Summary
Un protocollo per la misurazione di conduttività elettrica di biofilm microbici viventi in condizioni fisiologicamente rilevanti è presentato.
Abstract
Qui dimostriamo che il metodo di gating elettrochimico utilizzato per caratterizzare la conduttività elettrica di biofilm microbici elettrodo-coltivate in condizioni fisiologicamente rilevanti. 1 queste misurazioni vengono eseguite su biofilm vivente in mezzo acquoso utilizzando origine e scarico elettrodi modellati su una superficie di vetro in una configurazione specializzata indicata come un array di elettrodi interdigitating (IDA). Un biofilm è coltivato che si estende attraverso il gap che collega la fonte e scolo. I potenziali sono applicati agli elettrodi (ES ed ED) generando una corrente di fonte-scarico (ISD) attraverso il biofilm tra gli elettrodi. La dipendenza della conducibilità elettrica sul potenziale del cancello (la media delle potenzialità di source e drain, EG = [ED + ES] / 2) è determinata sistematicamente cambiando il cancello potenziale e misurando il conseguente drenaggio di origine corrente. La dipendenza della conducibilità sul cancello potenziale fornisce meccanicistici informazioni sul processo di trasporto extracellulare dell'elettrone sottostante la conduttività elettrica del biofilm specifico sotto inchiesta. Il metodo di misurazione gating elettrochimico qui descritto si basa direttamente su quello utilizzato dal M. S. Wrighton2,3 e colleghi e R. W. Murray4,5,6 e colleghi in il 1980 è indagare su polimeri conduttivi a film sottile.
Introduction
Extracellulare di trasporto dell'elettrone (EET) è un processo che consente alcuni microrganismi per il trasporto di elettroni tra processi metabolici intracellulari e insolubile accettori o donatori che risiedono all'esterno della cella, che vanno da minerali naturali per elettrodi. In alcuni casi, EET consente microrganismi formare elettricamente conduttivo della multi-cellula spesse biofilm su superfici di elettrodo, in cui le cellule non a diretto contatto con l'elettrodo possono utilizzare ancora come un ricettore dell'elettrone metabolica o donatore. C'è un notevole interesse in tali biofilm come catalizzatori di elettrodo per varie applicazioni, come elettrosintesi microbica, rilevamento/rimozione di contaminanti e generazione di energia a distanza e stoccaggio,7,8,9 ,10,11,12,13,14 a causa della diversità dei processi metabolici, eseguita da microrganismi e la durevolezza di biofilm microbici rispetto a base di enzima bioelettrodi. 15 , 16 inoltre, EET vie possono potenzialmente essere utilizzate per modifiche elettricamente controllo o segnale di naturali o geneticamente microbici processi metabolici coinvolti, ad esempio, nella produzione di un prodotto desiderato o rilevamento di un analita o stimolo. La conduttività elettrica di elettrocatalitica biofilm, che li distingue da altri materiali biologici, è un aspetto centrale della loro proprietà elettrocatalitiche, ancora poco è capito circa il processo di EET fondo nell'ambiente dell'elettrodo, e ciò che è noto è fortemente contestata. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24
Qui descritto è un metodo di 2 elettrodi per misurare la conducibilità attraverso biofilm living, elettrodo-coltivate utilizzando matrici interdigitating elettrodo (IDAs). IDAs consistono di elettrodi rettangolari paralleli modellati sulla superficie di vetro piano in modo tale che ogni altra band è collegata ai lati opposti della matrice risultante in 2 elettrodi (la fonte e scolo). L'esame attento di una IDA (Vedi ad esempio, la figura 6.12b di ref #1) rivela che il divario che separa le bande adiacenti è anche collegati in modo tale da formare un singolo spacco che intreccia avanti e indietro attraverso la matrice che separa i due elettrodi. Il risultato è un lungo e stretto che separa gli elettrodi di source e drain, ottenendo molto alta fonte-scarico correnti quando un materiale conduttivo è formato, il cast, polimerizzato o cresciuto (nel caso del tipo di biofilm considerato qui) la matrice. Inoltre, le piccole dimensioni degli elettrodi si traduce in piccolo sfondo corrente a causa della capacità di carica e di cambiare in stato di ossidazione del materiale conduttivo con cambio a cancello potenziale, poiché la quantità di materiale necessario per rendere la conducibilità le misurazioni con IDAs sono così piccole. La tecnica di base di IDA gating elettrochimico descritto qui, sviluppato per caratterizzare i polimeri conduttivi a film sottile,2,3,4,25 solo recentemente è stata applicata ai sistemi viventi. 18 un'altra tecnica utilizzata per misurare la conducibilità dei biofilm vivente utilizzato un grande formato split elettrodi di source e drain e metri di origine per impostare la porta potenziali. 26 , 27 tuttavia, preoccupazioni per questi metodi sono state dettagliate in precedenza. 18
