklar med användning av omvänd konstruerad Bombyx mori silke. Dessa silke nanopartiklar kan lätt laddas med en terapeutisk nyttolast och därefter undersökas för läkemedelsleveranstillämpningar.
Abstract
Silk är en lovande biopolymer för biomedicinska och farmaceutiska tillämpningar på grund av dess enastående mekaniska egenskaper, biokompatibilitet och bionedbrytbarhet samt dess förmåga att skydda och därefter släppa sin last som svar på en trigger. Även siden kan formuleras i olika material format, är siden nanopartiklar framstår som lovande läkemedelsleveranssystem. Därför denna artikel täcker förfarandena för reverse engineering silke kokonger för att ge en regenere siden lösning som kan användas för att generera stabila siden nanopartiklar. Dessa nanopartiklar är karakteriserades, läkemedelsladdade och utforskas som ett potentiellt läkemedel mot cancer leveranssystem. I korthet silkeskokong omvänd engineered först genom avslemning kokong, följt av silke upplösning och städa upp, för att ge en vattenhaltig silke lösning. Därefter regener silke lösningen utsattes för Nanoprecipitation för erhållande silke nanopartiklar - en enkel men kraftfull metodsom genererar enhetliga nanopartiklar. De silkesnanopartiklar kännetecknas enligt deras storlek, zeta-potential, morfologi och stabilitet i vattenhaltiga medier, liksom deras förmåga att fånga en kemoterapeutisk nyttolast och döda humana bröstcancerceller. Sammantaget ger den beskrivna metoden enhetliga siden nanopartiklar som lätt kan utforskas för en mängd olika tillämpningar, inklusive deras användning som en potentiell nanomedicin.
Introduction
Nanostorlek läkemedelsleveranssystem används ofta för att styra läkemedelsdosering och att leverera en mångfald av terapeutiska nyttolaster - till exempel, proteiner, peptider och små molekylvikt droger - till målceller och vävnader. Dessa terapeutiska nyttolaster är ofta införlivas i olika makromolekylära läkemedelsbärare, såsom liposomer, vattenlösliga polymerer (inklusive dendrimerer) samt mikro- och nanopartiklar 1. Nanopartiklar (typiskt i storleksordningen av en nm till 1000 nm) är i stor utsträckning utforskas som potentiella läkemedelsbärare, särskilt för cancer drug delivery 2. Det framgångsrika införandet av Abraxane (120 nm stora albuminbaserade nanopartiklar laddade med paklitaxel) i rutinmässig klinisk praxis 3 har katalyseras fältet, så att många fler nanopartiklar för drug delivery går nu in kliniska prövningar 4. Solida tumörer visar i allmänhet dålig lymfdränage och har läckande blodkärl, vilket innebär att nanoparticles på upp till 200 nm kommer att passivt riktas in på dessa tumörer efter intravenös administrering. Denna passiva inriktning fenomen kallas den förbättrade permeabilitet och retention (EPR) effekt och rapporterades först 1986 5. EPR effekt kan leda till en 50- till 100-faldig ökning av läkemedelskoncentrationer inom tumören mikro för en given läkemedelsdos när läkemedelsnyttolast levereras med hjälp av ett makromolekylärt läkemedelsbärare strategi snarare än det fria läkemedlet utan bäraren. Läkemedelsladdade nanopartiklar avsedda för cancer drug delivery måste nå tumören mikro och ofta måste ange en specifik intracellulär fack, vanligen genom endocytiska upptagningen, för drogen för att uppnå önskad terapeutisk effekt 3. Nanopartiklar är avsedda för intracellulär tillförsel av läkemedel utnyttjar endocytos som en inkörsport in i cellen och som en väg att övervinna läkemedelsresistensmekanismer. Läkemedelsfrisättning från nanopartiklar är ofta speciellt utformade för att occur i lysosomer (dvs lysosomotropic drug delivery) 6 där pH lyhördhet av nanopartikelbäraren (lysosomalt pH cirka 4,5) kan fungera som utlösande faktor för läkemedelsfrisättning eller lysosomala enzymer som frigör nyttolasten från bäraren 7.
