Summary
Des études de la morphogenèse neuronale utilisant la drosophile arborisation dendritique larvaire (da) neurones bénéficient de la visualisation in situ des protéines neuronales et épidermiques par immunofluorescence. Nous décrivons un procédé qui permet d'améliorer l'analyse par immunofluorescence des neurones DA et des cellules épidermiques entourant en retirant le tissu musculaire de la paroi du corps de la larve.
Abstract
Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile sont un modèle populaire pour les mécanismes de la morphogenèse neuronale enquête. Neurones Da se développent dans la communication avec les cellules de l' épiderme , ils innervent et donc leurs avantages de l' analyse de la visualisation in situ des deux protéines neuronal et épidermique exprimées par immunofluorescence. Les méthodes traditionnelles de préparation des filets larvaires pour les expériences d'immunofluorescence laissent intact le tissu musculaire qui couvre la majeure partie de la paroi du corps, présentant plusieurs défis à l'imagerie des protéines neuronales et épidermiques. Nous décrivons ici un procédé pour éliminer le tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole permet l'imagerie des protéines qui sont autrement occulté par le tissu musculaire, améliore le rapport signal à bruit, et facilite l'utilisation de nanoscope pour étudier da développement des neurones.
Introduction
Larvaires arborisation dendritique (da) neurones de drosophile fournissent un excellent modèle pour l' étude du développement neuronal en raison de leur susceptibilité à la manipulation génétique et la facilité avec laquelle ils peuvent être visualisés. Ces neurones sensoriels ont joué un rôle dans l'identification de nombreuses voies qui contrôlent dendrites morphogenèse 1-3.
Quatre classes de neurones DA (classe I - IV) innervent l'épiderme larvaire. Ces neurones se trouvent entre la membrane basale et l'épiderme, avec leurs dendrites formant matrices bidimensionnelles en grande partie à 4,5. Sur les quatre classes, la classe IV neurones DA ont les tonnelles plus fortement ramifiée et, comme les neurones sensoriels d'autres animaux, l'élaboration de ces tonnelles exige des facteurs intrinsèques, ainsi que des indices de tissus voisins, en particulier l'épiderme, pour leur développement 6-9 .
Les études pour déterminer la façon dont ces neurones et fait extra-neuronalSOR avantage de contrôler la morphogenèse dendritique de la capacité à détecter l' expression de la protéine in situ par immunofluorescence. La cuticule externe de la larve est impénétrable aux anticorps, mais cet obstacle est facilement surmontée par la préparation des filets larvaires grâce à des méthodes de dissection bien établies 10,11. Cependant, le tissu musculaire de la paroi du corps qui se trouve juste à l'intérieur de la membrane de sous-sol présente de nombreux défis à la visualisation des neurones DA et des cellules de l'épiderme. D'abord, le tissu musculaire, qui tapisse la plupart de la paroi du corps, obscurcit considérablement des signaux fluorescents provenant d'un tissu neuronal ou épidermique. Ceci réduit considérablement le rapport signal sur bruit dans l'échantillon. D'autre part, de nombreuses protéines pertinentes peuvent être exprimées dans le tissu musculaire, ainsi que dans les neurones ou de l'épiderme. Ce signal de fluorescence dérivées du muscle est susceptible d'obscurcir davantage la détection d'un signal de fluorescence provenant du neurone ou de l'épiderme. Enfin, les progrès dans les technologies de microscopie pasl' imagerie d' un permis poids d'échantillons à une résolution de sous-diffraction et peut être particulièrement utile pour discerner la localisation de protéines qui sont exprimées dans les neurones et les cellules épidermiques entourant 12,13. Cependant, l'imagerie par microscopie de super-résolution bénéficie d'un signal fort par rapport au bruit et à proximité de l'échantillon à la lamelle. En plus de réduire le rapport signal à bruit, les larves de la paroi du corps muscle distances neurones DA de la lamelle couvre-objet, ce qui limite la résolution de l'image améliorée qui peut être obtenue avec des procédés de microscopie de super-résolution. En plus de difficultés pour l'analyse d'immunofluorescence, le tissu musculaire présente une barrière à l'enregistrement électrophysiologique des neurones sensoriels dans la paroi du corps de la larve. Son retrait profite donc la manipulation neurophysiologique des neurones sensoriels 14.
Voici une méthode pour l' extraction manuelle du Drosophila tissu musculaire larvaire est décrite. Nous démontrons que notre protocole permites immunofluorescence imagerie des protéines qui sont autrement obscurcie par le tissu musculaire, améliore le rapport signal sur bruit pour la visualisation de la classe IV neurones DA, et permet l'utilisation de super-résolution microscopique afin de mieux discriminer les relations spatiales des protéines et des structures cellulaires en neurones DA et l'épiderme.