Incapsula il protocollo qui sotto la nostra esperienza con effettuare accurate misure di conduttività del vivere biofilm MCL Geobacter sulfurreducens e biocathode. G. sulfurreducens è un elettrodo di modello riducendo l'organismo in grado di utilizzare materiali insolubili, compresi gli elettrodi, come il ricettore dell'elettrone metabolica suola. Inoltre, forma biofilm spesse che sono in grado di trasportare elettroni su più celle di lunghezza, che lo rende un organismo modello ideale per studiare il trasferimento di elettroni a distanza extracellulare anodica. Includiamo anche dettagli per lo studio della biocathode MCL, un biofilm aerobica, autotrofi comunità mista isolato dal catodo di una cella a combustibile microbica bentonico. Biocathode MCL (così chiamato per i tre costituenti primari – Marinobacter, Chromatiaceaea e Labrenzia) è in grado di ossidanti un elettrodo come suo unico elettrone donatore e trasporto di elettroni su più celle di lunghezza, rendendo ha un interessante sistema di catodico per studiare. Inoltre, biocathode MCL ha la più alta conducibilità segnalata per un sistema vivente fino ad oggi utilizzando questi metodi. L'inclusione di questi biofilm elettroattivi diversificata in questo protocollo è destinato per evidenziare che questa tecnica è applicabile al trasporto di elettroni attraverso qualsiasi biofilm vivente in grado di interagire elettricamente con elettrodi di misura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparazione di interdigitating microelettrodo matrice (IDA)
- Ottenere IDA commercialmente disponibile elettrodi modellati su un substrato non conduttivo o sintetizzarli utilizzando metodi standard litografici. 28
Nota: IDA dimensioni e/o materiali possono essere variate sulla base desiderate condizioni per diversi esperimenti. IDAs qui utilizzati sono stati ottenuti in commercio e consisteva di due interdigitating microelettrodo oro modellato su un substrato di vetro collegato ad elettrodi grandi alle estremità opposte della matrice. Gli elettrodi sono esposti mentre le linee di autobus collegamento degli elettrodi per le grandi pastiglie di contatto sono rivestite con materiale isolante sottile. IDAs utilizzati qui sono costituiti da due set di 10 bande di lunga oro microelettrodo µm-wide e 2 mm (source e drain) distanziati di 5 µm apart modellato su una superficie di vetro piano. IDAs utilizzato qui aveva 65 paia di elettrodi (130 totale interdigitating bande). Alternanza di fasce è collegati ad elettrodi alle estremità opposte della matrice. - Filo e isolare IDA
- Collegare un cavo per ogni pad elettrodo grande utilizzando resina epossidica conduttrice d'argento.
- Preparare la resina epossidica conduttrice secondo le istruzioni del produttore per la resina epossidica specifica in uso con una punta di asta o pipetta miscelazione (istruzioni possono variare dal produttore).
- Posizionare un filo su ogni pad oro, sicuro in posizione con del nastro di laboratorio. Coprire il filo e il pad con epossidica argento usando una punta di asta o pipetta di miscelazione.
- Muovere con cautela per un forno a 80 ° C per 1 h a cura o cura sulla base delle raccomandazioni del produttore per l'epossidica argento conduttiva specifica utilizzato.
- Dopo la resina epossidica cure, è possibile utilizzare un multimetro per garantire connettività elettrica tra la fine del filo e le pastiglie. La resistenza tra il filo e il tampone dovrebbe essere < 5 Ω. Inoltre, è possibile utilizzare il multimetro per verificare che nessun epossidico conduttivo è connessione elettrodi multipli, come questo può breve la matrice. Se la resina epossidica conduttrice è più cavi di collegamento, utilizzare un graffietto per isolare i cavi.
- Isolare la connessione epoxied rivestendo la connessione con una termica, elettrica e impermeabile materiale isolante. Ritardante di fiamma resine poliuretaniche sono spesso adatte.
- Rimuovere la punta di una provetta conica per centrifuga 15 mL (a circa il marchio di 2,5 mL) come uno stampo per il materiale isolante. Fare due piccoli fori nella parte inferiore per i cavi a sporgere attraverso l'utilizzo di un ago 21G.
- Inserire l'IDA il fili attraverso i fori nella parte inferiore della muffa e della muffa.