Många olika klasser av material kan användas för att generera nanopartiklar (t.ex. metaller och många organiska och oorganiska material). Men biopolymerer fram som attraktiva material på grund av deras kända biokompatibilitet, biologisk nedbrytbarhet och låg toxicitet 8. Många biopolymerer undersöks, inklusive albumin, alginat, kitosan och silke. Av dessa har siden framträtt som en lovande kandidat för utveckling av läkemedel leveranssystem 9. Silks av olika slag tillverkas av ett antal artropoder, inklusive spindlar (t.ex. Nephila clavipes) och silkesmaskar (t.ex. Bombyx mori). Silkesmask silke används långt mer EXTENtande än spindeltråd eftersom silkes är helt tama och silke utgör således en reproducerbar utgångsmaterial. Silkworm silke är en Food and Drug Administration (FDA) godkänt material för humant bruk, i synnerhet som en suturmaterial; den har en robust säkerhetsstatistik hos människor och är känd för att brytas ned in vivo 10. Profilen nedbrytning av siden kan finjusteras för att sträcka sig från timmar (låg kristallin silke) till 12 månader eller mer (hög kristallin siden). Silke nedbrytningsprodukter är icke-toxiska och metaboliseras i kroppen 10. Siden struktur ger förmågan att binda små molekylvikt föreningar och makromolekylära proteinläkemedel 11, vilket gör det ett bra material för kontrollerad läkemedelsdosering. Proteinläkemedel (t.ex. antikroppar) är känsliga för denaturering, aggregering, proteolytisk klyvning och clearance av immunsystemet. Men stabiliserar siden terapeutiska proteiner på grund av buffertkapacitet sin nanokristallint reregioner och dess förmåga att skräddarsy vattenhalt på nanonivå 11. Dessa unika funktioner ger fysiskt skydd och minska last rörlighet 11 och är vanligtvis inte ses med andra (bio) polymerer. Många läkemedel mot cancer leveranssystem, till exempel siden baserade hydrogeler 12, filmer 13-15 och nanopartiklar 16,17, har nu utvecklats för att utnyttja dessa funktioner (översikt i referenser 18,19)
Här har siden nanopartiklar kännetecknas genom att bestämma deras storlek och kostnad under en längre tid. Doxorubicin, en kliniskt relevant läkemedel mot cancer, användes som modelläkemedel för läkemedelshalten och cytotoxicitetsstudier tredubbla negativa mänskliga bröstceller cancerpatienter behandlade med läkemedelsladdade siden nanopartiklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av en omvänd tillverkade Silk lösning från Bombyx mori kokonger
OBS: Denna metod är baserad på protokoll som beskrivs på annat håll 12,27.
- Klipp 5 g torkade kokonger med en sax i 5 mm x 5 mm bitar. Ta bort eventuella nedsmutsade lager.
- Väg upp 4,24 g natriumkarbonat och lägga till detta noggrant för att 2 L kokande destillerat vatten.
OBS: Detta ger en 0,02 M natriumkarbonatlösning. - Lägga de skurna kokong bitar att det kokande natriumkarbonatlösning och koka under 60 min för att degum de silke fibrer. Rör om siden ibland för att säkerställa homogen prov bearbetning.
- Avlägsna avslemmade silke och tvätta med 1 L av destillerat vatten under 20 min; upprepa tvättsteget, åtminstone 3 gånger.
- Ta bort den tvättade siden och pressa det bra att ta bort överflödig vätska och sedan knyta / dra siden för hand. Placera obundet siden i ett dragskåp för att lufttorka över natten. Detta ger normalt 3,6 g avslemmade silk fibrer.
- Nästa dag, vägs 5 g lufttorkade avslemmad silkesfibrer och packa siden tätt i botten av en 50 ml bägare.
- Bered en färsk 9,3 M LiBr lösning. Lös silke fibrer i LiBr med användning av en 1 g silke till 4 ml LiBr förhållande. Täck silke LiBr provet med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning och låta silke för att lösa upp fullständigt vid 60 ° C. Detta steg tar upp till 4 timmar och är hjälpt av omrörning då och då.
- Våt en dialyskassett (molekylviktsgräns av 3500 Da) i vatten under 5 min. Injicera 15 ml siden LiBr lösning i 15 ml dialyskassett och använda en nål och spruta för att avlägsna eventuella luftbubblor.
- Dialysera mot en liter destillerat vatten och byta vatten vid en, tre och sex timmar (dvs 3 förändringar på den första dagen) och igen på nästa morgon och kväll (det vill säga 2 förändringar på den andra dagen), och återigen på följande morgon (dvs en förändring på den tredje dagen).
- Samla siden solutipå från dialyskassetten och centrifugera lösningen under 20 min vid 5 ° C vid 9500 x g. Återskapa supernatanten och upprepa centrifugeringen två gånger.
- Bestämma vikten för en tom vägningsskål (W1) och tillsätt 1 ml av silke lösning. Notera vikten igen (W2) och torka provet genom att lämna vägnings båten vid 60 ° C över natten. Därefter bestämmer den totala torrvikten (W3) (torkad silke och väger båt). Koncentrationen av den silk-lösning (vikt / volym) är:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.
2. Beredning av Silk nanopartiklar från bakåtkompileras Silk Lösning
- Lägga till en 5% (vikt / volym) silke lösningen droppvis till aceton under bibehållande av en> 75% (volym / volym) acetonlösning. Lägg till exempel till 9 ml av en 5% (vikt / volym) silk lösning droppvis (10 | il / droppe vid en hastighet av 50 droppar / min) till 34 ml aceton.
- Centrifugera fällningen vid 48.000 xg under 2 h vid 4 ° C.
- Aspirera supernatanten och suspendera pellet i destillerat vatten genom att först dislodging pelleten med en spatel och sedan tillsätta 20 ml destillerat vatten. Använd pipettspetsar för att avlägsna pellets från spateln. Efter virvling under 20 sekunder, följt av två sonication cykler med en ultraljudssond vid 30% amplitud under 30 sekunder, fyll centrifugröret till kapacitet med destillerat vatten.
