Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

אפיון תחבורה אלקטרון דרך חיים Biofilms

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671

Summary

פרוטוקול למדידת מוליכות חשמלית של חיים חיידקים פתוגנים המועברים במזון תחת תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית מוצג.

Abstract

כאן נדגים את השיטה של gating אלקטרוכימי שימוש כדי לאפיין מוליכות חשמלית של תוצרת אלקטרודה חיידקים פתוגנים המועברים במזון תחת תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. 1 מדידות אלה מבוצעים על החיים biofilms במדיום מימית שימוש במקור ולנקז אלקטרודות בדוגמת על משטח זכוכית בתצורה מיוחדת המכונה מערך interdigitated אלקטרודה (אידה). ממבנה biofilm גדל על פני הפער חיבור המקור, ניקוז. פוטנציאל מוחלים על האלקטרודות (ES ו- ED) יצירת זרם המקור-ניקוז (ISD) דרך biofilm בין האלקטרודות. התלות של מוליכות חשמלית על פוטנציאל שער (הממוצע של פוטנציאל המקור, ניקוז, EG = [ED + ES] / 2) נקבעת על-ידי שינוי בשער פוטנציאליים ומדידת לטמיון-המקור הנוצרת באופן שיטתי הנוכחי. התלות של מוליכות על שער פוטנציאליים מספק מכניסטית מידע אודות תהליך הובלה אלקטרון חוץ-תאית הבסיסית של מוליכות חשמלית של biofilm ספציפית תחת חקירה. שיטת מדידה המגביל אלקטרוכימי המתוארים כאן מבוססת באופן ישיר בשימוש על-ידי Wrighton ס מ2,3 , עמיתים, ר וו מורי-4,-5,-6 ועמיתיו בבית 1980 הוא לחקור פולימרים מוליכים סרט דק.

Introduction

אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET) הוא תהליך המאפשר מיקרואורגניזמים מסוימים להעברת אלקטרונים בין תהליכים מטבוליים תאיים לבין אלקטרונים לא מסיסים acceptors או תורמים השוכנים מחוץ לתא, החל מינרלים טבעיים כדי אלקטרודות. במקרים מסוימים, EET מאפשר מיקרואורגניזמים ליצור biofilms עבה מרובת-תאים מוליכי על משטחים אלקטרודה, שבו תאים לא במגע ישיר עם האלקטרודה יכול עדיין להשתמש זה מקבל אלקטרון מטבולית או תורם. יש עניין רב כזה biofilms כמו זרזים אלקטרודה ליישומים שונים, כגון חיידקים electrosynthesis, חישה מזהם/הסרה, ו דור אנרגיה מרחוק, אחסון,7,8,9 ,10,11,12,13,14 בשל המגוון של תהליכים מטבוליים שבוצעה על-ידי מיקרואורגניזמים, העמידות של חיידקים פתוגנים המועברים במזון בהשוואה כדי מבוססי אנזים bioelectrodes. 15 , 16 . בנוסף, מסלולים EET פוטנציאלי עלול להיות מנוצל כדי חשמלית פקד או אות לשינויים המתרחשים באופן טבעי או מהונדסים גנטית תהליכים מטבוליים חיידקים מעורבים, לדוגמה, הייצור של המוצר הרצוי או זיהוי של analyte המטרה או התמריץ. מוליכות חשמלית של biofilms electrocatalytic, אשר מגדיר אותם מלבד חומרים ביולוגיים אחרים, הוא היבט מרכזי של הנכסים שלהם electrocatalytic, ובכל זאת ליטל מובנת על תהליך EET כבסיס בסביבת אלקטרודה, זה אשר ידוע מאוד שנויה במחלוקת. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

המתוארים כאן היא שיטה 2-אלקטרודות למדידת מוליכות דרך biofilms חי, שגודלו אלקטרודה באמצעות אלקטרודה interdigitated מערכים (IDAs). IDAs מורכב מקבילים אלקטרודות מלבני בדוגמת במשטח זכוכית שטוחה כזאת כל להקה מחובר בשני צידי מערך וכתוצאה מכך ב- 2 אלקטרודות (המקור, ניקוז). בחינה זהירה של אידה (ראה למשל, דמותו 6.12b של ref #1) חושף את הפערים המפריד בין להקות סמוכים הם גם מחובר באופן כזה שהם מהווים רווח יחיד זה אורג הלוך ושוב על פני המערך המפריד בין שתי אלקטרודות. התוצאה היא פער ארוך וצר המפריד בין האלקטרודות המקור, ניקוז, מניב מקור גבוהה מאוד-ניקוז הזרמים כאשר חומר מוליך הוא נוצר, יצוק, polymerized או גדל (במקרה של סוג biofilms נחשב כאן) על המערך. בנוסף, גודל קטן של האלקטרודות תוצאות ברקע קטן הנוכחי בשל קיבוליות טעינה, חל שינוי במצב חמצון של חומר מוליך עם שינוי שער פוטנציאל, מאז כמות החומר הדרוש כדי להפוך את מוליכות מדידות באמצעות IDAs הוא כל כך קטן. הטכניקה של מבוסס-אידה gating אלקטרוכימי המתוארים כאן, שפותחה לאפיין פולימרים מוליכים סרט דק,2,3,4,25 רק לאחרונה הוחל במערכות החיים. 18 טכניקה נוספת למדידת מוליכות של החיים biofilms מנוצל תבנית גדולה לפצל אלקטרודות המקור, ניקוז מקור מטר לקביעת השער פוטנציאליים. 26 , 27 . אולם, החשש שיטות אלה יש כבר מפורט בעבר. 18