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Protocol
Remarque: La procédure de destitution musculaire (Figure 1) est une modification des méthodes décrites précédemment pour la préparation des filets larvaires. Les étapes qui précèdent et suivent le retrait du muscle sont décrites brièvement et le lecteur est renvoyé aux travaux antérieurs 10, 11 pour des descriptions plus détaillées.
1. Disséquer Larve dans une solution saline froide
- Préparer une dilution de travail de solution saline froide HL3.1 15 ou Ca 2+ froid -free HL3.1 saline 11 (tableau 1). Placez la larve dans un plat en élastomère de silicone avec juste assez de solution saline froide pour couvrir le fond du plat.
REMARQUE: Voir Discussion concernant le choix d'une solution saline.
| 1x HL3.1 solution saline (pH 7,2) |
| 5 mM de HEPES |
| 70 mM de NaCl, |
| 1,5 mM de CaCl2 (omettre de Ca 2+ solution saline -free) |
| 4 mM de MgCl2 |
| 10 mM NaHCO 3 |
| mM tréhalose 5 |
| 115 mM de saccharose, |
| Filtre stériliser et conserver à 4 ° C |
| imite Composition insectes hémolymphe: Note |
Tableau 1. Composition de Cold Saline.
- Positionner la larve à la face ventrale. La surface ventrale de la larve peut être identifiée par les ceintures abdominales et dentical la face dorsale par les principaux tubes trachéaux larvaires course d'avant en arrière. Étirez la larve dans le sens antéro-postérieur et la broche de la tête et la queue à unélastomère silicone disséquant plat utilisant des broches d'insectes. Utilisez des ciseaux fins de dissection pour couper le long de la ligne médiane ventrale, en commençant à une extrémité et en progressant vers l'autre.
NOTE: Cette orientation préserve le cluster dorsal couramment étudié des neurones DA. - Après la larve est découpée, épingler les quatre coins de la boîte de dissection, comme si l'ouverture d'un livre. Utilisez une pince pour saisir et retirer les organes internes, y compris le système nerveux central, de l'intestin et de la trachée. Ajustez les broches d'insectes de sorte que le filet est tendu mais pas au maximum étiré.
NOTE: Les muscles sont ancrés à la paroi du corps au niveau des limites segmentaires. Bien que les muscles couvrent la majeure partie de la paroi du corps, ils sont absents dans une région étroite à proximité de la ligne médiane dorsale.
2. Muscle Removal
- Repérez la ligne médiane dorsale de la larve, où le tissu musculaire est absent. Positionner une pince à broche unique de telle sorte qu'il puisse être inséré sous le tissu musculaire dans la plate orientation possible.
- À partir dela ligne médiane dorsale, près de la limite antérieure du segment, faites glisser soigneusement la griffe de pince entre le muscle et de l'épiderme, en prenant soin de réduire au minimum le contact entre la pince et de l'épiderme.
- Tirez la pince vers le haut pour briser l'attachement du muscle à la paroi du corps à un point d'ancrage. Répétez ce processus pour l'hémi-segment (s) d'intérêts restants.
NOTE: Ce protocole permet d'optimiser la préservation de la partie postérieure de chaque champ dendritique des neurones da. Afin de préserver la partie antérieure du champ dendrites, il est préférable d'insérer la pince griffe à l'extrémité postérieure de chaque segment. - Re-ajuster les broches d'insectes tels que le filet larvaire est au maximum tendue dans toutes les directions.
- Fixer le filet alors qu'il est encore cloué au plat de dissection en utilisant le froid, fraîchement préparé formaldéhyde 4% dans du PBS pendant 25 min.
- Rinçage 5 fois dans du PBS.
- Utilisez une pince pour tirer précieusement le tissu musculaire à partir des points d'ancrage restants, en prenant soin de minimiser contact avec l'épiderme.
- Détacher et retirer le filet du plat de dissection à un tube de 1,5 ml. Effectuer toutes les lessives, le blocage, et des étapes ultérieures immunofluorescence de coloration, comme décrit précédemment 11.
3. Monter le larvaire Fillet
- Tout d'abord enlever la tête et la queue en utilisant des ciseaux fins de dissection afin de rendre l'échantillon le plus plat possible. Monter le filet sur une lamelle en antifade milieu de montage avec la surface intérieure du filet face à la lamelle.
