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Chemistry

Charakterisierung von Elektronentransport durch lebende Biofilme

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 4, 5, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

Summary

Ein Protokoll zur Messung der elektrischen Leitfähigkeit von lebenden mikrobielle Biofilme unter physiologisch relevanten Bedingungen wird vorgestellt.

Abstract

Hier zeigen wir die Methode der elektrochemischen gating verwendet, um elektrische Leitfähigkeit der Elektrode angebautes mikrobielle Biofilme unter physiologisch relevanten Bedingungen zu charakterisieren. 1 diese Messungen werden durchgeführt auf lebende Biofilmen im wässrigen Medium mit Quelle und abtropfen lassen Elektroden gemustert auf einer Glasoberfläche in einer speziellen Konfiguration als Array die Elektrode (IDA) bezeichnet. Ein Biofilm wird angebaut, die durch die Lücke zwischen Source und Drain erstreckt. Potentiale gelten für die Elektroden (ES und E-D) erzeugen einen Source-Drain-Strom (ISD) durch den Biofilm zwischen den Elektroden. Die Abhängigkeit der elektrischen Leitfähigkeit auf Tor Potenzial (der Durchschnitt der Source und Drain Potenziale, EG = [ED + ES] / 2) ergibt sich aus systematisch verändert das Tor potenzielle und Messung der resultierenden Source-Drain aktuelle. Die Abhängigkeit der Leitfähigkeit auf Tor potenzielle informiert mechanistischen über den extrazellulären Elektronentransport-Prozess zugrunde liegt die elektrische Leitfähigkeit des spezifischen Biofilms untersucht. Die elektrochemische gating Messmethode, die hier beschriebenen basiert direkt auf, die von M. S. Wrighton2,3 und Kollegen und Kolleginnen und Kollegen im R. W. Murray4,5,6 verwendet die 1980's, um Dünnschicht-leitfähige Polymere zu untersuchen.

Introduction

Extrazelluläre Elektronentransport (EET) ist ein Prozess, der bestimmte Mikroorganismen ermöglicht zu transportieren Elektronen zwischen intrazellulären Stoffwechselprozessen und unlöslichen Elektronen Akzeptoren oder Spender, die sich außerhalb der Zelle, von natürlichen Mineralien, bis hin zu befinden Elektroden. In einigen Fällen kann EET Mikroorganismen zu elektrisch leitfähigen multizelle dicken Biofilme auf Elektrodenflächen, bilden die Zellen nicht in direktem Kontakt mit der Elektrode immer noch es als metabolische Elektron Akzeptor oder Spender nutzen können. Gibt es erhebliches Interesse an solchen Biofilmen als Elektrode Katalysatoren für verschiedene Anwendungen, wie z. B. mikrobiellen Electrosynthesis, Schadstoff sensing/Entfernung, und remote Energieerzeugung und Speicherung,7,8,9 ,10,11,12,13,14 aufgrund der Vielfalt der Stoffwechselvorgänge von Mikroorganismen und die Haltbarkeit der mikrobielle Biofilme im Vergleich durchgeführt auf Enzymbasis Bioelectrodes. 15 , 16 außerdem EET Wege können potenziell auf elektrisch Kontrolle oder Signal Veränderungen in natürlich vorkommenden genutzt werden oder mikrobiellen Stoffwechselvorgängen beteiligt, zum Beispiel in der Produktion eines gewünschten Produkts oder Detektion gentechnisch ein Ziel Analyten oder Anregung. Die elektrische Leitfähigkeit des elektrokatalytische Biofilme, die sie von anderen biologischen Materialien unterscheidet, ist ein zentraler Aspekt ihrer elektrokatalytische Eigenschaften, doch ist wenig über den zugrunde liegenden EET-Prozess in der Elektrode Umwelt verstanden, und das, was bekannt ist ist stark umkämpft. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Hier beschrieben ist eine 2-Elektroden-Methode zur Messung der Leitfähigkeit durch lebendige, Elektrode angebautes Biofilme über die Elektroden (IDAs). IDAs bestehen aus parallelen rechteckige Elektroden auf Flachglas Oberfläche gemustert, so dass jede andere Band an gegenüberliegenden Seiten des Array resultierenden verbunden ist in 2 Elektroden (Source und Drain). Sorgfältiger Prüfung eine IDA zeigt (siehe zum Beispiel Abbildung 6.12b der Ref #1), dass die Lücken, die Trennung von benachbarten Bands auch eine einzige Lücke in solch eine Weise hinsichtlich Form verbunden, die hin und her über das Array trennen die beiden Elektroden webt. Das Ergebnis ist eine lange und schmale Kluft zwischen Source und Drain Elektroden, sehr hohe Source-Drain-Ströme nachgeben, wenn ein leitendes Material gebildet, gegossen, polymerisiert oder das Array (im Falle der Art von Biofilmen hier betrachteten) gewachsen. Darüber hinaus führt die geringe Größe der Elektroden im kleinen Hintergrund aktuelle Kapazität aufgeladen und in Oxidationsstufe des leitenden Materials mit Tor Potenzial zu ändern, da die Menge des Materials erforderlich, um die Leitfähigkeit zu machen Messungen mit IDAs ist so klein. Die Technik der IDA-basierte beschriebenen elektrochemischen Anspritzung entwickelt, um Dünnschicht leitfähigen Polymeren zu charakterisieren,2,3,4,25 wurde erst vor kurzem auf lebende Systeme angewendet. 18 eine andere Technik zur Messung der Leitfähigkeit von Biofilmen leben verwendet eine großformatige split Source und Drain Elektroden und Quelle Metern das Tor potenzielle festlegen. 26 , 27 jedoch haben Bedenken im Hinblick auf diese Methoden vorher detailliert wurde. 18