- Preparare il materiale isolante specifico. Seguire le istruzioni fornite con la resina specifica ottenuta.
- Pipettare l'isolante nello stampo in modo che la resina epossidica argento è completamente coperto (~2.5 mL) e lasciare per asciugare secondo le specifiche del produttore.
- Collegare un cavo per ogni pad elettrodo grande utilizzando resina epossidica conduttrice d'argento.
2. elettrochimica reattore installazione, collaudo e inoculazione
- Impostare la cella elettrochimica.
- Inserire la cella elettrochimica IDA, controelettrodo ed elettrodo di riferimento.
Nota: Il reattore elettrochimico utilizzato può variare notevolmente, fino a quando tutti gli elettrodi forma all'interno. Una considerazione è che l'elettrodo di riferimento dovrebbe essere più vicino possibile all'elettrodo di lavoro dato i limiti pratici del reattore. Qui, usiamo un reattore monocamera con il riferimento dell'elettrodo ~ 2-3 cm dagli elettrodi di lavoro. Inoltre, l'elettrodo contatore deve essere più grande l'elettrodo di lavoro per garantire che non è limitante nel sistema. - Se si lavora con una coltura pura, sterilizzare il reattore con il controelettrodo all'interno. Sterilizzare l'elettrodo di riferimento in ammollo nella candeggina per 10 min e acqua deionizzata sterile per 10 min. sterilizzare l'IDA mediante immersione in candeggina per 5 s seguita da acqua deionizzata sterile per 10 s prima dell'inserimento nel reattore.
- Riempire la cella elettrochimica con mezzo sterile adatto per la crescita di biofilm. Per g. sulfurreducens17,18, usare acqua dolce mezzo escluse fumarato. Per biocathode MCL,9 usare mezzo artificiale con acqua di mare. 9
- Collegare gli elettrodi di un bipotentiostat. Collegare un elettrodo di IDA al cavo del lavoro 1, l'altro elettrodo IDA al cavo del lavoro 2, l'elettrodo di riferimento per la Guida di riferimento e il controelettrodo al cavo del contatore.
- Inserire la cella elettrochimica IDA, controelettrodo ed elettrodo di riferimento.
-
Test elettrochimici di IDAs.
Nota: L'obiettivo principale di questo test è quello di assicurarsi che i due elettrodi sono separati galvanicamente. Tutte le tecniche elettrochimiche sono disponibili nel software utilizzato per controllare il bipotentiostat.- Eseguire test di conducibilità di controllo (prima crescita di biofilm) per garantire il corretto funzionamento di IDA utilizzando un bipotentiostat.
- Misura il potenziale del circuito aperto di ciascun elettrodo per 1 min.
Nota: Su alcuni strumenti, circuito aperto potenziale deve essere raggiunto utilizzando il programma di raccolta di galvanostatici e impostazione della corrente a 0 mA. - Misura il potenziale del circuito aperto di elettrodo 2 durante l'esecuzione di voltammetria ciclica sull'elettrodo 1 tra + 0,2 V a + 0,6 V (vs lei) a 20 mV/s.
Nota: Altri limiti e la frequenza delle analisi per CV può essere utilizzato se lo si desidera. Tuttavia, evitare potenziali che comporterà la generazione di idrogeno o ossigeno. - Verificare che il circuito aperto potenziali misurato a elettrodo 2 non rispecchiano il potenziale dell'elettrodo 1 durante il CV usando il software potenziostato.
Nota: Il potenziale del circuito aperto di elettrodo 2 può cambiare, ma dovrebbe essere indipendente del potenziale di elettrodo 1. - Ripetere i passaggi da 2.2.1.1 attraverso 2.2.1.3 tranne controllo il potenziale di elettrodo 2 e misura il potenziale del circuito aperto dell'elettrodo 1.
- Misura il potenziale del circuito aperto di ciascun elettrodo per 1 min.
- Impostare il potenziale di elettrodi di lavoro il potenziale di crescita desiderata del biofilm elettroattivi pertinenti utilizzando il software bipotentiostat. Ad esempio, è possibile utilizzare + 0.5 V (vs lei) per Geobacter sulfurreducens o +0.31 V (vs lei) per biocathode MCL.
- Eseguire test di conducibilità di controllo (prima crescita di biofilm) per garantire il corretto funzionamento di IDA utilizzando un bipotentiostat.