- Placez une lame de microscope sur la lamelle et appuyez doucement pour disperser le milieu de montage. Retournez la lame de microscope sur et sceller la lamelle sur la lame à l'aide de vernis à ongles. Les diapositives peuvent être conservés à -20 ° C pendant au moins un mois.
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Representative Results
Nous démontrons l'utilité de la procédure de retrait des muscles pour améliorer le rapport signal sur bruit dans des expériences d'immunofluorescence pour co-visualiser les protéines cloisonnées de jonction Coracle (Cora) et disques-large (DLG) ainsi que des neurones da classe IV marquées avec le marqueur membranaire CD4- tdTomato.
Cora a déjà été utilisé pour identifier les secteurs où da dendrites neuronales sont entourées par des cellules de l' épiderme et est l' un des nombreux facteurs épidermiques identifiés qui ont été étudiés en association avec la morphogenèse et la fonction du neurone da dendrites 4,6-9,16. Immunocoloration avec un anticorps anti-DsRed pour détecter les neurones (rouge) et l'anticorps anti-Cora (vert) a été effectuée sur des filets de larves avec le muscle enlevé (muscle-off) et de muscles entiers (muscle-on). Pour chaque condition, le champ de la classe IV da neurone dendrites postérieure a été imagée en utilisant un microscope à balayage laser confocal. Les images ont été obtenues à l'aide idparamètres d'imagerie entical pour les deux conditions. Nous imager en outre musculaire sur les filets à l'aide de l'augmentation du pouvoir de laser pour compenser l'interférence du tissu musculaire.
Dans les échantillons de muscle-off, Cora pourrait être clairement détecté au niveau des limites de cellules épidermiques, dans le tractus intermittents le long de dendrites classe IV da neurone, et décrivant la classe IV da neurone soma (figure 2C). En revanche, sa localisation à ces domaines a été largement occultée dans le muscle sur des échantillons, même lorsque la puissance du laser a été augmentée (figure 2A-2B). Dans le muscle sur échantillons, Cora a été principalement visualisé dans le muscle, de la trachée, et à la jonction neuromusculaire (JNM), qui sont séparés de la paroi du corps à la suite de la procédure de retrait du muscle. Le signal de fluorescence émanant de ces tissus obscurcie la plupart du Cora qui se localise dans les limites des cellules épidermiques et dendrites tracts, sauf dans la bande étroite du corps wall près de la ligne médiane dorsale, lorsque le muscle est absent. Cora qui décrit la classe IV da neurone soma n'a pas été visualisé dans le muscle sur des échantillons (figure 2A-2B). Visualisation des protéines exprimées épidermique qui ont également l'expression musculaire élevé, comme Dlg, est particulièrement problématique. Dans les échantillons de muscle sur la répartition de la DLG dans l'épiderme a été presque complètement obscurci par fluorescence du muscle et NMJ (figure 2D). Après le retrait du muscle, Dlg est facilement détectée au niveau des limites de cellules épidermiques, dans des tracts intermittents le long de dendrites da neurone, et décrivant la classe IV da neurone soma (Figure 2F). Ainsi, la suppression musculaire permet la visualisation des protéines et épidermique neuronal exprimées autrement obscurcis par les muscles et les tissus associés.
En outre, on a observé que l'intensité de fluorescence du marqueur da neurone de classe IV est apparu réduite dans les muscles sur les filetspar rapport aux filets de muscles quand des paramètres d' imagerie ont été maintenues constantes entre les deux préparations d'échantillons (figure 2A, 2C). Avec l' augmentation de la puissance du laser, l'intensité de fluorescence apparente du marqueur des neurones da classe IV pourrait être adaptée à des échantillons de muscle-off , mais le bruit de fond a été augmenté (figure 2B, 2C). Par conséquent, le retrait du muscle améliore le rapport signal à bruit dans nos échantillons.
Enfin, nous avons testé si les améliorations obtenues en enlevant les tissus musculaires pourraient être appliquées à l'imagerie de la classe IV neurones DA à une résolution sous-diffraction. Pour ce faire, 3D microscopie illumination structurée (SIM) imagerie a été effectuée, ce qui permet d' obtenir une résolution latérale d' environ 120 nm 13. Comme pour l'imagerie confocale, nous avons comparé les filets de muscle et le muscle-off immunocolorées pour Cora et de classe IV neurones DA, tout d'abord dans des conditions de formation d'image identique, puis, après l'optimisation de la puissance du laser, expostemps ure et traitement d'image pour des échantillons de muscle-on. De même que pour la microscopie confocale, un signal sensiblement réduit par rapport au bruit dans le muscle a été observé sur par rapport aux filets des muscles obturateurs (Figure 3A-3C). En outre, la reconstruction d'image est apparue plus nette dans les échantillons de muscle-off. Par rapport aux muscles sur des échantillons, moins d' artefacts apparents ont été observés et Cora tracts dendritiques ont été plus facilement résolus (figure 3B, 3C). Membranes Dendrite pourraient être évalués à environ 114 nm de largeur dans les filets de muscle-off , mais semblaient être 272 nm de large dans le muscle sur les filets (Figure 3D, 3E). Ainsi, notre protocole permet l'application de super-résolution microscopie à la visualisation de la classe IV neurones DA.