להלן הפרוטוקול מכמס הניסיון שלנו עם ביצוע מדידות מוליכות של חיים biofilms MCL Geobacter sulfurreducens ו- biocathode. Sulfurreducens ג הוא אלקטרודה מודל הפחתת אורגניזם מסוגל להשתמש בחומרים לא מסיסים, כולל אלקטרודות, כמו מקבל אלקטרון מטבולית הבלעדית. בנוסף, היא יוצרת biofilms עבה מסוגלים להעביר אלקטרונים על אורכי תאים מרובים, שהופך אותו אורגניזם מודל אידיאלי ללמוד העברת-אלקטרונים למרחקים ארוכים חוץ-תאית אנודי. אנחנו גם לכלול פרטים לצורך המחקר של biocathode MCL, biofilm אירובי, autotrophic מעורבות הקהילה מבודד הקתודה של תא דלק בנתיק מיקרוביאלי. MCL Biocathode (על שם שלושת המרכיבים העיקרי – Marinobacter, Chromatiaceaea ו- Labrenzia) הוא מסוגל מחמצן אלקטרודה כמו תורם אלקטרון הבלעדי שלה, בהעברת אלקטרונים על אורכי תאים מרובים, ביצוע זה מערכת cathodic מעניין ללמוד. בנוסף, biocathode MCL יש את מוליכות שדווחו הגבוהה ביותר עבור מערכת חיה עד היום בשיטות אלה. ההכללה של אלה biofilms electroactive מגוונות של פרוטוקול זה נועד להדגיש כי טכניקה זו ישימה כדי למדוד את התעבורה של אלקטרונים דרך כל biofilm חי חשמלית אינטראקציה עם אלקטרודות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מערך (אידה) interdigitated microelectrode

  1. להשיג אידה זמינים מסחרית אלקטרודות על מצע מוליכים או לסנתז אותם באמצעות שיטות ליטוגרפיה סטנדרטי. 28
    הערה: אידה ממדים ו/או חומרים יכולים להיות מגוונים בהתבסס על תנאים הרצוי עבור ניסויים שונים. IDAs המשמש כאן היו שהושג מסחרית, כללה שני microelectrodes זהב interdigitated על מצע זכוכית מחובר אלקטרודה גדול רפידות בקצוות מנוגדים של המערך. האלקטרודות חשופים בזמן קווי האוטובוס חיבור האלקטרודות הידיות קשר גדול הם מצופים בחומר בידוד דק. IDAs משמש כאן מורכבות של שני סטים של 10 מיקרומטר ברוחב של 2 מ מ microelectrode זהב ארוכה להקות (מקור, ניקוז) במרווחים ביניהם 5 מיקרומטר בדוגמת על משטח זכוכית שטוחה. IDAs משמש כאן היה אלקטרודה 65 זוגות (להקות interdigitated סה כ 130). להקות מתחלפים מחוברים ובפדים בקצוות מנוגדים של המערך.
  2. תיל, לבודד אידה
    1. לצרף חוט כל משטח גדול אלקטרודה השימוש כסוף אפוקסי מוליך.
      1. להכין אפוקסי מוליך על פי הוראות היצרן אפוקסי ספציפי בשימוש עם טיפ מוט או פיפטה ערבוב (הוראות עשויה להשתנות על-ידי יצרן).
      2. במקום חוט על כל משטח זהב, מאובטחת במקום באמצעות הקלטת למעבדה. מכסים בתיל ואת משטח עם אפוקסי כסף באמצעות טיפ מוט או פיפטה ערבוב.
      3. להעביר בזהירות תנור 80 ° C עבור 1 h לרפא או תרופה בהתבסס על ההמלצות של יצרן אפוקסי כסוף מוליך ספציפי בשימוש.
      4. לאחר אפוקסי מרפא, להשתמש multimeter כדי להבטיח קישוריות חשמל בין הקצה של החוט את רפידות. ההתנגדות בין הגדר לבין משטח צריך להיות < 5 Ω. בנוסף, להשתמש את multimeter כדי לוודא כי אין אפוקסי מוליך מתחבר רפידות אלקטרודה מרובים, כמו זה תוכל לקצר את המערך. אם אפוקסי מוליך הוא מתחבר הפניות מרובות, השתמש סופר כדי לבודד את ההפניות.
    2. לבודד את החיבור epoxied על ידי ציפוי הקשר עם תרמית, חשמל, עמיד למים חומר בידוד. שרפים פוליאוריתן retardant להבה, לעיתים קרובות מתאימות.
      1. הסר את קצה שפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL (כ הסימן 2.5 מ ל) כתבנית עבור חומר בידוד. לעשות שני חורים קטנים בתחתית על חוטי החשמל לבלוט דרך באמצעות מחט 21g.
      2. הכנס את אידה עובש של החוטים דרך החורים בתחתית התבנית.
      3. להכין את החומר בידודית הספציפי. בצע את ההוראות שסופקו עם שרף ספציפי שהושג.
      4. Pipette את בידוד חשמלי לתבנית כך אפוקסי כסוף הוא לגמרי מכוסה (~2.5 מ"ל), אפשר להתייבש על פי מפרט היצרן.