Das Protokoll unten kapselt unsere Erfahrung mit Messungen der Leitfähigkeit des Lebens Geobacter Sulfurreducens und Biocathode MCL Biofilmen. G. Sulfurreducens ist ein Modell-Elektrode reduziert Organismus unlösliche Materialien, einschließlich Elektroden, als den alleinigen metabolische Elektron Akzeptor verwenden. Darüber hinaus bildet es dicken Biofilme, die in der Lage, Elektronen über mehrere Zelle Längen, so dass es eine ideale Modellorganismus anodische Fernverkehr extrazelluläre Elektronentransfer studieren zu transportieren sind. Wir berücksichtigen auch Details für das Studium der Biocathode MCL, eine aerobic, autotroph gemischte Gemeinde Biofilm isoliert von der Kathode einer benthische mikrobielle Brennstoffzelle. Biocathode MCL (benannt nach den drei primäre Bestandteile – Marinobacter, Chromatiaceaea und Labrenzia) ist in der Lage, eine Elektrode als seinen alleinigen Elektron Spender oxidiert und den Transport von Elektronen über mehrere Zelle Längen machen es ein interessantes kathodischen System zu studieren. Darüber hinaus hat Biocathode MCL gemeldeten höchste Leitfähigkeit für ein lebendiges System bis dato mit diesen Methoden. Die Einbeziehung von diesen vielfältigen Elektroaktive Biofilmen in diesem Protokoll soll darauf hinweisen, dass diese Technik für den Transport von Elektronen durch jede lebende Biofilm mit Elektroden elektrisch interagieren zu messen gilt.

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Protocol

1. die Mikroelektrode Array (IDA) Vorbereitung

  1. Erhalten Sie im Handel erhältlichen IDA Elektroden auf leitfähigem Untergrund gemustert oder synthetisieren sie Lithographische Standardverfahren verwenden. 28
    Hinweis: IDA Abmessungen und/oder Materialien können je nach gewünschten Bedingungen für verschiedene Experimente variiert werden. IDAs verwendet hier waren kommerziell erhältlich und bestand aus zwei ineinandergreifenden gold Mikroelektroden gemustert auf einem Glassubstrat, verbunden mit großen Elektroden an den entgegengesetzten Enden des Arrays. Die Elektroden sind ausgesetzt, während die Buslinien verbinden die Elektroden mit großen Kontaktflächen mit dünnen isolierenden Material beschichtet sind. IDAs verwendet hier bestehen aus zwei Sätze von 10 µm breiten und 2 mm lange gold Mikroelektrode Bändern (Source und Drain) Abstand auseinander 5 µm auf einer flachen Glasoberfläche gemustert. IDAs verwendet hier hatte 65 Elektrodenpaare (130 insgesamt die Bänder). Wechselnde Bänder werden mit Elektroden an den entgegengesetzten Enden des Arrays verbunden.
  2. Draht und IDA zu isolieren
    1. Legen Sie einen Draht auf jede große Elektrode-Pad mit leitfähigen Silber Epoxy.
      1. Bereiten Sie leitende Epoxid nach Herstellerangaben für die spezifische Epoxy im Einsatz mit einer Rute oder Pipette Mischkanüle (Anweisungen variieren je nach Hersteller).
      2. Legen Sie einen Draht auf jeder gold, sichere mit Lab Band. Decken Sie den Draht und Pad mit Silber Epoxy mit Stab- oder Pipette Mischkanüle.
      3. Vorsichtig bewegen zu einem Ofen 80 ° C für 1 h, zu heilen oder Heilung basierend auf Empfehlungen des Herstellers für die spezielle leitfähige Silber Epoxy verwendet.
      4. Nachdem das Epoxidharz aushärtet, benutzen Sie ein Multimeter elektrische Verbindung zwischen dem Ende des Drahtes und die Pads gewährleistet. Der Widerstand zwischen dem Draht und dem Pad sollte < 5 Ω. Auch verwenden Sie das Multimeter, um sicherzustellen, dass keine leitende Epoxid mehrere Elektroden verbunden ist wie das Array kurz kann. Wenn leitende Epoxid mehrere Leitungen verbunden ist, verwenden Sie einen Schreiber, um die Leitungen zu isolieren.
    2. Isolieren Sie die epoxied Verbindung durch die Beschichtung der Verbindung mit einer thermischen, elektrischen und wasserdichten Dämmstoff. Schwer entflammbar Polyurethan Harze sind oft geeignet.
      1. Entfernen Sie die Spitze des 15 mL konische Zentrifugenröhrchen (bei ca. 2,5 mL) als Form für das isolierende Material. Machen Sie zwei kleine Löcher in den Boden für die Drähte vorstehen mithilfe einer Nadel 21g.
      2. Legen Sie die IDA in die Form und den Draht durch die Löcher in den Boden der Form.
      3. Bereiten Sie die spezifischen isolierende Material. Befolgen Sie die Anweisungen, die mit dem speziellen Harz gewonnen.
      4. Pipette den Isolator in der Form, damit der Silberne Epoxy komplett ist abgedeckt (~2.5 mL) und nach Herstellerangaben trocknen lassen.