- Upprepa centrifugering och återsuspension steget, åtminstone två gånger.
- Återsuspendera pelleten i 6 ml destillerat vatten, som beskrivs i 2.3 och lagra vid 4 ° C fram till användning. För cellodlingsstudier, kan silke nanopartiklar lagren vara gamma bestrålas 17.
3. Fastställande av Silk Nanopartiklar Koncentration
- Centrifugera siden nanopartiklar vid 48.000 xg under 2 h vid 4 ° C.
- Samla alla nanopartiklar i 3 ml destillerat vatten, följt av två sonication cykler vid 30% amplitud under 30 sek.
- Dela upp 3 ml lager av siden nanopartiklar i 2 ml och 1 ml partier och överför till pre-vägs 2 ml rör. Registrera den totala vikten av 2 ml prov. Lagra en ml platsen vid 4 ° C fram till användning; detta 1 ml prov kommer att användas för att generera en kalibreringskurva.
- Snap frysa och sedan lyofilisera 2 ml siden nanopartiklar mycket i en frystork över natten. Efter frystorkning, Väg åter 2 ml rör och beräkna mängden silkesnanopartiklar (mg) som var ursprungligen närvarande i 2 ml prov.
- Späd 1 ml siden nanopartiklar lager med destillerat vatten för att generera en 5-gradig kalibreringskurva (0,04-7 mg / ml). Säkerställa att proven inte överskrider den maximala absorbansen.
- Bestämma absorbansen för varje standard utspädning vid 600 nm. Detta görs bäst med hjälp av en 96-brunnar setup. Plot absorbans mot koncentration (mg / ml) för standardkurvan. Använd sedan denna standardkurva rutinmässigt för att bestämma koncentrationen av siden nanopartiklar i suspensioner.
4. Framställning av doxorubicin belastad Silk Nanopartiklar
- Lös 1,2 mg doxorubicin HCl i 8 ml destillerat vatten.
- Fyll upp till 10 ml med destillerat vatten för att ge en fungerande lager av 116 | ig / ml (0,2 ^ mol / ml).
- Blanda 2 ml 0,2 mol / ml doxorubicin lösning med 200 pl 10, 30 eller 50 mg / ml av silke nanopartiklar i en 2 ml rör.
- Inkubera silk-doxorubicin suspension vid rumstemperatur (25 ° C) över natten på en roterande bländare.
- Därefter centrifugera silk-doxorubicin suspensionen vid 194.000 xg under 30 min. Tvätta doxorubicin belastade siden nanopartiklar med destillerat vatten och upprepa proceduren ytterligare två gånger.
- Pool supernatanten och notera den totala volymen (detta prov används för att bestämma inkapslingseffektiviteten).
- Suspendera doxorubicin belastade silke nanopartiklar i destillerat vatten, skydda mot ljus och förvara vid 4 ° C until användning.
- Pipett 200 ul av supernatanten från steg 4.2.4 i en svart mikrotiterplatta.
- Använd en fluorescensmikroplattläsare för att mäta doxorubicin-associerad fluorescens vid en fast fotomultiplikator inställning.
- Ställ excitationsvåglängden till 485 nm och emissionsvåglängd till 590 nm och registrera fluorescensvärdena.
- Generera en doxorubicin kalibreringskurva. Säkerställa mätningar förvärvas med samma instrumentinställningar (dvs., med en fast inställning fotomultiplikator). Användning av kalibreringskurvan, beräkna doxorubicin-koncentrationen i den kombinerade överstående vätskan. Upprepa denna mätning i tre oberoende experiment.
- Använd ekvation (1) för att bestämma inkapslingseffektiviteten:
5. Karakterisering av Silk Nanopartiklar
- Bedömning av storlek och Zeta Potential av nyberedd och lagras Silk Nanopartiklar.
- Förvara siden nanopartiklar i destillerat vatten vid 4 ° C och 25 ° C.
- Mäta storleken och zetapotentialen av silke nanopartiklar på dagar 0, 14 och 28 med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS). Ställ brytningsindex till 1,33 för destillerat vatten och 1,60 för protein 17. Beräkna partikelstorlekar med användargränssnittet programvara.
- Morfologisk bedömning av Silk Nanopartiklar av Svepelektronmikroskopi (SEM).
- Placera en kol vidhäftande skiva på en SEM stöta och därefter fästa en kiselskiva.
- Späd siden nanopartiklar till en koncentration av 1 mg / ml. Pipett 10 ul av provet på en kiselskiva, frysa provet vid -80 ° C och lyofilisera över natten med hjälp av en frystorkningssystemet enligt tillverkarens anvisningar.
- Coat provet med ett guldskikt upp till 20 nm tjocktmed en låg vakuum sputter beläggaren.
OBS: Instrumentinställningar varierar mellan olika modeller. Den modell som används här är helt automatiserad och fungerar endast med tjocklek. - Bild prover med ett svepelektronmikroskop vid 5 kV och en 40.000-faldig förstoring.
6. In vitro cytotoxicitet av kontroll och doxorubicin laddad Silk Nanopartiklar
- Cellviabiliteten efter exponering för Silk Nanopartiklar.