- Crescere pertinenti elettroattivi biofilm
- Inoculare il reattore elettrochimico da un magazzino cultura/arricchimento dei microrganismi elettrochimicamente attivi desiderati utilizzando le tecniche microbiologiche asettiche standard. Per prove standard, inoculare in un 01:20 rapporto (inoculo al volume del reattore) di un OD600 = 0,5 cultura.
- Impostare l'agitazione nel reattore al livello desiderato (~ 200 giri/min) e l'incubatore / bagno di acqua alla temperatura desiderata in base alle condizioni di crescita del biofilm di interesse. Per g. sulfurreducens, utilizzare 30 ° C per una crescita ottimale.
- Incubare il sistema in base a specifici requisiti di microorganism(s) di interesse finché il biofilm colma il divario che separa i due elettrodi. Per stazionario biofilm g. sulfurreducens , incubare per ~ 7-10 giorni. Per biocathode MCL, incubare ~ 7 giorni. In ogni caso, controllare la temperatura a 30 ° C.
3. elettrochimici esperimenti gating
- Selezionare i parametri sperimentali che verranno utilizzati per determinare la dipendenza di corrente-potenziale per le misurazioni di Gate.
- Determinare la portata dei potenziali di cancello che verrà applicato per l'IDA per ottenere la corrente condotta (ISD) contro curva (EG) potenziale di cancello per il sistema.
Nota: La gamma dei potenziali cancello esaminato dovrebbe coprire tutti i potenziali con attività redox possibile. Se nessuna informazione circa il sistema di interesse è disponibile, una gamma ampia potenziale dovrebbe essere usato (-da 0,55 a + 0,6 V vs lei). Un approccio di prova ed errore può essere utilizzato per mettere a punto la gamma basata sul sistema oggetto di studio. Cancello di potenziale è definita come:
dove ED è il potenziale dell'elettrodo scarico ed ES è il potenziale dell'elettrodo di origine. La gamma dei potenziali cancello utilizzato è vincolata dai requisiti e limitazioni del sistema specifico di interesse. 18
Nota: Source e drain potenziali che si tradurrà in evoluzione di ossigeno e idrogeno dovrebbero essere evitati come questi processi possono danneggiare il biofilm. - Determinare la tensione di fonte-drain (VSD) che verrà utilizzata come forza motrice per trasporto di elettroni attraverso la pellicola dall'origine allo scarico. Tensione drain-source è definito come:
Nota: La tensione di fonte-scarico deve essere sufficientemente piccola affinché ISD scalabilità lineare con VSD. 17 - Scegliere una velocità di scansione (v) a cui EG viene modificato linearmente con il tempo che è indipendente iSD in modo che il sistema può essere approssimato per essere allo stato stazionario per ogni cancello potenziale.
Nota: Una velocità di scansione di inferiore a 0,002 V/s viene spesso utilizzata per sistemi biologici. 29 , 30 - Impostare il software bipotentiostat per eseguire le misurazioni Gate (cioè spazzare il cancello potenziali) sopra l'intervallo selezionato, alla tensione selezionato origine-scarico e alla velocità di scansione desiderata basato sulle considerazioni di cui sopra.
Nota: per le misurazioni Gate precedente con g. sulfurreducens,17,19 EG =-da 0,55 V a 0,6 V (vs lei), VSD = 0.01 V o 0,1 V, v = 0.001 V/s. Per Biocathode MCL, EG = 0.25 V a 0.7 V (vs lei), VSD = 0,002 V, v = 0.0002 V/s.- Inoltre, eseguire una misurazione di base con VSD = 0.000 V (cioè, un CV a ciascun elettrodo individuo effettuato simultaneamente) al v stesso scelto nel passaggio 3.1.3.
- Eseguire misurazioni Gate utilizzando le condizioni in 3.1.4 sotto entrambi fatturato (con donatore dell'elettrone solubile o accettore presente) e non-fatturato (senza solubile elettrone donatore o accettore).
Nota: Non fatturato condizioni sono vantaggiose perché misurazioni non disturbino l'ossidazione o la riduzione dei composti solubili per il metabolismo cellulare, anche se risultati simili dovrebbero essere ottenuti indipendentemente da quale condizione viene utilizzata dopo sottraendo le correnti di fondo (dettagliate in 3.1.8).- Ottenere condizioni di fatturato utilizzando lo stesso mezzo di reattore come quello usato per la crescita batterica sull'elettrodo. Questa sostanza contiene un donatore di elettroni solubili, quali acetato per g. sulfurreducens,17 o accettore, come l'ossigeno per Biocathode MCL.