2. אלקטרוכימי הכור, בדיקות, וההתקנה חיסון

  1. להגדיר את סוללת.
    1. הכנס אידה מונה אלקטרודה, הפניה אלקטרודה בתא אלקטרוכימי.
      הערה: הכור אלקטרוכימי בשימוש, יכולה להשתנות כל עוד כולנו האלקטרודות להכנס. שיקול אחד נמצא כי האלקטרודה הפניה קרוב ככל האפשר אל האלקטרודה עובד תינתן המגבלות המעשיות של הכור. כאן, אנו משתמשים כור יחיד קאמרית עם הפניה אלקטרודה ~ 2-3 ס מ מן האלקטרודות עבודה. כמו כן, האלקטרודה מונה צריך להיות גדול יותר האלקטרודה לעבוד כדי להבטיח כי זה לא מגבילה במערכת.
    2. אם עובדים עם תרבות טהור, לעקר את הכור עם האלקטרודה מונה בפנים. לעקר את האלקטרודה הפניה מאת תטבול אקונומיקה במשך 10 דקות ובמים סטריליים יונים עבור 10 דקות לעקר את אידה על ידי שילוב של אקונומיקה 5 s ואחריו סטרילי מים יונים עבור 10 s לפני הכניסה לתוך הכור.
    3. למלא את סוללת אמצעי סטרילי מתאים biofilm צמיחה. לשימוש sulfurreducens ג17,18, למעט fumarate בינוני מים מתוקים. Biocathode MCL,9 להשתמש במי ים מלאכותי בינוני. 9
    4. להתחבר האלקטרודות bipotentiostat. להתחבר ההפניה מונה אלקטרודה אחת אידה להפניה העבודה 1, האלקטרודה אידה אחרים להפניה העבודה 2, האלקטרודה הפניה להפניה הפניה, האלקטרודה מונה.
  2. בדיקות אלקטרוכימי של IDAs.
    הערה: מטרתו העיקרית של בדיקה זו היא לוודא שתי אלקטרודות מבודד חשמלית. כל הטכניקות אלקטרוכימי זמינים בתוכנה המשמשת כדי לשלוט על bipotentiostat.
    1. לבצע בדיקות מוליכות (לפני biofilm הצמיחה) כדי להבטיח שימוש bipotentiostat לתפקוד תקין של אידה.
      1. מידת הפוטנציאל במעגל פתוח כל אלקטרודה עבור 1 דקות.
        הערה: על כמה מכשירים, מעגל פוטנציאליים חייב להיות מושגת על-ידי שימוש בתוכנית אוסף galvanostatic והגדרת הנוכחי ל- 0 אמא.
      2. מידת פוטנציאל מעגל אלקטרודה 2 בעת ביצוע וולטמטריה ציקלית על אלקטרודה 1 בין +0.2 V כדי +0.6 V (לעומת היא) ב mV 20/s.
        הערה: גבולות אחרים, המחירים סריקה עבור קורות חיים ניתן להשתמש במידת הצורך. עם זאת, יש להימנע פוטנציאל זה יביא בדור מימן או חמצן.
      3. ודא כי המעגל הפתוח פוטנציאליים נמדד באלקטרודה 2 לא מראה את הפוטנציאל של אלקטרודה 1 במהלך קורות חיים באמצעות התוכנה potentiostat.
        הערה: הפוטנציאל מעגל של אלקטרודה 2 עשוי להשתנות, אבל זה צריך להיות עצמאית של הפוטנציאל של אלקטרודה 1.
      4. חזור על שלבים 2.2.1.1 דרך 2.2.1.3 למעט פקד את הפוטנציאל של אלקטרודה 2 ולמדוד הפוטנציאל מעגל של אלקטרודה 1.
    2. הגדר את הפוטנציאל של אלקטרודות לעבוד פוטנציאל הצמיחה הרצוי של biofilm electroactive הרלוונטי באמצעות התוכנה bipotentiostat. לדוגמה, השתמש +0.5 V (לעומת היא) Geobacter sulfurreducens או +0.31 V (לעומת היא) עבור biocathode MCL.
  3. לגדול biofilm הרלוונטי electroactive
    1. לחסן את הכור אלקטרוכימי של תרבות מניות / העשרה של מיקרואורגניזמים electrochemically פעיל הרצוי באמצעות תקן טכניקות aseptic מיקרוביולוגית. לבדיקות תקן, לחסן ב- 1:20 יחס (inoculum כור אחסון) של יתר600 = 0.5 תרבות.
    2. הגדר את ערבוב לכור את הרמה הרצויה (~ 200 סל ד), בחממה / תנורים עד לטמפרטורה הרצויה בהתאם לתנאים צמיחה של biofilm עניין. Sulfurreducens ג, לשימוש של 30 מעלות צלזיוס לצמיחה אופטימלית.
    3. דגירה מערכת בהתבסס על דרישות ספציפיות של microorganism(s) עניין עד biofilm מגשרת על הפער בין שתי אלקטרודות. עבור נייחים biofilm sulfurreducens ג , תקופת דגירה של ~ 7-10 ימים. עבור biocathode MCL, דגירה ~ 7 ימים. בכל מקרה, לשלוט, הטמפרטורה של 30 ° C.