- Kultur MDA-MB-231-celler i RPMI 1640 med 10% vol / vol FBS. Platt celler på vävnadsodlingsbehandlade polystyren och inkubera i en fuktad 5% CO2 atmosfär vid 37 ° C. Rutinmässigt subkultur vid 80% sammanflytning var 2-3 dagar.
- Plate MDA-MB-231-celler vid en densitet av 2 x 10 4 celler / cm 2 i 96-brunnsplattor. Tillåta cellerna att återhämta sig över natten.
- Lägg (i) från 0,001 till 1 | ig fritt diffunderbart doxorubicin, (ii) 0,001-0,5 mg silke nanopartiklar och 0,1 mg silke nanopartiklarladdad med 0,001-1 ug doxorubicin in i 96-brunnsplattor (slutvolym 100 | il per brunn).
- Bestämma cellviabilitet och halv maximal inhiberande koncentration (IC 50) genom tillsats av (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT 5 mg / ml i PBS) vid 72 h. Inkubera i 5 h, noggrant tömma brunnarna med en pipett och upplösa formazan med 100 pl av dimetylsulfoxid. Mät absorbansen vid 560 nm. Upprepa denna mätning i tre oberoende experiment.
OBS: absorbansvärdena för obehandlade kontroller fungerar som ett referensvärde för 100% cellviabilitet.
- SEM av celler exponerade för Silk Nanopartiklar.
- Seed MDA-MB-231-celler på sterila täckglas vid en densitet av 2 x 10 4 celler / cm 2. Tillåta cellerna att återhämta sig över natten. Exponera cellerna till de önskade behandlingsbetingelserna under 72 timmar.
- Fixera cellerna med 2% vol / vol glutaraldehyd i PBS under 30 minuter, tvätta med distillas vatten två gånger, dehydrera med en etanolserie och kritisk punkt torka proverna, som beskrivs på annat håll 28.
- Spotta belägga prover med ett guldskikt upp till 20 nm tjockt med en låg vakuum sputter beläggaren.
OBS: Instrumentinställningar varierar mellan olika modeller. Den modell som används här är helt automatiserad och fungerar endast med tjocklek. - Bild proverna av SEM med hjälp av en elektronacceleration av 5 kV och 700 gångers förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data analyserades statistiskt som tidigare 17 detalj. Students t-test användes för provpar och en-vägs variansanalys (ANOVA) följt av Bonferronis multipla jämförelse post hoc test för multipla prover. En asterisk betecknar statistisk signifikans på följande sätt: * P <0,05 och ** P <0,001. Alla data presenteras som medelvärden ± standardavvikelse (SD) och siffrorna inom parentes anger antalet oberoende experiment.
Regenererad silke lösning framställdes och därefter tillsattes droppvis till aceton för att alstra sidennanopartiklar via Nanoprecipitation (Figur 1). Denna metod gav uniform (polydispersitetsindex: 0,1), sfärisk, siden nanopartiklar (106,5 nm ± 1,1) med en negativ ytladdning (-49,57 mV ± 0,6) (fig 2 och 3). Silke nanoparticle stförmåga i vatten utvärderades för upp till 28 dagar genom att övervaka partiklar storlek, zeta-potential och morfologi (fig 2 och 3). Över lagringsperioden på 28 dagar, vid antingen 4 ° C eller 25 ° C, ingen signifikant förändring av partikelstorlek, laddning (fig 2) eller morfologi observerades (Figur 3).
Doxorubicin användes som en kliniskt relevant kemoterapeutiskt modelläkemedel för läkemedelsladdning och in vitro cytotoxicitetsstudier. Tre olika silke nanopartiklar koncentrationer (10, 30 och 50 mg / ml) användes för att bedöma läkemedelsladdning kapaciteten hos silkesnanopartiklar. Doxorubicin Inkapslingseffektiviteten för 10, 30 och 50 mg / ml siden nanopartiklar (dvs, 2, 6 eller 10 mg av siden och 232 | j, g av doxorubicin) var 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 och 97 ± 0,2%, respektive (Figur 4A ). Partikelstorleken och zeta-potentialen för doxorubicin-loAded silke nanopartiklar (10 mg) mättes och jämfördes med 10 mg silke nanopartiklar kontroller. Partikelstorleken förändrades inte efter läkemedelsladdning (Figur 4B), medan zeta-potentialen för doxorubicin-loaded siden nanopartiklar reducerades signifikant från 49,57 ± 0,6 mV till 43,52 ± 0,37 mV (figur 4C).