2. elektrochemische Reaktor Setup, Test und Impfung

  1. Richten Sie die elektrochemische Zelle.
    1. IDA, Gegenelektrode und Bezugselektrode in der elektrochemischen Zelle einfügen.
      Hinweis: Die elektrochemische Reaktor eingesetzt kann stark variieren, solange alle Elektroden reinpassen. Eine Überlegung ist, dass die Bezugselektrode so nah wie möglich an der Arbeitselektrode die praktischen Grenzen des Reaktors gegeben werden sollte. Hier verwenden wir einen Einkammer-Reaktor mit dem Referenz-Elektrode ~ 2-3 cm von den Elektroden arbeiten. Die Gegenelektrode sollten auch größer als die Arbeitselektrode um sicherzustellen, dass es nicht in das System begrenzt ist.
    2. Arbeiten mit einer Reinkultur Sterilisieren Sie den Reaktor mit der Gegenelektrode im Inneren. Sterilisieren Sie die Referenzelektrode durch Einweichen in Bleichmittel für 10 min und sterile deionisiertes Wasser für 10 Minuten die IDA sterilisieren durch Eintauchen in Bleichmittel für 5 s gefolgt von sterilen deionisiertes Wasser für 10 s vor dem einsetzen in den Reaktor.
    3. Füllen Sie die elektrochemische Zelle mit steriles Medium für Biofilm Wachstum geeignet. Verwenden Sie für G. Sulfurreducens17,18Süßwasser Medium mit Ausnahme Fumarat. Verwenden Sie für Biocathode MCL9 künstliches Meerwasser Medium. 9
    4. Verbinden Sie die Elektroden mit einem Bipotentiostat. Die Zähler-Führung einer IDA-Elektrode auf der Arbeit-Zuleitung 1, IDA Elektrode zu arbeiten-Zuleitung 2, die Referenzelektrode, die Referenz-Führung und Gegenelektrode herstellen.
  2. Elektrochemische Prüfung von IDAs.
    Hinweis: Das Hauptziel dieses Tests ist es, sicherzustellen, dass die beiden Elektroden elektrisch isoliert sind. Alle elektrochemische Techniken sind in der Software verwendet, um die Bipotentiostat zu steuern.
    1. Führen Sie Leitfähigkeit Kontrolltests (vor Biofilm Wachstum) um richtige IDA-Funktion mit einem Bipotentiostat zu gewährleisten.
      1. Maßnahme das offener Stromkreis Potential jeder Elektrode für 1 min.
        Hinweis: Auf einigen Instrumenten potenzielle offener Stromkreis muss erreicht werden durch die Galvanostatic Sammlung-Bedienung und Einstellung des Stroms auf 0 mA.
      2. Maßnahme das offener Stromkreis Potential der Elektrode 2 während der Durchführung zyklischer Voltammetrie Elektrode 1 zwischen + 0,2 V auf + 0,6 V (gegen sie) bei 20 mV/s.
        Hinweis: Andere Grenzen und Abtastraten für CV können verwendet werden, falls gewünscht. Vermeiden Sie jedoch Potenziale, die in Wasserstoff oder Sauerstoff Generation führt.
      3. Vergewissern Sie sich, dass die offenen Kreislauf potenzielle gemessen an Elektrode 2 nicht das Potential der Elektrode 1 während der CV mit dem potentiostaten Software widerspiegelt.
        Hinweis: Die offenen Stromkreis Potential der Elektrode 2 kann sich ändern, aber es soll das Potential der Elektrode 1 unabhängig.
      4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1.1 durch 2.2.1.3 außer Kontrolle das Potential der Elektrode 2 und Maß das offener Stromkreis Potential der Elektrode 1.
    2. Legen Sie das Potenzial der Elektroden Arbeiten zum gewünschten Wachstumspotenzial des relevanten Elektroaktive Biofilms mit der Bipotentiostat Software. Z. B. 0,5 V (gegen sie) für Geobacter Sulfurreducens oder 0,31 V (gegen sie) für Biocathode MCL.
  3. Relevanten Elektroaktive Biofilm wachsen
    1. Die elektrochemischen Reaktor aus einem Lager Kultur/Bereicherung der gewünschten elektrochemisch aktiven Mikroorganismen mit standard-aseptische mikrobiologische Techniken zu impfen. Für standard-Tests, impfen in eine 01:20 Verhältnis (Inokulum zu Reaktorvolumen) ein OD600 = 0,5 Kultur.
    2. Legen Sie das Rühren im Reaktor auf das gewünschte Niveau (~ 200 u/min) und dem Inkubator / Wasserbad auf die gewünschte Temperatur basierend auf den Wachstumsbedingungen des Biofilms von Interesse. Verwenden Sie für G. Sulfurreducens30 ° C für ein optimales Wachstum.
    3. Inkubieren Sie das System basierend auf spezifischen Anforderungen der Anmelder von Interesse, bis der Biofilm überbrückt die Kluft zwischen die beiden Elektroden. Für den stationären G. Sulfurreducens Biofilm inkubieren ~ 7-10 Tage. Inkubieren Sie für Biocathode MCL ~ 7 Tage. In jedem Fall Steuern Sie die Temperatur auf 30 ° C.