3. אלקטרוכימי ניסויים חסימה

  1. בחר את הפרמטרים ניסיוני שישמש כדי לקבוע את התלות הנוכחית-פוטנציאל למדידות המגביל.
    1. לקבוע את הטווח של פוטנציאל שער שיוחלו אידה להשיג הנוכחית מתנהל (ISD) לעומת שער עקום (EG) פוטנציאליים עבור המערכת.
      הערה: טווח פוטנציאל שער בחן אמור לכסות כל פוטנציאל עם פעילות אפשרית חמצון-חיזור. אם אין מידע על מערכת עניין זמין, מגוון רחב פוטנציאל להיות בשימוש (-0.55 כדי +0.6 V לעומת היא). ניתן להשתמש בגישה ניסוי וטעייה לחידוד הטווח מבוססת על מערכת שנבחנה. שער פוטנציאליים מוגדרת בתור:
      Equation 1
      כאשר ED הוא הפוטנציאל של האלקטרודה ניקוז ו ES הוא הפוטנציאל של האלקטרודה מקור. הטווח של שער פוטנציאל שימוש מוגבל בשל הדרישות ואת המגבלות של מערכת מסוימת של עניין. 18
      הערה: פוטנציאל ניקוז והמקור זה יביא באבולוציה חמצן ומימן יש להימנע ככל תהליכים אלו יכולים לגרום נזק biofilm.
    2. לקבוע את מתח המקור-ניקוז (VSD) שישמש ככוח המניע להעברה אלקטרון דרך הסרט ממקור לניקוז. מקור-ניקוז מתח מוגדרת בתור:
      Equation 2
      הערה: מתח המקור-ניקוז צריכה להיות מספיק קטן כדי. אניSD להרחבה מדרגית באופן ליניארי עם VSD. 17
    3. בחרו קצב סריקה (v) שבו EG השתנה באופן ליניארי עם הזמן שאינו תלוי אניSD כך ניתן לקרב את ערכיהן המערכת להיות במצב יציב עבור כל שער פוטנציאליים.
      הערה: קצב סריקה של פחות מ 0.002 V/s משמש לעיתים קרובות עבור מערכות ביולוגיות. 29 , 30
    4. להגדיר לתוכנה bipotentiostat כדי לבצע את המדידות חסימה (קרי לטאטא את השער פוטנציאליים) מעל הטווח הנבחר, את מתח המקור הנבחר-ניקוז, ובבית את קצב הסריקה הרצוי בהתבסס על השיקולים שלעיל.
      הערה: למדידות הקודם חסימה באמצעות ג sulfurreducens,17,19 EG =-0.55 V כדי 0.6 V (לעומת היא), VSD = 0.01 V או 0.1 V, v = 0.001 V/s. עבור Biocathode MCL, EG = 0.25 V ל 0.7 V (לעומת היא), VSD = 0.002 V, v = 0.0002 V/s.
      1. בנוסף, לבצע מדידה בסיסית עם VSD = 0.000 V (קרי, CV-כל אלקטרודה בודדים נלקח בו זמנית) ב- v באותו שבחרת בשלב 3.1.3.
    5. לבצע מדידות חסימה באמצעות תנאי 3.1.4 תחת מחזור שני (עם אלקטרון מסיסים התורמים או מקבל מתנה) בתנאים שאינם-מחזור (ללא תורם אלקטרון מסיסים או מקבל).
      הערה: מחזור ללא התנאים יתרון כי המידות הן אינו מוסתר על ידי חמצון או הפחתה של תרכובות מסיסים על חילוף החומרים הסלולר, למרות תוצאות דומות צריכה להתקבל ללא קשר תנאי משמש לאחר הפחתה רקע זרמי (מפורט ב 3.1.8).
      1. להשיג תנאים מחזור באמצעות המדיום הכור באותו המשמשים עבור התפתחות חיידקים על האלקטרודה. בינוני מכיל תורם אלקטרון מסיסים, כגון אצטט sulfurreducens ג,17 או מקבל, כגון חמצן Biocathode MCL.
      2. להשיג תנאים שאינם-מחזור על-ידי הפיכת המדיום הכור באותו המשמש עבור התפתחות חיידקים על האלקטרודה, למעט להשמיט את האלקטרונים מסיסים התורמים או מקבל. אחרי שתוודא כי potentiostat כבויה, להסיר את המדיום גילוח ורחיצה כירורגית ולהוסיף בינוני טריים ללא התורם אלקטרון מערכות אנודי או מקבל עבור מערכות cathodic. לחלופין, ניתן להגדיר מערכת זרימה רציפה לאט להחליף המדיום עם המדיום הרצוי עבור תנאים nonturnover.
        הערה: אם החמצן מקבל אלקטרון מסיסים (כפי biocathode MCL), sparge את המערכת עם תערובת של ~ 15% CO2 , 85% N2 (או תערובת גז על ה-pH נכונה של המדיום).
    6. לאחר סיומו של המדידות המגביל, להשתמש בתוכנה potentiostat כדי להגדיר את הפוטנציאל של כל אלקטרודה בחזרה אל הצמיחה הפוטנציאליים כדי לאפשר למערכת לייצב מחדש (באמצעות אותם ערכים כמו 2.2.2).
    7. אם מתקיימים כל התנאים המתוארים לעיל (אניSD היא עצמאית של v, שינוי קנה המידה באופן ליניארי עם VSD), להמיר אניSD ערכים מוליכות באמצעות המשוואות הבאות כמו שתואר לעיל31
      Equation 3
      Equation 4
    8. כאשר G הוא מוליכות ו- S היא גורם קנה המידה המערכת תלויה, ויש גורמים משתנים כגון גודל האלקטרודה, בגודל הפער biofilm גובה. במערכות מסוימות, S יכול להיקבע מתוך משוואות מראש. 31 . לחלופין, S ניתן לחשב נומרית באמצעות תוכנת מידול, כמפורט בעבר. 17