- Ottenere condizioni di non-fatturato facendo lo stesso mezzo di reattore utilizzato per la crescita batterica sull'elettrodo, salvo omettere il donatore dell'elettrone solubile o accettore. Dopo aver verificato che il potenziostato è spento, rimuovere asetticamente il mezzo e aggiungere in mezzo fresco senza il donatore dell'elettrone per sistemi anodiche o accettore per sistemi catodica. In alternativa, può istituire un sistema a flusso continuo per sostituire lentamente il mezzo con il mezzo desiderato per nonturnover condizioni.
Nota: Se l'ossigeno è l'accettore di elettroni solubile (per quanto riguarda biocathode MCL), sparge il sistema con una miscela di ~ 15% CO2 e 85% N2 (o una miscela di gas che manterrà il pH corretto nel mezzo).
- Dopo il completamento delle misurazioni Gate, è possibile utilizzare il software potenziostato per impostare il potenziale di ciascun elettrodo torna alla crescita potenziale per consentire al sistema di ri-stabilizzare (utilizzando gli stessi valori 2.2.2).
- Se sono soddisfatte tutte le condizioni sopra descritte (ISD è indipendente di v e scalabilità lineare con VSD), convertire I valoriSD conducibilità utilizzando le seguenti equazioni come descritto in precedenza31
- dove G è la conduttanza e S è un fattore di scala che dipende dal sistema e fattori variabili come la dimensione degli elettrodi, spaziatura e altezza del biofilm. Per alcuni sistemi, S può essere determinato dalle equazioni predeterminati. 31 in alternativa, S può essere calcolata numericamente utilizzando un software di modellazione, come descritto in precedenza. 17
- Sottrarre le correnti di fondo per identificare la forma e la grandezza della condotta corrente. O sottrarre la corrente generata a VSD = 0.00 V dalla corrente generata a VSD = 0,01 V o sottrarre lo scolo corrente dall'origine corrente generato con una VSD = 0,01 V. entrambi metodo rimuove correnti di fondo, lasciando solo l'attuale condotta.
- Determinare la portata dei potenziali di cancello che verrà applicato per l'IDA per ottenere la corrente condotta (ISD) contro curva (EG) potenziale di cancello per il sistema.
- Misure di gating elettrochimiche dipendente dalla temperatura
- Determinare l'intervallo di temperature di interesse. Questa gamma è altamente dipende dal sistema in fase di studio, tuttavia fisiologicamente rilevanti temperature devono essere utilizzate.
Nota: Gli studi precedenti hanno usato una gamma di temperatura di 10 ° C a 30 ° C per lo studio di trasporto dell'elettrone in condizioni fisiologicamente rilevanti per i microrganismi mesofili. 17 - Ottenere un ricircolo bagnomaria o dall'incubatore per regolare la temperatura del reattore e un reattore di controllo per garantire che il set point e la temperatura effettiva del mezzo è lo stesso.
- Inserire un termometro o la termocoppia in un reattore di controllo dove sarebbe l'IDA.
- Io fare misurazioni diSD (vedere 3.1.4) sopra la gamma di temperature selezionate sotto fatturato e nonturnover (descritto al punto 3.1.5) condizioni utilizzando il bipotentiostat seguendo una delle due procedure descritte di seguito.
- Generare ISD contro le curve EG , come descritto in precedenza (Vedi 3.1), per ogni temperatura sopra la gamma di temperature di interesse. Per i materiali che esibiscono conducibilità redox, come g. sulfurreducens e Biocathode MCL, la corrente di picco da ogni temperatura viene utilizzato per determinare ISD vs dipendenza da T.
Nota: Questo metodo è utilizzato per generare un completo hoSD vs EG curva per ogni temperatura, ma richiede più tempo che la seconda opzione. - In alternativa, impostare e tenere premuto l'IDA al cancello potenziale che produce massimo condotto corrente utilizzando il bipotentiostat (ottenuti da ISD curva di vs EG , punto 3.1.4) e registrare la massima corrente condotta utilizzando il bipotentiostat mentre la temperatura è in bici tra la gamma di temperature selezionato mediante i comandi a bordo del bagnomaria o dall'incubatore.
Nota: con la geometria dell'elettrodo/reattore utilizzata qui, ISD e T sono autorizzati a stabilizzare per almeno 20 min e una media stabile hoSD viene utilizzato per ogni temperatura. Più o meno tempo di stabilizzazione può essere richiesto sulla base del sistema specifico. Questo metodo è più veloce rispetto alla prima e provoca meno stress per il biofilm. Tuttavia, non vengono generate curve piene di Gate. - La temperatura del ciclo da un set point a altro e viceversa utilizzando nuovamente i controlli a bordo di incubatore o bagnomaria per determinare la reversibilità della reazione per garantire che la temperatura in bicicletta non danneggia il biofilm.
- Generare ISD contro le curve EG , come descritto in precedenza (Vedi 3.1), per ogni temperatura sopra la gamma di temperature di interesse. Per i materiali che esibiscono conducibilità redox, come g. sulfurreducens e Biocathode MCL, la corrente di picco da ogni temperatura viene utilizzato per determinare ISD vs dipendenza da T.
- Ripristinare la temperatura la temperatura di crescita normale utilizzando i controlli a bordo dell'incubatore o bagnomaria e consentire al sistema di stabilizzare.
Nota: Per un conduttore di redox, laSD rispetto a dati di 1/T posso essere misura con l'espressione tasso di Arrhenius, che permette il calcolo dell'energia di attivazione come segue:
dove Euna è l'energia di attivazione per il trasferimento di elettroni tra cofattori redox adiacente e k è la costante di Boltzmann.
- Determinare l'intervallo di temperature di interesse. Questa gamma è altamente dipende dal sistema in fase di studio, tuttavia fisiologicamente rilevanti temperature devono essere utilizzate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IDAs erano cablata, isolate e testate per garantire che i due elettrodi erano elettricamente isolati da altro (Figura 1). Reattori sono stati assemblati, inoculati con g. sulfurreducense incubate fino a quando un biofilm colmato il divario tra gli elettrodi. Il biofilm di g. sulfurreducens può essere visto visivamente per coprire la matrice. Altri biofilm possono richiedere al ricercatore di fare un gating misure elettrochimiche per vedere se i due elettrodi sono collegati elettricamente. La microscopia dovrebbe essere utilizzata anche per verificare la connessione tra i due elettrodi della matrice. Elettrochimici gating esperimenti sono stati effettuati per determinare la dipendenza di ISD EG (Figura 2). La conducibilità del film vivente viene quindi calcolata utilizzando il condotta corrente misurata negli esperimenti gating. La precisione e l'accuratezza di queste misurazioni è stato elevato a causa l'elevato rapporto segnale-rumore possibile con la configurazione di IDA. La dipendenza di temperatura di ISD su T inoltre è stata determinata insieme a un'energia di attivazione per il trasporto di elettroni attraverso il biofilm (Figura 2). I risultati ottenuti qui sono simili a quelli osservati in precedenza17,18 e sostengono l'ipotesi che i biofilm MCL g. sulfurreducens e biocathode si comportano allo stesso modo ai conduttori di redox dove gli elettroni sono trasferito attraverso il biofilm saltando tra cofattori redox nelle vicinanze nelle vicinanze.
Figura 1: IDA impostare e controllare le prove elettrochimiche. (A) una IDA che è stata cablata e isolata. Inserto: Ingrandimento immagine della matrice mostrando gli elettrodi interdigitating e fra gli elettrodi grandi. Elettrodi di riferimento e contatore separati vengono inseriti nella cella elettrochimica insieme a IDA per eseguire esperimenti. (B) prove di controllo elettrochimico che esibiscono l'indipendenza elettrica di ogni elettrodo. Il potenziale del circuito aperto di elettrodo 2 non risponde al cambiamento potenziale di elettrodo 1 durante CV, che indica che gli elettrodi non sono in corto e possono essere utilizzati per biofilm gating misurazioni. (C) uguale a B, tranne il potenziale di elettrodo 2 shift durante il CV dell'elettrodo 1, che indica che gli elettrodi sono in corto e non devono essere utilizzati per misure di gating. Questa IDA non è stata utilizzata in ulteriori esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: elettrochimica gating esperimenti. (A) elettrochimica gating misurazioni di un vivente, elettrodo cresciuta g. sulfurreducens biofilm. Il picco sono a forma diSD-EG curva è indicativo di trasporto dell'elettrone incoerente, multi-passaggio attraverso il biofilm. L'attuale curva dei condotta è stata ottenuta sottraendo l'origine dallo scarico attuale (e dividendo per 2) ottenuto a ogni potenziale del cancello per eliminare le correnti di fondo. Per esempi di dati correnti raw scattati con VSD = 0 e VSD = 0,01 V, si rinvia alle informazioni di supporto del lavoro precedente. 18 (B) temperatura dipendente gating measurementsover una gamma fisiologicamente rilevante che esibiscono un aumento della conduttività, come la temperatura è aumentata, una proprietà osservata per conduttori di redox. 4 (C) trasformazione dellaSD – I dati di T e vestibilità per l'equazione di Arrhenius. La vestibilità lineare dell'equazione di Arrhenius è indicativa di un processo di trasferimento dell'elettrone multi-step. L'energia di attivazione per il trasporto di elettroni attraverso un biofilm di g. sulfurreducens viene calcolata dalla pendenza della curva per essere ~0.01 eV, che è coerente con il trasporto degli elettroni tra centri redox di adiacente c-tipo citocromi. 32 , 33 , 34 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Durante l'installazione di IDA, è fondamentale per verificare che l'origine e lo scarico non sono corto insieme prima misure elettrochimiche di Gate, come questo altererà ISD vs curva EG e potrebbe portare a interpretazioni e risultati errati. È anche fondamentale per selezionare VSD e v tale che la corrente è linearmente dipendente da VSD e indipendente di v. Se questo non è il caso, le equazioni descritte sopra non possono essere utilizzate per calcolare la conduttività.
Almeno due correnti di fondo devono essere considerate e rimosso da condotte misure di corrente. Il primo è corrente a causa di carica/Scarica faradica dei cofattori redox di fondo come il potenziale del cancello è spazzato. Questa corrente di fondo è fortemente influenzata dalla quantità di cofattori che sono accessibili elettricamente collegati alla superficie dell'elettrodo redox. Una seconda corrente di fondo è capacità di doppio strato. Una terza corrente di fondo è a causa di fatturato di gettoniere/donatori di elettroni metabolica dalle cellule. Questa corrente di fondo vale solo in condizioni di fatturato. Correnti di fondo in questo studio sono state eliminate sottraendo la fonte corrente dal consumo di corrente ottenuto a VSD = 0,01 V. Questo metodo presuppone che correnti di fondo sono uguali in entrambi gli elettrodi e fonte-scarico correnti sono uguali in grandezza a entrambi gli elettrodi, ma di segno opposto. In questo caso sottraendo le correnti di source e drain produce un doppio condotto corrente in grandezza e dovrebbe essere diviso per due. Va notato che questo presupposto solo vale nel limite di un piccolo VSD, che è dipendente dal sistema (per g. sulfurreducens, VSD< 0.05 V). Valori di VSD più grandi spesso si traduce in circostanze disparate su ciascun elettrodo e previene questo metodo di sottrazione di sfondo venga utilizzato. In alternativa, correnti di fondo può essere rimosso sottraendo fonte e scolo correnti ottenute a VSD = 0.0 V da quelli ottenuti a VSD = 0,01 V. Questo metodo non si assume che le correnti di linea di base di ogni elettrodo sono gli stessi.
La tecnica qui descritta è flessibile. La maggior parte dei parametri descritti nel protocollo sono dipenda dal sistema in fase di studio e può essere modificata. Per esempio, il materiale e le dimensioni della IDA possono essere variati, la gamma di temperature e la gamma delle potenzialità di cancello, tra altri parametri, può essere modificati per soddisfare le esigenze dello studio specifico. Tecniche microbiologiche ed elettrochimiche ulteriore, standard sono adattate e utilizzati, rendendo questo protocollo adatto a ricercatori provenienti da una varietà di campi di studio.
Qui abbiamo descritto un protocollo per lo studio di trasporto dell'elettrone nella vita, elettrodo cresciuta, biofilm elettroattivi utilizzando IDAs. IDAs sono state utilizzate in precedenza per la caratterizzazione di trasporto dell'elettrone in film sottile polimeri conduttori e può essere fabbricata usando una varietà di materiali di elettrodo standard e tecniche fotolitografiche. 2 il vantaggio primario di IDAs è l'alto segnale rumore rapporto dovuto i) il lunga serpentino divario che separa la fonte alternata e bande di elettrodo e ii) l'area della superficie dell'elettrodo totale relativamente piccola rispetto alle dimensioni del divario di scarico. La geometria dell'elettrodo è importante considerare in gating misure perché le dimensioni dell'elettrodo e gap hanno un grande effetto sul segnale / rumore e quindi sulla precisione delle misurazioni di conducibilità effettuate. 18
Elettrochimico gating esperimenti di living, elettrodo-grown g. sulfurreducens biofilm Mostra un picco chiaro a forma di dipendenza di ISD su EG, suggerendo che gli elettroni sono trasportati attraverso il biofilm via incoerente, Multi-passo saltellando, come polimeri conduttivi redox. 4 , 35 la conducibilità di picco del biofilm g. sulfurreducens è stata trovata per essere ~ 4 µS/cm, in accordo con precedenti risultati ottenuti in condizioni simili. 17 ulteriormente, il cancello potenziale per conducibilità di picco è simile al potenziale punto medio osservato per g. sulfurreducens biofilm durante fatturato CV.17 questo inoltre è stato osservato in precedenza ed è postulato per dire che lo stesso trasportatori di elettroni utilizzati dalle cellule per il trasporto di elettroni derivante dal metabolismo di acetato sono utilizzati anche per trasportare carica dall'elettrodo di fonte a un elettrodo di scarico attraverso il biofilm. Altre dipendenze di ISD EG, come sono stati osservati in diversi materiali e suggerire un diverso meccanismo di trasferimento di elettroni. Ad esempio, laSD vs EG curva di poly(methylthiophene) il polimero Mostra una curva a forma di s e suggerisce di conduzione dell'elettrone metallico-come. 36 , 37
La dipendenza dalla temperatura della condotta corrente è un parametro critico nel determinare il meccanismo di trasporto dell'elettrone attraverso i materiali conduttori. Fino a poco tempo, solo i campioni ex situ erano stati utilizzati per studiare la dipendenza di temperatura della corrente condotto attraverso un biofilm. 22 risultati recenti presentati qui e altrove17 ottengono un diverso hoSD – dipendenza T utilizzando misurazioni gating e quindi prevedere un meccanismo di luppolizzazione multi-step, incoerente di trasporto dell'elettrone attraverso G. sulfurreducens biofilm, che è diverso da un meccanismo precedentemente proposto. 22
La limitazione principale di questa tecnica e altre geometrie simili durante la valutazione di trasporto dell'elettrone attraverso un biofilm microbico è che la carica si muove lateralmente tra la fonte e scolo elettrodi posizionati sullo stesso piano su una superficie piana. Il naturale flusso di elettroni attraverso il biofilm, tuttavia, è perpendicolare alla superficie dell'elettrodo. Utilizzando questa tecnica e modello, abbiamo approssimare il biofilm come un film omogeneo e interrogare il flusso di elettroni attraverso solo una porzione del biofilm. Validazione sperimentale dell'eterogeneità spaziale del biofilm è ancora necessario per convalidare ulteriormente questa tecnica. Tuttavia, come descritto in precedenza, questo metodo consente misurazioni in situ con il più alto rapporto segnale-rumore ad oggi disponibile. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la carica trasporto di qualsiasi materiale che è in grado di interagire con un elettrodo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
M.D.Y, S.M.G-S. e LMT riconosce l'Office of Naval Research (premio #N0001415WX01038 e N0001415WX00195), il laboratorio di ricerca navale e l'Istituto di Nanoscienze di laboratorio di ricerca navale; M.Y.E.-N. è supportato da l'US Dipartimento di energia Grant DE-FG02-13ER16415.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IDAs | CH Instruments | 012125 | Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments |
| Wire | Digikey | W7-ND | |
| Conductive silver epoxy | Electron microscopy sciences | 12670-EE | |
| Insulating material | 3M | 2131-B | Scotchast flame retardant compound |
| 15 mL conical centrifuge tube | VWR | 89004-368 | |
| 21g needle | VWR | BD-305165 | |
| 5 mL pipette tips | VWR | 82018-842 | |
| 5 mL pipettor | VWR | 89079-976 | |
| Freshwater medium components | Sigma Aldrich | All standard laboratory chemicals | |
| Ammonium chloride | |||
| Sodium phosphate monobasic | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| Artificial seawater medium components | Sigma Aldrich | All standard laboratory chemicals | |
| Sodium chloride | |||
| Magnesium chloride hexahydrate | |||
| Magnesium sulfate heptahydrate | |||
| Potassium chloride | |||
| Sodium bicarbonate | |||
| Calcium chloride dihydrate | |||
| Ammonium chloride | |||
| Potassium phosphate dibasic | |||
| Ag/AgCl reference electrode | Basi | MF-2079 | |
| Graphite rod counter electrode | Electron microscopy sciences | 70230 | |
| Recirculating water bath | Thermo Scientific | 152-5256 | |
| Bipotentiostat | Pine Instruments | WD-20 | http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user |
| Stir bars | VWR | 58947-114 | |
| G. sulfurreducens culture | ATCC | 51573 | |
| Jacketed reactor | Pine Instruments | RRPG085 |
References
- Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
- Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
- Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
- Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
- Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
- Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
- Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
- Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
- Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
- Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
- Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
- Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
- Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
- Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
- Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
- Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
- Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
- Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
- Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
- Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
- Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
- Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
- Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
- Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
- Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
- Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
- Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
- Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
- Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
- Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
- Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
- Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
- El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
- Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
- Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
- Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
- Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).