Förmågan hos läkemedelsladdade silke nanopartiklar för att leverera doxorubicin och därefter döda cancerceller utvärderades in vitro. Mänsklig bröstcancer MDA-MB-231-celler exponerades för silke nanopartiklar, fritt diffunderbart doxorubicin eller doxorubicin belastade silke nanopartiklar. Cellviabilitet bestämdes efter en 72 timmars exponeringstiden. IC50-värdena för fritt diffunderbart doxorubicin och doxorubicin-loaded siden nanopartiklar var 0,48 | j, g / ml och 0,24 | ig / ml, respektive, medan de silke nanopartiklar hade ett IC 50> 5 mg / ml (figur 5A).Vid ekvivalenta läkemedelsdoser av 0,1 mikrogram, fritt diffunderbart doxorubicin och doxorubicin belastade silke nanopartiklar orsakade betydande minskningar i cellviabilitet av 83 ± 11 och 65 ± 11%, respektive (Figur 5B). Men fritt diffunderbart doxorubicin visade en väsentlig större cytotoxicitet än doxorubicin belastade silke nanopartiklar. Dessa kvantitativa mätningar stöddes av kvalitativ SEM avbildning (Figur 5c). Här, kontrollodlingar uppvisade hög cellulär täthet och en dominerande mesenkymala MDA-MB-231-fenotyp; Liknande observationer gjordes för kulturer som exponerats för silkesnanopartiklar. Men kulturer exponerade för doxorubicin visade en helt annan cellfenotyp. Vid motsvarande doxorubicin dos, MDA-MB-231-celler som behandlats med fritt diffunderbart doxorubicin och doxorubicin-loaded siden nanopartiklar visade en betydande reduktion i cellantal. Dessutom har många celler hade en mycket bred och utspridda morfologi. kulturer expSTÄNGD till doxorubicin belastade silke nanopartiklar visade tecken på nanopartiklar (och deras aggregat) i samband med plasmamembranet (figur 5C).
Figur 1: De viktigaste stegen för att generera en omvänd konstruerad siden lösning och silke nanopartiklar Först silkeskokonger omvänd konstruerad genom att skära och sedan avslemning dem under 60 minuter (dvs kokning) för att ge avslemmade silkesfiber.. Fibrerna löses i 9,3 M LiBr och dialyseras sedan mot vatten under 72 timmar. En vattenhaltig 5% vikt / volym silke lösningen används för att generera silkesnanopartiklar. Droppvis tillsats av silke i aceton leder till silke Nanoprecipitation. Silke nanopartiklar tvättas och samla för senare användning. Klicka här för att se en större version av dennafigur.
Figur 2:. Storlek och laddnings karakterisering av siden nanopartiklar Partikelstorlek och zeta potential siden nanopartiklar vid 4 ° C och 25 ° C under 28 dagar. ± SD; felstaplar är dolda inom tomten symbolen när de inte syns, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Kvalitetsbedömning siden nanopartiklar som lagrats vid 4 ° C och 25 ° C över 28 dagar Silk nanopartiklar avbildades med svepelektronmikroskop (Skala bar = 1 mikrometer). Pleas klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Karakterisering av doxorubicin-loaded siden nanopartiklar (Dox-SNP) (A) Inkapslingseffektivitet av 232 ug doxorubicin som svar på olika mängder av silke nanopartiklar (SNP),. 2, 6 och 10 mg silkesnanopartiklar. Inkapslingseffektiviteten för 10 mg och 5 mg siden nanopartiklar ökade signifikant jämfört med 2 mg siden nanopartiklar. (B) Partikelstorlek och (C) zeta-potentialen för doxorubicin-loaded silke nanopartiklar jämfört med kontrollsilkesnanopartiklar (10 mg av sidennanopartiklar). Statistiskt signifikanta skillnader för provpar bestämdes med Students t-test. Flera prover bedömdes av en-vägs ANOVA, följt av Bonferronis multipla jämförelse post hoc-test; * P & #60; 0,05, ** P <0,001, ± SD; felstaplar är dolda inom tomten-symbolen när den inte syns, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: In vitro cytotoxicitet av sidennanopartiklar och doxorubicin-loaded siden nanopartiklar i humana bröstcancerceller (A) Cellviabilitet av MDA-MB-231-celler efter en 72 h behandlingscykel med silkesnanopartiklar (SNP) (0,01-5 mg. / ml); volymer per brunn var 100 | il. (B) Cellviabilitet av MDA-MB-231-celler efter en 72 timmar behandlingscykel med 0,1 mg siden nanopartiklar, 0,1 mikrogram av fritt diffunderbart doxorubicin (Dox) eller 0,1 mg siden nanopartiklar laddade med 0,1 mikrogram av doxorubicin (Dox-SNP). Cellviabilitet var statistiskt minskat efter exponering för 0,1 | ig av fritt diffunderbart doxorubicin och 0,1 mg av sidennanopartiklar laddade med 0,1 ^ g av doxorubicin i jämförelse med kontrollen. (C) SEM-bilder av MDA-MB-231-celler som exponerats för (i) medium (kontroll), (II) 0,1 mg silke nanopartiklar, (iii) 0,1 | ig av fritt diffunderbart doxorubicin, och (iv) doxorubicin-loaded siden nanopartiklar på ekvivalenta doser (Skala bar = 50 mikrometer). Statistisk analys utfördes genom en envägs ANOVA följt av Bonferronis multipla jämförelse post hoc-test, ns = ej signifikant, * P <0,05, ** P <0,001, ± SD; felstaplar är dolda inom tomten-symbolen när den inte syns, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika metoder finns tillgängliga för att producera silke nanopartiklar, inklusive polyvinylalkohol blanda 20, spraytorkning 21, utsaltning 22, kapillär microdot utskrift 23, superkritisk CO2 utfällning 24 och Nanoprecipitation 16,25 (översikt i referens 26). Emellertid Nanoprecipitation, på grund av dess övergripande enkelhet, är den mest populära tekniken för att alstra sidennanopartiklar. Därför är syftet med denna studie var att tillämpa Nanoprecipitation att bakåtkompileras siden att tillverka silke baserade nanopartiklar som kan användas för en rad tillämpningar, inklusive lysosomotropic cancer drug delivery.