    9. להחסיר את הזרמים רקע כדי לזהות את הצורה ואת סדר הגודל של הזרם מתנהל. גם לחסר הנוכחי שנוצרו ב- VSD = 0.00 V מ הנוכחי שנוצרו ב- VSD = 0.01 V או להחסיר הניקוז הנוכחי מן המקור הנוכחי שנוצרו עם VSD = 0.01 נ' גם זרמים רקע מסיר על השיטה, את עוזבת רק הנוכחית מתנהל.
  2. מדידות המגביל אלקטרוכימי תלויה בטמפרטורה
    1. לקבוע את טווח הטמפרטורות עניין. טווח זה תלויה מאוד המערכת תחת מחקר, אולם מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים טמפרטורות אמור לשמש.
      הערה: מחקרים קודמים השתמשו טווח טמפרטורה של 10 ° C עד 30 מעלות צלזיוס ללמוד אלקטרון תחבורה בתנאים פיזיולוגית הרלוונטיים עבור מיקרואורגניזמים mesophilic. 17
    2. להשיג recirculating אמבט מים או חממה כדי לווסת את טמפרטורת, כור הבקרה כדי להבטיח כי קבע נקודה וטמפרטורה בפועל של המדיום הוא זהה.
      1. מקום של מד חום או צמד תרמי כור שליטה בו יהיה אידה.
    3. לעש מדידותSD (ראה 3.1.4) מעל טווח טמפרטורות הנבחר תחת מחזור ו- nonturnover (שמתואר בשלב 3.1.5) תנאי שימוש את bipotentiostat בעקבות באחת משתי הפרוצדורות המתוארות להלן.
      1. צור אניSD לעומת EG עקומות, כפי שתואר לעיל (ראה 3.1), עבור כל הטמפרטורה מעל טווח טמפרטורה ריבית. עבור חומרים כי התערוכה מוליכות חמצון-חיזור, כגון sulfurreducens ג ו Biocathode MCL, השיא הנוכחי של כל טמפרטורה משמשת כדי לקבוע אתSD לעומת תלות T.
        הערה: שיטה זו משמשת ליצירת מלא אניSD לעומת EG עקומת עבור כל טמפרטורה, אבל דורש יותר זמן מאשר האפשרות השנייה.
      2. לסירוגין, להגדיר והחזק את אידה בשער פוטנציאליים המניבה מקסימום שנערך הנוכחי באמצעות את bipotentiostat (המתקבל אניSD vs EG העקומה, שלב 3.1.4) ולהקליט המרבי הנוכחי מתנהל באמצעות את bipotentiostat תוך כדי הטמפרטורה יחזור לתקנו בין טווח טמפרטורות שנבחרו באמצעות הפקדים על הסיפון של תנורים או חממה.
        הערה: עם הגיאומטריה אלקטרודה/כור המשמש כאן, אניSD ו- T מותר לייצב כי לפחות 20 דקות ו ממוצע יציבה אניSD משמש בכל טמפרטורה. פחות או יותר הזמן מייצב עשוי להידרש המבוסס על מערכת מסוימת. שיטה זו מהירה יותר הראשון וגורם פחות מתח כדי biofilm. עם זאת, עקומות חסימה מלאה לא נוצרים.
      3. מחזור הטמפרטורה מנקודה קבוצה אחת לאחרת ובחזרה שוב באמצעות הפקדים על הסיפון של החממה או לאמבט מים כדי לקבוע את הפיכות התגובה להבטיח כי הטמפרטורה רכיבה על אופניים אינה פוגעת biofilm את.
    4. לאפס את הטמפרטורה בחזרה הטמפרטורה צמיחה רגיל באמצעות הפקדים על הסיפון של האמבטיה חממה או מים ומאפשרים למערכת כדי לייצב.
      הערה: עבור מנצח חמצון-חיזור, ליSD כנגד 1/T נתונים להיות מקום עם הביטוי קצב ארניוס, אשר מאפשר את החישוב של אנרגיית שפעול כדלקמן:
      Equation 5
      Equation 6
      איפה E הוא אנרגיית השפעול להעברת אלקטרון בין חמצון-חיזור סמוכים cofactors ו- k הוא קבוע בולצמן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IDAs היו קווית, מבודדים ולא נבדק כדי לוודא כי שתי אלקטרודות היו חשמלית מבודדים אחד מהשני (איור 1). הכורים היו מורכבים, מחוסן עם sulfurreducens ג, מודגרות עד ממבנה biofilm מגשרת על הפער בין האלקטרודות. Biofilm sulfurreducens ג ניתן לראות באופן חזותי כדי לסקר את המערך. Biofilms אחרים עשויים לדרוש החוקר לעשות מדידות המגביל אלקטרוכימי כדי לראות אם שתי אלקטרודות חשמלית מקושר. מיקרוסקופ צריך לשמש גם כדי לוודא חיבור בין האלקטרודות של המערך. ניסויים המגביל אלקטרוכימי בוצעו כדי לקבוע את התלות של אניSD EG (איור 2). המוליכות של הסרט חיים ואז מחושבת באמצעות הזרם מתנהל הנמדדים בניסויים חסימה. הדיוק ואת הדיוק של מדידות אלה היה גבוה בשל האות גבוה ליחס רעש, אפשרי עם התצורה אידה. התלות בטמפרטורה של אניSD T נקבע גם יחד עם הפעלת אנרגיה להעברה אלקטרון דרך biofilm (איור 2). התוצאות המתקבלות כאן דומות לאלו שנצפו בעבר17,18 , תומכים בהשערה כי biofilms MCL sulfurreducens ג ו biocathode מתנהגים באופן דומה כדי חמצון-חיזור מנצחים איפה אלקטרונים המועברים דרך biofilm ידי הקופצנית בין חמצון-חיזור cofactors קרוב בסמיכות.