3. elektrochemische gating Experimente

  1. Wählen Sie die experimentellen Parameter, die verwendet werden, um die Abhängigkeit von Strom-Potenzial für die gating Messungen zu bestimmen.
    1. Bestimmen Sie den Bereich der Tor-Potenziale, die auf der IDA, die durchgeführten Strom (ISD) versus Tor potenzielle (E-G) Kurve für das System zu erhalten angewendet werden.
      Hinweis: Das Tor Potenziale untersucht sollten alle Potentiale mit möglichen Redox Aktivität abdecken. Wenn keine Informationen über das System des Interesses zur Verfügung steht, sollte einen weiten Potentialbereich verwendet (-0.55, + 0,6 V vs. sie). Ein Versuch und Irrtum-Ansatz kann verwendet werden, zur Feinabstimmung der Reihe basiert auf dem System unter Studie. Potenzielle Tor ist wie folgt definiert:
      Equation 1
      wo ist das Potenzial der Drain-Elektrode ED und ES ist das Potenzial der Quelle-Elektrode. Das Spektrum der Tor Potentiale verwendet wird durch die Anforderungen und Einschränkungen des spezifischen Systems von Interesse eingeschränkt. 18
      Hinweis: Source und Drain Potenziale, die in Sauerstoff und Wasserstoff Evolution führt sollte vermieden werden, da diese Prozesse den Biofilm beschädigen können.
    2. Bestimmen Sie die Source-Drain-Spannung (VSD), die als treibende Kraft für Elektronentransport durch den Film von der Quelle zum Abfluss verwendet wird. Source-Drain-Spannung ist wie folgt definiert:
      Equation 2
      Hinweis: Die Source-Drain-Spannung sollte klein genug sein, damit ichSD VSDlinear skaliert. 17
    3. Wählen Sie eine Scan-Rate (V) an der EG linear mit der Zeit, das unabhängig vom ichSD ist geändert, so dass das System angenähert werden kann, um im Steady-State für jedes mögliche Tor zu sein.
      Hinweis: Eine Scan-Rate von weniger als 0,002 V/s wird oft für biologische Systeme verwendet. 29 , 30
    4. Richten Sie die Bipotentiostat Software gating Messungen durchführen (d. h. fegen das Tor potenzielle) über den ausgewählten Bereich an der ausgewählten Source-Drain-Spannung und an den gewünschten Scan-Rate basierend auf der obigen Überlegungen.
      Hinweis: bei früheren gating Messungen mit G. Sulfurreducens,17,19 EG =-0.55 V bis 0,6 V (gegen sie), VSD = 0,01 V oder 0,1 V, V = 0,001 V/s. Für Biocathode MCL, EG = 0,25 V bis 0,7 V (gegen sie), VSD = 0,002 V, V = 0,0002 V/s.
      1. Darüber hinaus führen Sie eine Basismessung mit VSD = 0,000 V (d. h. einen Lebenslauf an jede einzelne Elektrode gleichzeitig genommen) an der gleichen v in Schritt 3.1.3 ausgewählt.
    5. Messungen Sie gating mit den Allgemeine Geschäftsbedingungen in 3.1.4 unter sowohl Umsatz (mit löslichen Elektron Spender oder Akzeptor vorhanden) und nicht-Umsatz (ohne lösliche Elektronen-Donor und Akzeptor).
      Hinweis: Nicht-Umsatz Bedingungen sind vorteilhaft da Messungen nicht durch die Oxidation oder Reduktion der lösliche Verbindungen für Zellstoffwechsel verdeckt sind, obwohl ähnliche Ergebnisse erhalten werden sollte, unabhängig davon, denen welchen Zustand nach verwendet wird subtrahieren Hintergrund Strömungen (siehe 3.1.8).
      1. Erzielen Sie Umsatz Bedingungen mithilfe der gleichen Reaktor Medium wie verwendet für Bakterienwachstum auf der Elektrode. Dieses Medium enthält lösliche Elektron Spender, wie Acetat für G. Sulfurreducens,17 oder Akzeptor, wie Sauerstoff für Biocathode MCL.
      2. Zu erreichen-Umsatz Bedingungen machen das gleiche Reaktor Medium für Bakterienwachstum auf der Elektrode verwendet, außer dem löslichen Elektron Spender oder Akzeptor weglassen. Entfernen Sie nachdem Sie sichergestellt haben, dass die potentiostaten ausgeschaltet ist das Medium aseptisch und fügen Sie in frisches Medium ohne die Elektron-Spender für anodische Systeme oder Akzeptor für kathodischen Systeme. Alternativ kann einen kontinuierlichen Fluss-System einrichten, langsam das Medium mit dem gewünschten Medium für nonturnover Bedingungen zu ersetzen.
        Hinweis: Wenn Sauerstoff die löslichen Elektronen-Akzeptor (z. B. für Biocathode MCL) ist, sparge das System mit einer Mischung von ~ 15 % CO2 und 85 % N2 (oder einer Gasmischung, die den richtigen pH-Wert im Medium beibehält).