Figure 1. Vue d' ensemble de la procédure de suppression de Muscle. Une larve est disséquée et épinglé à un siliconeélastomère disséquant plat. Pour enlever le tissu musculaire, une pince à broche est insérée entre la couche musculaire et de cellules épidermiques, à partir de la ligne médiane dorsale près d'une limite de segment (2.2). La pince est tiré vers le haut pour rompre la fixation entre la paroi musculaire et le corps (2.3). Cette opération est répétée pour des segments d'intérêt, puis la larve est fixé dans le formol (2.5). Après fixation, pinces sont utilisées pour séparer le tissu musculaire restant de la paroi du corps (2/7 à 2/8) La cuticule larvaire et de l'épiderme sont représentés en orange, classe IV neurones DA en vert, et les muscles en rouge. Insets à (2,2) et (2,7) représentent des vues en coupe d'un seul hémi segment larvaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Muscle RemovalAméliore imagerie confocale de da Neurones et l'Épiderme immunofluorescence de Cora. (Vert; AC) ou Dlg (vert, DE) a été détecté avec le tissu musculaire (A, B, D) et sans tissu musculaire (C, E). Classe IV neurones DA ont été marqués à l' aide GAL4 conducteur 477 'pour exprimer UAS-CD4: tdTomato et détectés avec un anticorps anti-DsRed (rouge). Les échantillons de muscle et sur le muscle-off marqués pour Cora ont d' abord été imagés avec un microscope confocal , dans des conditions identiques (A, C) et ensuite à une augmentation de la puissance laser pour compenser l' interférence musculaire (B). Les échantillons de muscle-on et de muscle-off marqués pour Dlg ont été imagées dans des conditions optimisées individuellement. Toutes les images sont Z-projections confocale. Le milieu (vert) et en bas (rouge) panneaux montrent des canaux individuels; les panneaux supérieurs sont les canaux fusionnés. La limite du tissu musculaire (lignes hachurées), la classe IVda neurone soma (flèches cyan), Cora et Dlg Dendrite tracts (flèches blanches), les limites de cellules épidermiques (flèches magenta), NMJ (flèches jaunes), et de la trachée (flèches oranges) sont indiqués. Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Muscle Removal Active Super-résolution de l' imagerie de da neurones et les cellules épidermiques. De détection par immunofluorescence de Cora (vert) dans la classe IV neurones da avec le muscle intact (A, B) et après le retrait du muscle (C). Classe IV neurones DA ont été marquées comme sur la figure 2 des échantillons de muscle et de muscle sur-off ont été imagés avec un microscope à éclairage structuré première dans des conditions identiques (A, C). l'échantillon de muscle sur(A) a ensuite été ré-imagée avec augmentation de la puissance du laser et les temps d' exposition pour compenser les interférences musculaire (B). Toutes les images sont Z-projections. Au milieu (vert) et en bas (rouge) de panneaux AC montrent des canaux individuels. Le panneau supérieur de l'AC est une fusion. les limites des cellules épidermiques (flèches magenta), les secteurs de dendrites Cora (flèches blanches), et un artefact de reconstruction d'image (flèche jaune) sont indiqués. Encarts dans les panneaux de fond B et C correspondent à D et E, respectivement. La largeur apparente de la membrane dendritique est représenté sur les muscles (D) et (E) des échantillons de muscle-off. Les barres d'échelle = 3 pm (AC) et 0,5 um (D, E). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici , un protocole est décrit pour le retrait manuel du tissu musculaire à partir des filets de Drosophila larves. Ce protocole modifie précédemment décrit les techniques de dissection larvaires 10,11. Après la larve est disséquée dans un plat en élastomère de silicone, la ligne médiane dorsale est située. Une pince à broche unique, dans son orientation la plus plane possible, est soigneusement inséré entre le tissu musculaire et l'épiderme, à proximité de la ligne médiane dorsale. Les pinces sont doucement tiré vers le haut pour le tissu musculaire séparé d'un point d'ancrage dans chaque segment larvaire d'intérêt. Le filet larvaire est alors fixé dans le formol à froid, après quoi la pince sont utilisés de nouveau à se détacher du muscle à partir des points d'ancrage restants.
Bien qu'il soit tentant d'effectuer la totalité de la suppression musculaire procédure de post-fixation, nous constatons que le muscle étiré, une fois fixée, reste aplatie et étroitement apposed à l'épiderme, même après le détachement d'un point d'ancrage, ce qui rendil est difficile de manipuler sans endommager le tissu sous-jacent. tissu musculaire De plus, dans notre expérience, fixe est fragile et se déchire facilement, empêchant son retrait complet de la paroi du corps. En revanche, lorsque le muscle est détaché d'un point avant la fixation d'ancrage, il se contracte vers le point d'ancrage restant lors de la fixation, laissant les talons de tissus qui peuvent être plus facilement saisis par une pince et tiré à partir de la paroi du corps larvaire.
Afin de préserver au mieux les échantillons, un soin considérable doivent être prises pour minimiser le contact entre la pince et l'épiderme pendant la procédure de retrait du muscle. Par conséquent, notre protocole peut ajouter plusieurs minutes à des techniques de dissection précédemment décrites 10,11. Afin d'éviter la dégradation des tissus, le nombre de larves qui sont disséqués avant la fixation doit être limitée de telle sorte que le temps écoulé ne dépasse pas 25 minutes environ. En outre, nous vous recommandons de tester plusieurs paires de pinces - pinces du même model peut varier considérablement en forme et la netteté - et à ajuster la mesure dans laquelle les filets sont étirés avant le retrait du muscle, afin d'améliorer la conservation des tissus et de la vitesse de dissection.
Enfin, nous vous recommandons d' expérimenter avec l'utilisation de Ca 2+ -free saline HL3.1 contre une solution saline HL3.1 standard pendant la dissection des larves. En l'absence de calcium, des contractions musculaires larves sont considérablement réduits. Ainsi, les filets larvaires peuvent être plus faciles à manipuler quand disséqués en Ca 2+ -free HL3.1 saline. Cependant, nous constatons que la contraction musculaire crée un espace entre le muscle et de l'épiderme, ce qui peut faciliter l'insertion de la pince entre ces tissus tout en minimisant le risque de détérioration de l'épiderme. Par conséquent, HL3.1 standard peut être préférable pour préserver l'intégrité de l'épiderme et les neurones dopaminergiques. Nous obtenons de bons résultats avec une solution saline et le choix est laissé à l'utilisateur.
Alors que notre protocole augmentela durée et la complexité des techniques de dissection précédemment décrites 10,11, elle offre plusieurs améliorations qui sont utiles pour l' imagerie des neurones sensoriels de larves et des cellules de l' épiderme. Tout d'abord, il permet l'imagerie des protéines exprimées de manière épidermique et neuronale qui sont autrement cachée par le tissu musculaire. D'autre part, elle améliore le signal de fluorescence par rapport au bruit. Enfin, il permet l'utilisation de la microscopie de super-résolution pour discrimination supérieure de protéines relations spatiales dans da neurones et l'épiderme. L'amélioration de la qualité de l'imagerie que l'on observe après l'enlèvement du muscle est probablement le résultat d'une absorption réduite de photons et de diffusion ainsi que la distance réduite entre l'échantillon et la lamelle. Bien que non montré ici, l'élimination du muscle susceptible d'améliorer également l'accès à l'anticorps de l'épiderme et des neurones DA, ce qui améliore la qualité de l'immunofluorescence. Une plus grande accessibilité des anticorps peut être particulièrement utile pour les protocoles d'immunofluorescence effectuées dans le AbsenCE d'un tissu agent de 4 perméabilisant.
Les améliorations obtenues par l'utilisation de ce protocole sont susceptibles de bénéficier des études sur les neurones et épidermiques facteurs qui régulent la morphogenèse dendrites dans les neurones sensoriels. En outre, la suppression musculaire a déjà facilité l'étude électrophysiologique des neurones sensoriels dans la paroi du corps larvaire et une version modifiée de ce protocole peut être utile pour les études futures qui emploient la manipulation neurophysiologique des neurones sensoriels larvaires. Enfin, une version modifiée de ce protocole peut être utile à d'autres applications telles que l'isolement des neurones da simples pour profil d'expression génique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous remercions Gary Laïevski pour des discussions utiles sur la microscopie. Ce travail a été financé par le NIH accorde R01GM061107 et R01GM067758 à ERG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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