Under det senaste årtiondet har Nanoprecipitation blivit en av de vanligaste metoderna för tillverkning av proteinbaserade nanopartiklar 29. Vår forskargrupp 16,17 och andra 25,26,30,31 har framgångsrikt tillämpat denna tekniknik silke; Här presenterar vi en enkel men robust stegvis protokoll för generering av siden nanopartiklar. Aceton Nanoprecipitation ger sfäriska siden partiklar som är homogena i storlek och faller typiskt i nanometerstorlek. Aceton har blivit den föredragna kontinuerliga fasen över lösningsmedel såsom metanol, etanol, isopropanol och butanol 16,25. Aceton ger nanopartiklar som har en reducerad nivå av hydrering vid jämförelse med den metastabila 100-200 nm dimensionerad sfäriska micellära strukturer som förekommer i nativa och regenererade silkes lösningar 32. Men det finns utrymme för att undersöka lösningsmedelsblandningar och variationer i avslemning tid för att generera silke (nano) partiklar med potentiellt olika egenskaper än de som beskrivs här. Protokollet som beskrivs här utnyttjar aceton som den kontinuerliga fasen, vilket möjliggör tillverkning av enhetliga sfäriska nanostorlek siden partiklar (106,5 ± 1,1 nm) som bär en negativ ytladdning (-49,5777, 0,6 mV) och som har en tät packning av hydrofoba, kristallina siden kedjor 16,17. Sammantaget kräver beskrivna proceduren lite praktisk tid och ger siden nanopartiklar från en omvänd konstruerad vatten siden lösning (Figur 1). Några av de viktigaste funktionerna i detta förfarande innefattar användning av 60 minuter avslemmad siden, lämplig droppstorlek (cirka 10 l / drop) och en maximal dropptakt på 50 droppar / min. Ta hänsyn till dessa viktiga funktioner resulterar i en typiskt utbyte av 14%. Dessa nanopartiklar är robusta och vi bevisa att de är stabila och inte ändra sina fysiska egenskaper under en lagringsperiod på 28 dagar. Emellertid är en potentiell nackdel med den beskrivna metoden frånvaron att generera partiklar över ett brett storleksintervall (dvs., för att generera partiklar från nanometermikrometerskala under bibehållande av en smal polydispersitet index).
Styra partikelstorlek, ladda och formen är important för läkemedelstillförsel, särskilt när de riktar solida tumörer 33. Partiklar i 100 nm storleksintervallet växer fram som ideala kandidater för tumörmålsökning. Därför 100 nm storlek siden nanopartiklar är potentiella utmanare som läkemedel mot cancer leveranssystem för solida tumörbehandlingar. Silk nanopartiklar har en negativ ytladdning, vilket gör dem lätt lastad med positivt laddade läkemedel genom utnyttjande av elektrostatisk växelverkan 16. Men förutom laddning, ytterligare läkemedels egenskaper (t.ex. logd) är också kända för att påverka läkemedelsbelastning och släpp 34. I föreliggande studie, doxorubicin, ett svagt basiskt läkemedel mot cancer, valdes som en modell läkemedelskandidat. Läkemedelsladdningen studie (figur 4) visade att ökning av silke nanopartikelkoncentrationen lett till ökad doxorubicin inkapslingseffektivitet; 10 mg silkesnanopartiklar kan kapsla in 232 mikrogram av doxorubicin. Läkemedelsbelastning av silke nanoparticles i sin tur resulterade i siden nanopartiklar med en kraftigt minskad kostnad yta, som var direkta experimentella bevis som bekräftar att doxorubicin-siden laddningsinteraktion är viktigt för just denna läkemedelsbärare kombination.