Figure 1
איור 1: אידה להגדיר ולשלוט בדיקות אלקטרוכימי. (א) אידה קווית, מבודדים. שיבוץ: להגדיל תמונה של המערך מציג האלקטרודות interdigitated ואחד של הידיות אלקטרודה גדולים. אלקטרודות מונה והפניה נפרד ממוקמים בתא אלקטרוכימי יחד עם אידה ביצוע ניסויים. בדיקות הבקרה אלקטרוכימי (B) מפגין עצמאות חשמל של כל אלקטרודה. הפוטנציאל מעגל של אלקטרודה 2 אינו מגיב על הפוטנציאל המשתנים של אלקטרודה 1 במהלך CV, המציין כי האלקטרודות לא לקצר, ניתן להשתמש עבור biofilm gating מדידות. (ג) זהה B, אלא הפוטנציאל של אלקטרודה 2 משמרת במהלך קורות חיים אלקטרודה 1, המציין כי האלקטרודות לקצר, לא צריך לשמש עבור gating מדידות. אידה זו לא נעשה שימוש בניסויים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אלקטרוכימי gating ניסויים. (א) אלקטרוכימי gating מדידות של פרנסה, אלקטרודה גדל biofilm sulfurreducens ג . הפסגה בצורת אניSDעקומה -EG הוא מרמז על התחבורה אלקטרון לא ברורים, רב שלבי באמצעות biofilm. העקומה הנוכחית מתנהל הושג על-ידי חיסור מקור הניקוז הנוכחי (ואת החלוקה על ידי 2) להשיג על כל הפוטנציאל שער לחסל את רקע זרמים. לקבלת דוגמאות של נתונים גולמיים הנוכחי עם VSD = 0 ו- VSD = 0.01 V, הקורא מכונה מידע תמיכה של העבודות הקודמות. 18 (B) טמפרטורה התלויים gating measurementsover מגוון מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במסגרות עלייה המוליכות כמו הטמפרטורה הוא גדל, מאפיין נצפתה למנצחים חמצון-חיזור. 4 (ג) טרנספורמציה של הצבאSD – התאם משוואת ארניוס ונתונים T. התאם ליניארי משוואת ארניוס היא מעידה על תהליך העברת אלקטרונים רב שלבי. אנרגיית אלקטרון התחבורה באמצעות ממבנה biofilm ג sulfurreducens מחושבת על פי השיפוע של העיקול ~0.01 eV, אשר עולה בקנה אחד עם אלקטרון תחבורה בין מרכזי חמצון-חיזור של סמוכים c-הקלד cytochromes. 32 , 33 , 34 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במהלך התקנת אידה, חיוני לבדוק כי המקור וצינור הניקוז לא לקצר יחד לפני מדידות המגביל אלקטרוכימי, כמו זה תשנה אתSD לעומת עקומת EG יכול להוביל לתוצאות שגויות פרשנויות. חשוב גם לבחור VSD ו- v כך הנוכחי הוא באופן ליניארי תלויים VSD ועצמאית של v. אם זה לא המקרה, ואז המשוואות המתוארים לעיל לא יכול להיות מנוצל כדי לחשב את המוליכות.