    6. Nach Beendigung der gating Messungen Anwendung der potentiostaten das Potential jeder Elektrode zurück zum Wachstum Potenzial, um das System wieder zu stabilisieren (mit denselben Werten wie 2.2.2) fest.
    7. Wenn alle oben beschriebenen Bedingungen erfüllt sind (ISD ist unabhängig von v und skaliert linear mit V-SD), ichSD -Werte zu konvertieren, Leitfähigkeit mit den folgenden Gleichungen als zuvor beschriebenen31
      Equation 3
      Equation 4
    8. wo ist G die Leitfähigkeit und S ein Skalierungsfaktor, der ist systemabhängig und Faktoren in Variablen z. B. elektrodengröße Lückengröße und Biofilm-Höhe. Für bestimmte Systeme kann S aus vorgegebenen Gleichungen bestimmt werden. 31 Alternativ kann S mit berechnet werden numerisch eine Modelling-Software, wie zuvor. 17
    9. Subtrahieren Sie die Hintergrund-Strömungen um die Form und den Umfang der durchgeführten aktuellen zu identifizieren. Entweder ziehen Sie am VSD erzeugten Strom = 0.00 V aus dem aktuellen generiert bei VSD = 0,01 V oder Subtrahieren der Drain-Strom aus der aktuellen Quelle generiert mit einer V-SD = 0,01 V. entweder Methode entfernt Hintergrund Strömungen, so dass nur die durchgeführte aktuelle.
  2. Abhängige elektrochemische gating Temperaturmessungen
    1. Ermitteln der Temperatur von Interesse. Dieser Bereich ist stark abhängig von das System untersucht, jedoch physiologisch relevante Temperaturen verwendet werden soll.
      Hinweis: Frühere Studien haben einen Temperaturbereich von 10 ° C bis 30 ° C verwendet, Elektronentransport unter physiologisch relevanten Bedingungen für mesophile Mikroorganismen zu studieren. 17
    2. Erhalten Sie einen umlaufenden Wasserbad oder Inkubator, Reaktortemperatur und eine Kontrolle-Reaktor um sicherzustellen, dass die soll- und ist-Temperatur des Mediums ist dasselbe zu regulieren.
      1. Legen Sie ein Thermometer oder Thermoelement in einem Reaktor Kontrolle wo wäre die IDA.
    3. Mache ichSD -Messungen (siehe 3.1.4) über die Strecke der Temperaturen unter Umsatz ausgewählt und Nonturnover (siehe Schritt 3.1.5) Bedingungen der Bipotentiostat Anschluss an eines der beiden nachstehend beschriebenen Verfahren verwenden.
      1. Generieren Sie ichSD vs. E-G -Kurven, wie beschrieben (siehe 3.1), für jede Temperatur über den Temperaturbereich von Interesse. Für Materialien aufweisen, Redox, Leitfähigkeit, wie z. B. G. Sulfurreducens und Biocathode MCL, der Spitzenstrom von jeder Temperatur dient zur Bestimmung der ISD vs. T-Abhängigkeit.
        Hinweis: Diese Methode wird verwendet, um eine vollständige generieren, die ichSD vs. EG für jede Temperatur-Kurve, die aber erfordert mehr Zeit als die zweite Option.
      2. Alternativ gesetzt und halten die IDA an der Pforte potenzielle, die maximale durchgeführt ergibt aktuelle mit der Bipotentiostat (gewonnen aus dem i.SD Vs E-G -Kurve, Schritt 3.1.4) und notieren Sie den Maximalstrom durchgeführten mit dem Bipotentiostat während die Temperatur ist zwischen dem Bereich des gewählten mit den integrierten Steuerelementen Wasserbad oder Inkubator Temperaturen radelte.
        Hinweis: mit der Elektrode/reaktorgeometrie verwendet hier die ichSD und T dürfen für mindestens 20 min und einem Durchschnitt stabil ichSD zu stabilisieren ist für jede Temperatur verwendet. Mehr oder weniger evtl. Stabilisierungszeit auf Basis des spezifischen Systems. Diese Methode ist schneller als die erste und verursacht weniger Stress auf den Biofilm. Volle gating Kurven werden jedoch nicht generiert.
      3. Zyklus die Temperatur von einem Satz Punkt zum anderen und zurück, wieder mit den integrierten Steuerelementen des Inkubators oder im Wasserbad die Reversibilität der Reaktion um sicherzustellen, dass die Temperatur zu bestimmen Radfahren schadet nicht den Biofilm.
    4. Die Temperatur auf das normale Wachstum Temperatur mit den integrierten Steuerelementen Inkubator oder Wasserbad zurückgesetzt und lassen Sie das System zu stabilisieren.
      Hinweis: Für eine Redox-Dirigent kann ichSD gegen 1/T Daten mit der Arrhenius-Rate-Ausdruck fit sein ermöglicht die Berechnung der Aktivierungsenergie wie folgt:
      Equation 5
      Equation 6
      wo ist Eeine Aktivierungsenergie für Elektronentransfer zwischen benachbarten Redox Cofaktoren und k die Boltzmann-Konstante.

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Representative Results

IDAs wurden verdrahtet, isoliert und getestet, um sicherzustellen, dass die beiden Elektroden elektrisch isoliert voneinander unterscheiden (Abbildung 1). Reaktoren wurden montiert, mit G. Sulfurreducensbeimpft und inkubiert, bis ein Biofilm die Lücke zwischen den Elektroden überbrückt. G. Sulfurreducens Biofilm sieht optisch das Array abdecken. Andere Biofilme kann verlangen, dass den Forscher dazu eine elektrochemische gating Messungen zu sehen, ob die beiden Elektroden elektrisch verbunden sind. Mikroskopie sollte auch verwendet werden, überprüfen Sie die Verbindung zwischen den Elektroden des Arrays. Elektrochemische gating Experimente wurden durchgeführt, um festzustellen, die Abhängigkeit von ISD EG (Abbildung 2). Die Leitfähigkeit des Films Leben wird dann anhand des durchgeführten gating Versuchszwecke gemessenen Stroms. Die Präzision und Genauigkeit dieser Messungen war hoch, da das hohe Signal Rauschabstand mit der IDA-Konfiguration möglich. Die Temperaturabhängigkeit von ISD auf T wurde auch zusammen mit einer Aktivierungsenergie für Elektronentransport durch den Biofilm (Abbildung 2) ermittelt. Die hier erzielten Ergebnisse sind ähnlich wie zuvor beobachtet17,18 und unterstützen die Hypothese, die G. Sulfurreducens und Biocathode MCL Biofilme Redox Leitern ähnlich Verhalten wo sind Elektronen übertragen durch den Biofilm durch hüpfen zwischen Redox-Cofaktoren in der Nähe in der Nähe.

Figure 1
Abbildung 1: IDA einrichten und Steuern elektrochemische Prüfungen. (A) eine IDA, die isoliert und verdrahtet. Einschub: Vergrößert abgebildet des Arrays zeigt die Elektroden und eines der großen Elektroden. Separate Zähler und Referenz Elektroden befinden sich in der elektrochemischen Zelle zusammen mit der IDA Experimente durchführen. (B) elektrochemische Kontrolltests elektrische Unabhängigkeit jeder Elektrode ausstellen. Die offenen Stromkreis Potential der Elektrode 2 reagiert nicht auf die wechselnden Potential der Elektrode 1 während CV, darauf hinweist, dass die Elektroden nicht kurzgeschlossen und eignet sich für Biofilm Anspritzung Messungen. (C) identisch mit B, außer das Potential der Elektrode 2, während CV Elektrode 1 verschieben, darauf hinweist, dass die Elektroden kurzgeschlossen werden und sollte nicht für die Anspritzung Messungen verwendet werden. Diese IDA wurde nicht in weiteren Experimenten verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: elektrochemische Experimente gating. (A) elektrochemische Messungen eines lebendigen gating, Elektrode gewachsen G. Sulfurreducens Biofilm. Die Spitze Form ichSD-EG Kurve ist bezeichnend für inkohärent, mehrstufigen Elektronentransport durch den Biofilm. Durchgeführten Stromkurve erhielt durch Subtraktion der Quelle aus dem Abfluss aktuelle (und Division durch 2) bezogen auf jedes Tor Potential Hintergrund Strömungen zu beseitigen. Beispiele für aktuelle Rohdaten genommen mit VSD = 0 und VSD = 0,01 V, der Leser wird zu den unterstützenden Informationen der bisherigen Arbeit bezeichnet. 18 (B) temperaturabhängig gating Measurementsover eine physiologisch relevanten Bereich eine Erhöhung der Leitfähigkeit ausstellen, wenn die Temperatur erhöht wird, beobachtet eine Eigenschaft für Redox-Dirigenten. 4 (C) Transformation des ichsSD -T-Daten und Anpassung an die Arrhenius-Gleichung. Die lineare Anpassung der Arrhenius-Gleichung ist bezeichnend für einen mehrstufigen Elektronen-Transfer-Prozess. Die Aktivierungsenergie für Elektronentransport durch G. Sulfurreducens Biofilm errechnet sich aus der Steigung der Kurve zu ~0.01 eV, die im Einklang mit Elektronentransport zwischen Redox-Zentren der benachbarten c-Typ Zellfarbstoffe. 32 , 33 , 34 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Während der Einrichtung der IDA ist es wichtig zu überprüfen, ob die Quelle und den Abfluss nicht zusammen vor dem elektrochemischen gating Messungen kurzgeschlossen werden da dies ändert die ichSD vs. E-G -Kurve und zu falschen Ergebnissen und Interpretationen führen könnte. Es ist auch entscheidend für VSD und v wählen, so dass der Strom linear abhängig VSD und unabhängig von v ist. Wenn dies nicht der Fall ist, können nicht die oben beschriebenen Gleichungen genutzt werden, um die Leitfähigkeit zu berechnen.

Mindestens zwei Hintergrund Ströme müssen in Betracht gezogen und aus durchgeführten Strommessungen entfernt. Die erste ist Hintergrund aufgrund Faradaic Laden/Entladen von Redox-Cofaktoren, wie das Tor Potenzial mitgerissen wird. Diesem aktuellen Hintergrund ist stark durch die Menge der Redox betroffen, die Cofaktoren, die elektrisch zugänglich sind an der Elektrodenoberfläche angeschlossen. Ein zweiter Hintergrund aktuelle ist double-Layer-Kapazität. Ein Dritte Hintergrund aktuelle liegt an Umsatz von metabolischen Elektronen Akzeptoren/Spender von Zellen. Diesem Hintergrund aktuelle gilt nur unter Umsatz Bedingungen. Hintergrund-Strömungen in dieser Studie wurden durch Subtraktion von der Drain-Strom am VSD erhalten aktuelle Quelle eliminiert = 0,01 V. Diese Methode setzt voraus, dass Hintergrund Ströme gleich an beiden Elektroden und Source-Drain Strömungen gleich in der Größe an beide Elektroden, aber Gegenteil anmelden sind. In diesem Fall subtrahieren die Source und Drain Strömungen ergibt eine durchgeführte aktuelle Doppel in der Größenordnung und durch zwei geteilt werden sollte. Es sei darauf hingewiesen, dass diese Annahme nur an der Grenze von einem kleinen VSD, gilt das System angewiesen ist (für G. Sulfurreducens, VSD< 0,05 V). Größere VSD -Werte oft führt zu ungleichen Bedingungen auf jede Elektrode und verhindert, dass diese Methode der Hintergrundabzug verwendet werden. Alternativ Hintergrund Strömungen kann durch Subtraktion Quelle entfernt werden und drain Strömungen am VSD = 0,0 V von denen, die an VSD = 0,01 V. Diese Methode übernimmt, dass die Grundlinie Ströme jeder Elektrode identisch sind.

Die hier beschriebene Technik ist flexibel. Die meisten im Protokoll beschriebenen Parameter sind abhängig von dem System untersucht und verändert werden können. Für Beispiel, das Material und die Abmessungen der IDA variiert werden können, können den Temperaturbereich und die Auswahl an Tor Potentiale, neben anderen Parametern verändert werden, um die Bedürfnisse der speziellen Studie passen. Weitere, standard mikrobiologische und elektrochemische Techniken sind angepasst und genutzt, so dass dieses Protokoll für Forscher aus den unterschiedlichsten Fachrichtungen geeignet.

Hier haben wir ein Protokoll für das Studium Elektronentransport in lebenden, Elektrode gewachsen, Elektroaktive Biofilme mit IDAs beschrieben. IDAs haben bereits eingelöst, Elektronentransport in Dünnschicht, Durchführung von Polymeren zu charakterisieren und können mit einer Vielzahl von standard Elektrodenmaterialien und Photolithographische Techniken hergestellt werden. 2 der Hauptvorteil der IDAs ist das high-Signal gegenüber Rauschen Verhältnis durch (i) die lange serpentine Lücke, die die wechselnde Quelle trennt und Elektrode Bands und (Ii) die relativ kleine Summe Elektrodenfläche im Vergleich zu der Lückengröße abtropfen lassen. Die Elektroden-Geometrie ist wichtig bei der Anspritzung Messungen, da die Elektrode und Lücke Dimensionen einen großen Einfluss auf das Signal-Rausch-Verhältnis haben zu betrachten und somit auf die Genauigkeit der Messungen der Leitfähigkeit. 18

Elektrochemische Anspritzung Experimente der lebenden, Elektrode angebautes G. Sulfurreducens Biofilme Ausstellung ein klaren Höhepunkt geformt Abhängigkeit von ISD auf EG, was darauf hindeutet, dass Elektronen durch den Biofilm über transportiert werden inkohärent, Multi-Step hüpfen, wie Redox leitfähigen Polymeren. 4 , 35 die Peak-Leitfähigkeit des Biofilms G. Sulfurreducens erwies sich als ~ 4 µS/cm, in Übereinstimmung mit früheren Ergebnisse unter ähnlichen Bedingungen erzeugt werden. 17 weiter, für Peak Leitfähigkeit ähnlich dem Mittelpunkt potenzielle beobachtet potenzielle Tor für G. Sulfurreducens Biofilme während Umsatz CV17 dies auch zuvor beobachtet worden und wird postuliert, die das gleiche bedeuten Elektron-Träger für den Transport von Elektronen aus Acetat Stoffwechsel von Zellen verwendet werden auch verwendet, um Ladung von der Quelle-Elektrode an der Drain-Elektrode durch den Biofilm tragen. Andere Abhängigkeiten von ISD auf EG, wie in verschiedenen Materialien eingehalten worden und einen anderen Mechanismus der Elektronentransfer vorschlagen. Zum Beispiel die ichSD vs. E-G -Kurve von der Polymer-poly(methylthiophene) zeigt eine s-förmige Kurve und schlägt metallisch anmutenden Elektron Wärmeleitung. 36 , 37

Die Temperaturabhängigkeit der durchgeführten Strom ist ein kritischer Parameter bei der Bestimmung des Mechanismus der Elektronentransport durch leitfähige Materialien. Bis vor kurzem war nur Ex-Situ-Proben benutzt worden, um die Temperaturabhängigkeit der durchgeführten Strom durch einen Biofilm zu untersuchen. 22 aktuelle präsentiert hier und anderswo17 Ergebnisse eine andere ichSD -T-Abhängigkeit mit gating Messungen und daher prognostizieren einen mehrstufigen, inkohärenten springenden Mechanismus der Elektronentransport durch G. Sulfurreducens Biofilme, die eine zuvor vorgeschlagene Mechanismus unterscheidet. 22

Die größte Beschränkung dieser Technik und anderen ähnlichen Geometrien beim Elektronentransport durch mikrobielle Biofilm auswerten ist, dass die Ladung seitlich bewegt sich zwischen Source und Drain Elektroden, die in derselben Ebene auf eine Ebene Fläche. Der natürliche Fluss der Elektronen durch den Biofilm ist jedoch senkrecht auf der Elektrodenoberfläche. Mit dieser Technik und Modell, wir ungefähre den Biofilm als homogenen Film und Elektronenfluss durch nur einen Teil des Biofilms zu befragen. Experimenteller Validierung der räumliche Heterogenität des Biofilms ist noch notwendig, um diese Technik weiter zu validieren. Wie oben beschrieben, ermöglicht diese Methode in situ Messungen mit dem höchsten Signal Rauschabstand Datum zur Verfügung. Diese Technik kann verwendet werden, um Ladung zu studieren Transport von Material, das in der Lage ist mit einer Elektrode zu interagieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

L.M.T, M.D.Y und S.M.G-S. bestätigen das Office of Naval Research (Award-#N0001415WX01038 und N0001415WX00195), Naval Research Laboratory und das Naval Research Laboratory Nanowissenschaften Institute; M.Y.E.-N. wird durch die US Abteilung von Energie Grant DE-FG02-13ER16415 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

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References

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Chemie Ausgabe 136 mikrobielle Elektrochemie mikrobiellen Electrosynthesis Biofilm Leitfähigkeit extrazelluläre Elektronentransport Dünnschicht elektrochemische Anspritzung
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Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

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