Vi har tidigare visat att silke nanopartiklar kan fungera som en lysosomotropic läkemedelsleveranssystem 16,17. Här visar vi ett test med användning av doxorubicin-loaded silke nanopartiklar för att behandla den humana bröstcancer MDA-MB-231-cellinjen. Dessa celler är härledda från en mycket invasiva trippel negativa bröstcancer (ER - / PR - / HER2 -) som är svår att behandla på kliniken 35. Därför att utforma ett system för läkemedelstillförsel anpassas till denna patientgrupp förväntas ge enorma fördelar. I avsaknad av läkemedelsladdningen, gjorde siden nanopartiklar påverkar inte cellviabilitet (IC 50-värden> 5 mg / ml) (figur 5a, c). Men vid equivalenta doser var signifikant större cytotoxicitet observerades med fritt diffunderbart doxorubicin än med doxorubicin belastade sidennanopartiklar (figur 5B). Skillnaderna mellan de cellulära farmakokinetik fritt diffunderbart och partikelbundet läkemedel in vitro förklara denna observation. Den fritt diffunderbart läkemedlet kan snabbt korsa plasmamembranet via diffusion, medan upptaget av de läkemedelsladdade nanopartiklar är beroende av endocytos. Ändå kan endocytiska upptag av nanopartiklar förbättra läkemedelskvarhållande och övervinna läkemedelsresistensmekanismer 3. Emellertid är den sanna nyttan av nanopartikelmedierad anticancer läkemedelsavgivning att den utnyttjar EPR effekten att underlätta passiv tumörmålsökning och förbättra farmakokinetik. Därför användningen av en nanopartikel-baserade läkemedelstillförsel tillvägagångssätt kan endast till fullo bedömas in vivo. In vitro-studier har begränsningar (dvs frånvaro av EPR effekt) som utesluter hela characterization av dessa typer av läkemedel leveranssystem 7.
Sammanfattningsvis tillåter den beskrivna metoden enkel framställning av sfäriska siden nanopartiklar av enhetlig storlek och ytladdning. Dessa silke nanopartiklar kan användas för ett brett spektrum av tillämpningar (t.ex. kosmetika, mallar för nano mönstring, teranostik, smörjmedel, kontrollpartiklar för nanotoxicity studier), inklusive deras användning som läkemedel mot cancer leveransplattformar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR International, Radnor, PA, USA | 20066.33 | |
| Automated Critical Point Dryer | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM CPD300 | |
| Balancing | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | NewClassic MS | |
| Black polystyrene microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3991 | |
| Capillary cell (DTS 1070) | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | DTS107 | |
| Carbon adhesive disc | Agar Scientific, Essex, UK | G3347N | |
| Centrifuge | Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany | Z323K | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Avanti J-E, Rotor: J20 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392 | |
| Coater, low vacuum | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | EM ACE200 | |
| Cuvettes, polystyrene, disposable | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | FB55147 | |
| Doxorubixin | LC Laboratories, Boston, MA, USA | D4000 | |
| Electronic pipetting, Easypet | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| FE-SEM | Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany | SU6600 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 16000-044 | |
| Freeze dryer | Martin Christ, Osterode, Germany | Epsilon 2-4 | |
| Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons | Tajima Shoji, Kanagawa, Japan | N/A | |
| Hotplate with Stirrer | Bibby Scientific, Stanffordshire, UK | US 152 | |
| Incubator | Memmert, Schwabach, Germany | INB 200 | |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 12585-014 | |
| Lithium bromide | Acros Organics, Geel, Belgium | AC199870025 | |
| MDA-MB-231 | ATCC, Manassas, VA, U.S.A | N/A | |
| Micropipette and tips | Eppendorf, Hamburg, Germany | N/A | |
| Microplate Reader | Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA | SpectraMax M5 | |
| Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | N/A | |
| Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml | Beckman Coulter, Brea, CA, USA | 355645 | |
| Penicilin/streptomycin | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| RPMI medium | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 11875-093 | |
| Serological pipettes, 5 ml | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | ||
| Silicon wafers | Agar Scientific, Essex, UK | G3391 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 87724 | |
| Sodium carbonate anhydrous | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S/2840/62 | |
| Specimen stubs for SEM | Agar Scientific, Essex, UK | G301 | |
| Ultrasonic homogenizer | Bandelin, Berlin, Germany | Sonoplus HD 2070 | |
| UV transparent microplate, 96 well | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 3635 | |
| Vortex | IKA, Staufen, Germany | Genius 3 | |
| Zetasizer | Malvern Instrument, Worcestershire, UK | Nano ZS | |
| Zetasizer Software version 7.11 | DLS software | ||
| Micro Modulyo | Thermo Fisher | 230 | Freeze drying system |
References
- Haley, B., Frenkel, E. Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 26 (1), 57-64 (2008).
- Sun, T., Zhang, Y. S., Pang, B., Hyun, D. C., Yang, M., Xia, Y. Engineered nanoparticles for drug delivery in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (46), 12320-12364 (2014).
- Davis, M. E., Chen, Z. G., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (9), 771-782 (2008).
- Sheridan, C. Proof of concept for next-generation nanoparticle drugs in humans. Nature Biotechnol. 30 (6), 471-473 (2012).
- Matsumura, Y., Hitoshi, M. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res. 46, 6387 (1986).
- De Duve, C., De Barsy, T., Poole, B., Trouet, A., Tulkens, P., Van Hoof, F. Lysosomotropic agents. Biochem. Pharmacol. 23 (18), 2495-2531 (1974).
- Duncan, R., Richardson, S. C. W. Endocytosis and intracellular trafficking as gateways for nanomedicine delivery: opportunities and challenges. Mol. Pharm. 9 (9), 2380-2402 (2012).
- Vishakha, K., Kishor, B., Sudha, R. Natural Polymers - A Comprehensive Review. Int. J. Pharm. Biomed. Res. 3 (4), 1597-1613 (2012).
- Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Silk fibroin biomaterials for controlled release drug delivery. Expert. Opin. Drug Del. 8 (6), 797-811 (2011).
- Thurber, A. E., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vivo bioresponses to silk proteins. Biomaterials. 71, 145-157 (2015).
- Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk. Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).
- Seib, F. P., Pritchard, E. M., Kaplan, D. L. Self-Assembling Doxorubicin Silk Hydrogels for the Focal Treatment of Primary Breast. Adv. Funct. Mater. 23 (1), 58-65 (2013).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Doxorubicin-loaded silk films: drug-silk interactions and in vivo performance in human orthotopic breast cancer. Biomaterials. 33 (33), 8442-8450 (2012).
- Seib, F. P., Coburn, J., et al. Focal therapy of neuroblastoma using silk films to deliver kinase and chemotherapeutic agents in vivo. Acta. Biomater. 20, 32-38 (2015).
- Coburn, J. M., Na, E., Kaplan, D. L. Modulation of vincristine and doxorubicin binding and release from silk films. J. Control. Release. 220, 229-238 (2015).
- Seib, F. P., Jones, G. T., Rnjak-Kovacina, J., Lin, Y., Kaplan, D. L. pH-dependent anticancer drug release from silk nanoparticles. Adv. Healthc. Mater. 2 (12), 1606-1611 (2013).
- Wongpinyochit, T., Uhlmann, P., Urquhart, A. J., Seib, F. P. PEGylated Silk Nanoparticles for Anticancer Drug Delivery. Biomacromolecules. 16 (11), 3712-3722 (2015).
- Seib, F. P., Kaplan, D. L. Silk for Drug Delivery Applications: Opportunities and Challenges. Isr. J. Chem. 53 (9-10), 1-12 (2013).
- Yucel, T., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Silk-based biomaterials for sustained drug delivery. J. Control. Release. 190, 381-397 (2014).
- Wang, X., Yucel, T., Lu, Q., Hu, X., Kaplan, D. L. Silk nanospheres and microspheres from silk/pva blend films for drug delivery. Biomaterials. 31 (6), 1025-1035 (2010).
- Qu, J., Wang, L., Hu, Y., You, R., Li, M. Preparation of Silk Fibroin Microspheres and Its Cytocompatibility. J. Biomater. Nanobiotechnol. 4, 84-90 (2013).
- Lammel, A., Hu, X., Park, S., Kaplan, D., Scheibel, T. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31 (16), 4583-4591 (2010).
- Gupta, V., Aseh, A., Rìos, C. N., Aggarwal, B. B., Mathur, A. B. Fabrication and characterization of silk fibroin-derived curcumin nanoparticles for cancer therapy. Int. J. Nanomedicine. 4, 115-122 (2009).
- Zhao, Z., et al. Generation of silk fibroin nanoparticles via solution-enhanced dispersion by supercritical CO2. Ind. Eng. Chem. Res. 52 (10), 3752-3761 (2013).
- Tudora, M., Zaharia, C., Stancu, I. Natural silk Fibroin micro-and nanoparticles with potential uses in drug delivery systems. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 75 (1), 43-52 (2013).
- Zhao, Z., Li, Y., Xie, M. B. Silk Fibroin-Based Nanoparticles for Drug Delivery. Int. J. Mol. Sci. 16 (3), 4880-4903 (2015).
- Rockwood, D., Preda, R., Yücel, T. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protoc. 6 (10), 1-43 (2011).
- Seib, F. P., Müller, K., Franke, M., Grimmer, M., Bornhäuser, M., Werner, C. Engineered extracellular matrices modulate the expression profile and feeder properties of bone marrow-derived human multipotent mesenchymal stromal cells. Tissue. Eng. Part A. 15 (10), 3161-3171 (2009).
- Lai, P., Daear, W., Löbenberg, R., Prenner, E. J. Overview of the preparation of organic polymeric nanoparticles for drug delivery based on gelatine, chitosan, poly(d,l-lactide-co-glycolic acid) and polyalkylcyanoacrylate. Colloids Surf., B, Biointerfaces. 118, 154-163 (2014).
- Subia, B., Kundu, S. C. Drug loading and release on tumor cells using silk fibroin-albumin nanoparticles as carriers. Nanotechnology. 24 (3), 035103 (2013).
- Zhang, Y. Q., Shen, W. D., Xiang, R. L., Zhuge, L. J., Gao, W. J., Wang, W. B. Formation of silk fibroin nanoparticles in water-miscible organic solvent and their characterization. J. Nanopart. Res. 9 (5), 885-900 (2006).
- Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
- Yhr Bae,, Park, K. Targeted drug delivery to tumors: myths, reality and possibility. J. Control. Release. 153 (3), 198-205 (2011).
- Lammel, A., Schwab, M., Hofer, M., Winter, G., Scheibel, T. Recombinant spider silk particles as drug delivery vehicles. Biomaterials. 32 (8), 2233-2240 (2011).
- Holliday, D. L., Speirs, V. Choosing the right cell line for breast cancer research. Breast. Cancer. Res. 13, 215 (2011).