לפחות שני זרמים רקע חייב להיות נחשב ומוסר מן המידות הנוכחית מתנהל. הראשון הוא הרקע הנוכחי עקב Faradaic טעינה/פריקת cofactors חמצון-חיזור הפוטנציאל שער נסחפת. על רקע זה הנוכחי מושפע מאד כמות חמצון-חיזור cofactors הנגישים חשמלית מחוברים אל פני השטח אלקטרודה. רקע השנייה הנוכחית היא קיבול שכבה כפולה. רקע השלישי הנוכחי הוא מחזור של אלקטרון מטבולית acceptors/תורמים על ידי התאים. על רקע זה הנוכחי ישימה רק בתנאים מחזור. רקע זרמי במחקר זה חוסלו על-ידי חיסור המקור הנוכחי הנוכחי ניקוז שהושג ב VSD = 0.01 V. שיטה זו מניח רקע זרמי אוויר שווים על שתי אלקטרודות מקור-ניקוז הזרמים שווים בערכם על שתי אלקטרודות, אך ההפך סימן. במקרה זה הפחתה הזרמים המקור, ניקוז התשואות כפול הנוכחית מתנהל וגדלה, יש לחלק שני. יצוין כי הנחה זו רק הפחד במגבלת של קטן VSD, אשר המערכת תלויה (עבור sulfurreducens ג, VSD< 0.05 V). ערכים גדולים יותר VSD לעיתים קרובות תוצאות בתנאים שונים על כל אלקטרודה ומונעת שיטה זו של חיסור רקע שימוש. לחלופין, רקע זרמי ניתן להסיר באמצעות הפחתה במקור ולנקז את זרמי שהושג ב VSD = 0.0 V מאלו שהושגו ב VSD = 0.01 V. שיטה זו אינה מניחה כי הזרמים הבסיסית של כל אלקטרודה זהים.

בטכניקה המתוארת כאן הוא גמיש. רוב שאר הפרמטרים המתוארים בפרוטוקול תלויים במערכת שנבחנה, יכולים להשתנות. עבור דוגמה, חומר הממדים של אידה יכולים להיות מגוונים, טווח טמפרטורות, ומגוון של פוטנציאל שער, בין פרמטרים אחרים, ניתן לשנות להתאים את הצרכים של המחקר הספציפי. עוד, תקן מיקרוביולוגית אלקטרוכימי וטכניקות מותאמים, שימוש, הפיכת פרוטוקול זה מתאים חוקרים ממגוון רחב של תחומי לימוד.

כאן תארנו פרוטוקול ללמוד אלקטרון התחבורה חי, אלקטרודה גדלה, biofilms electroactive באמצעות IDAs. IDAs שימשו בעבר כדי לאפיין תחבורה אלקטרון סרט דק ניצוח פולימרים, יכול להיות מפוברק באמצעות מגוון של אלקטרודה סטנדרטי החומרים והטכניקות photolithographic. 2 היתרון העיקרי של IDAs הוא האות גבוה רעש יחס עקב i) הפער זמן סרפנטין שמפריד את מקור מתחלפים ומסננים אלקטרודה להקות ו ii) אלקטרודה קטנה יחסית הכולל שטח הפנים ביחס לגודל הפער. הגיאומטריה אלקטרודה חשוב לשקול ב- gating מדידות בגלל הממדים אלקטרודה והפער יש השפעה גדולה על האות ליחס רעש ולכן על דיוק המדידות מוליכות גרם. 18

אלקטרוכימי gating ניסויים של התערוכה biofilms sulfurreducens ג חי, שגודלו אלקטרודה לשיא ברורה בצורת התלות של אניSD ב- EG, רומז כי האלקטרונים מועברים דרך biofilm ויה מבולבלת, צעד מרובת מקפצים, כמו פולימרים מוליכים חמצון-חיזור. 4 , 35 שיא מוליכות biofilm sulfurreducens ג נמצאה להיות ~ 4 µS/cm, מסכים עם תוצאות קודמות שנוצרו תנאים דומים. 17 עוד יותר, השער פוטנציאליים עבור שיא מוליכות דומה לנקודת האמצע פוטנציאליים שנצפו sulfurreducens ג biofilms במהלך מחזור CV.17 זה גם נצפתה קודם לכן, הוא שמהווה אומר כי זהה אלקטרון נשאים בשימוש על ידי התאים להובלת אלקטרונים הנובע אצטט חילוף החומרים משמשים גם כדי לבצע תשלום של האלקטרודה מקור האלקטרודה ניקוז דרך biofilm. אחרים dependences של אניSD ב- EG, כגון נצפו בחומרים שונים, מציע מנגנון שונה של העברת אלקטרונים. לדוגמה, אניSD לעומת EG . עיקול פולימר poly(methylthiophene) מציגה את מעגל בצורת s ומציעה מתכתי דמוי אלקטרון הולכה. 36 , 37

התלות בטמפרטורה של זרם מתנהל הוא פרמטר קריטי בקביעת המנגנון של אלקטרון התחבורה באמצעות חומרים מוליכי חשמל. עד לאחרונה, היה בשימוש רק באתרו לשעבר דגימות לחקור את התלות בטמפרטורה של זרם מתנהל דרך ממבנה biofilm. 22 תוצאות אחרונות שהוצגו כאן ושם17 מתקבל שונה אניSD – תלות T באמצעות מדידות חסימה ולכן לחזות צעד מרובת מבולבלת hopping מנגנון התחבורה אלקטרון דרך G... sulfurreducens biofilms, השונה המנגנון המוצע בעבר. 22

המגבלה העיקרית של טכניקה זו וגיאומטריה דומים אחרים בעת הערכת אלקטרון התחבורה באמצעות ממבנה biofilm מיקרוביאלי הוא הזרם עובר רוחבית בין האלקטרודות המקור, ניקוז להציב אותו מישור על משטח שטוח. הזרימה הטבעית של אלקטרונים biofilm, אולם הוא בניצב למשטח אלקטרודה. באמצעות טכניקה זו, מודל, אנו משוער של biofilm כמו סרט הומוגנית, לחקור את זרימת אלקטרונים דרך רק על חלק biofilm. אימות ניסיוני של הטרוגניות המרחבי של biofilm הוא עדיין צורך לתת תוקף נוסף בטכניקה זו. עם זאת, כמתואר לעיל, שיטה זו מאפשרת מדידות באתרו עם האות הגבוה ביותר ליחס רעש, זמין עד כה. טכניקה זו ניתן ללמוד תשלום הובלה של כל חומר שהוא מסוגל לקיים אינטראקציה עם אלקטרודה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

M.D.Y, S.M.G-ס ו L.M.T. לאשר למשרד של חיל הים המחקר (פרס #N0001415WX01038 ו- N0001415WX00195), מעבדת המחקר של הצי הימי מעבדות ננוטכנולוגיה מכון המחקר; M.Y.E.-ש הוא נתמך על ידי ארה ב המחלקה של אנרגיה גרנט דה-FG02-13ER16415.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Tags

כימיה גיליון 136 אלקטרוכימיה חיידקים חיידקים Electrosynthesis מוליכות Biofilm תחבורה אלקטרון חוץ-תאית סרט דק Gating אלקטרוכימי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, M., Strycharz-Glaven, S.,More

Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter