Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Kendetegner elektron Transport gennem levende biofilm

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671

Summary

En protokol til måling af elektriske ledningsevne af levende mikrobielle biofilm fysiologisk relevante betingelser er præsenteret.

Abstract

Her viser vi metode af elektrokemiske gating bruges til at karakterisere elektriske ledningsevne af elektrode-vokset mikrobielle biofilm fysiologisk relevante betingelser. 1 disse målinger udføres på levende biofilm i vandigt medium ved hjælp af source og drain elektroder mønstret på en glasoverflade i en specialiseret konfiguration kaldet en interdigitated elektrode (IDA) array. En biofilm dyrkes der strækker sig på tværs af bro forbinder kilde og afløb. Potentialer anvendes til elektroder (ES og ED) genererer en kilde-afløb strøm (ISD) gennem biofilm mellem elektroderne. Afhængighed af elektriske ledningsevne på gate potentiale (gennemsnittet af source og drain potentialer, EG = [ED + ES] / 2) bestemmes af systematisk ændre porten potentielle og måle den resulterende kilde-afløb nuværende. Afhængighed af ledningsevne på gate potentielle giver mekanistiske information om ekstracellulære elektron transportprocessen bag den elektriske ledningsevne af den specifikke biofilm under undersøgelsen. Den elektrokemiske gating målemetode beskrevet her er baseret direkte på, bruges af M. S. Wrighton2,3 og kolleger og R. W. Murray4,5,6 og kolleger i 1980's til at undersøge tynd film ledende polymerer.

Introduction

Ekstracellulære elektron transport (EET) er en proces, der gør det muligt for visse mikroorganismer til at transportere elektroner mellem intracellulære metaboliske processer og uopløselige elektronacceptorer eller donorer, der bor uden for cellen, lige fra naturlige mineraler til elektroder. I nogle tilfælde kan EET mikroorganismer danne elektrisk ledende multi celle tykke biofilm på elektrode overflader, hvor celler ikke i direkte kontakt med elektroden kan stadig bruge det som en metabolisk elektron acceptor eller donor. Der er betydelig interesse i sådanne biofilm som elektrode katalysatorer til forskellige applikationer, såsom mikrobielle electrosynthesis, forurenende sensing/fjernelse, og ekstern energiproduktion og opbevaring,7,8,9 ,10,11,12,13,14 variation af metaboliske processer udføres af mikroorganismer og holdbarheden af mikrobielle biofilm i forhold til enzym-baseret bioelectrodes. 15 , 16 endvidere EET veje kan potentielt blive udnyttet til elektrisk styring eller signal ændringer i naturligt forekommende eller manipuleret genetisk mikrobielle metaboliske processer involveret, for eksempel i produktionen af et ønsket produkt eller registrering af en analysanden eller stimulus. Den elektriske ledningsevne af electrocatalytic biofilm, der adskiller dem fra andre biologiske materialer, er et centralt aspekt af deres electrocatalytic egenskaber, men lidt er forstået om den underliggende EET proces i elektrode miljø, og det, der er kendt er stærkt anfægtede. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Beskrevet her er en 2-elektrode metode til at måle ledningsevne gennem levende, elektrode-vokset biofilm ved hjælp af interdigitated elektrode arrays (foranderlig). Foranderlig består af parallelle rektangulære elektroder mønstret på planglas overflade, således at alle andre band er forbundet på modsatte sider af array resulterer i 2 elektroder (kilde og afløb). Omhyggelig undersøgelse af en IDA afslører (Se for eksempel figur 6.12b af ref #1), at hullerne adskille tilstødende bands er også tilsluttet på en sådan måde, form et enkelt hul, der væver frem og tilbage på tværs af matrixen adskiller de to elektroder. Resultatet er en lang og smal kløft adskille source og drain elektroderne, giver meget høj kilde-afløb strømninger, når en ledende materiale er dannet, støbt, polymeriserede eller havde vokset (for typen af biofilm betragtes her) i matrixen. Hertil kommer, resulterer den lille størrelse af elektroderne i små baggrund nuværende kapacitans opladning og ændre i oxidationstrin af den ledende materiale med ændring i gate potentielle, da mængden af materiale skulle lave ledningsevne måling ved hjælp af foranderlig er så lille. Teknikken med IDA-baserede elektrokemiske gating beskrevet her, udviklet til at karakterisere tynd film ledende polymerer,2,3,4,25 er først for nylig blevet anvendt til levende systemer. 18 en anden teknik, der anvendes til at måle ledningsevne af levende biofilm udnyttet et stort format split source og drain elektroder og kilde meter at angive porten potentielle. 26 , 27 dog bekymringer over disse metoder har været udførligt beskrevet tidligere. 18

Protokollen nedenfor sammenfatter vores erfaring med at foretage ledningsevne målinger af levende Geobacter svovlreducens og biocathode MCL biofilm. G. svovlreducens er en model elektrode at reducere organisme kunne bruge uopløselige materialer, herunder elektroder, som den eneste metaboliske elektron acceptor. Derudover danner det tykke biofilm, der er i stand til at transportere elektroner over flere celle længder, hvilket gør det en ideel model organisme at studere anodisk langdistance ekstracellulære elektron overførsel. Vi har også omfatte detaljer for studiet af biocathode MCL, en aerobe, autotrofe blandet Fællesskabet biofilm isoleret fra katoden af en bundlevende mikrobe brændselscelle. Biocathode MCL (opkaldt efter de tre primære vælgere – Marinobacter, Chromatiaceaea og Labrenzia) er i stand til at oxidere en elektrode som sin eneste elektron donor og transport af elektroner over flere celle længder, gør det en interessant katodisk system til at studere. Biocathode MCL har desuden den højeste rapporterede ledningsevne for et levende system til dato ved hjælp af disse metoder. Medtagelsen af disse forskellige electroactive biofilm i denne protokol er beregnet til at fremhæve, at denne teknik kan anvendes til at måle transporten af elektroner gennem enhver levende biofilm kan elektrisk arbejde med elektroder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. interdigitated mikroelektrode array (IDA) forberedelse

  1. Få kommercielt tilgængelige IDA elektroder mønstret på en ledende substrat eller syntetisere dem ved hjælp af standardmetoderne til Litografisk. 28
    Bemærk: IDA dimensioner og/eller materialer kan varieres baseret på ønskede betingelser for forskellige eksperimenter. Foranderlig bruges her var fremstillet kommercielt og bestod af to interdigitated guld microelectrodes mønstret på et glas substrat tilsluttet store elektrode puder i modsatte ende af matrixen. Elektroderne er udsat, mens buslinjer forbinder elektroder til den store kontakte puder er belagt med tyndt isolerende materiale. Foranderlig bruges her består af to sæt af 10 µm-bred og 2 mm lange guld mikroelektrode-bands (source og drain) fordelt 5 µm apart mønstret på en flad glasoverfladen. Foranderlig bruges her havde 65 elektrode par (130 samlede interdigitated bands). Skiftende bands er tilsluttet elektrode puder i modsatte ende af matrixen.
  2. Wire og isolere IDA
    1. Vedhæfte en ledning til hver stor elektrode pad ved hjælp af ledende sølv epoxy.
      1. Forberede ledende epoxy ifølge producentens anvisninger for den specifikke epoxy i brug med en blanding stang eller pipette spids (instruktioner kan variere afhængigt af producenten).
      2. Placer en ledning på hvert guld pad, sikkert på plads ved hjælp af lab tape. Dække wire og pad med sølv epoxy ved hjælp af en blanding stang eller pipette tip.
      3. Flytte omhyggeligt til ovn 80 ° C i 1 time til at helbrede eller kur baseret på producentens anbefalinger til den specifikke ledende sølv epoxy bruges.
      4. Når epoxyen hærder, bruge et multimeter til at sikre elektriske forbindelse mellem slutningen af wiren og puder. Modstand mellem wiren og puden bør være < 5 Ω. Også bruge multimeter til at kontrollere, at ingen ledende epoxy forbinder flere elektrode puder, så dette kan kort array. Hvis ledende epoxy er at forbinde flere kundeemner, skal du bruge en skriver for at isolere fører.
    2. Isolere den epoxied forbindelse med belægning i forbindelse med en termisk, elektrisk, og vandtæt isoleringsmateriale. Brandhæmmende polyurethan harpiks er ofte velegnede.
      1. Fjerne spidsen af en 15 mL konisk centrifugeglas (på ca 2,5 mL mærket) som en form for det isolerende materiale. Gøre to små huller i bunden for ledninger til rager gennem ved hjælp af en 21g nål.
      2. Indsæt IDA i mug og ledninger gennem hullerne i bunden af formen.
      3. Forberede den særlige isolerende materiale. Følg vejledningen med specifikke harpiks, der er opnået.
      4. Afpipetteres isolatoren i formen, så at den sølv epoxy er fuldstændig dækket (~2.5 mL) og lad den tørre ifølge producentens specifikationer.

2. elektrokemiske reaktor opsætning, test og podning

  1. Oprettet den elektrokemiske celler.
    1. Indsætte IDA, counter elektrode og referenceelektrode i elektrokemiske celler.
      Bemærk: Den elektrokemiske reaktor bruges kan variere meget, så længe alle af elektroderne passe inde. En overvejelse er at referenceelektrode så tæt som muligt til den arbejdende elektrode får de praktiske begrænsninger af reaktoren. Her bruger vi en enkelt kammer reaktor med reference elektrode ~ 2-3 cm fra arbejde elektroder. Counter elektrode bør også større end den arbejdende elektrode til at sikre, at det ikke er en begrænsning i systemet.
    2. Hvis arbejder med en ren kultur, sterilisere reaktor med counter elektrode inde. Sterilisere referenceelektrode ved opblødning i blegemiddel for 10 min og sterile deioniseret vand i 10 min. sterilisere IDA ved dypning i blegemiddel til 5 s efterfulgt af sterile deioniseret vand for 10 s før indsættelse i reaktoren.
    3. Udfylde den elektrokemiske celle med steril medium egnet til biofilm vækst. For G. svovlreducens17,18, bruge ferskvand medium undtagen fumarat. Biocathode MCL bruge9 kunstigt havvand medium. 9
    4. Elektroderne tilsluttes en bipotentiostat. Tilslut en IDA elektrode til den fungerende ledende 1, andre IDA elektrode til den fungerende ledende 2, referenceelektrode til reference kundeemnet og counter-elektrode til counter bly.
  2. Elektrokemiske afprøvning af foranderlig.
    Bemærk: Det store mål af denne test er at sikre, at de to elektroder er elektrisk isoleret. Alle elektrokemiske teknikker er til rådighed i den software, der bruges til at styre bipotentiostat.
    1. Udføre kontrol ledningsevne tests (før biofilm vækst) for at sikre korrekt IDA funktion ved hjælp af en bipotentiostat.
      1. Foranstaltningen åben kredsløb potentiale af hver elektrode i 1 minut.
        Bemærk: På nogle instrumenter, åben kredsløb potentielle skal være opnået ved hjælp af programmet galvanostatic samling og angive aktuelt til 0 mA.
      2. Foranstaltningen åben kredsløb potentiale af elektrode 2 mens de udfører cyklisk voltammetry på elektrode 1 mellem + 0,2 V til +0.6 V (vs hun) på 20 mV/s.
        Bemærk: Andre grænser og scanning satser for CV kan bruges hvis det ønskes. Men undgå potentialer, der vil resultere i brint eller ilt generation.
      3. Kontroller, at den åbne kredsløb potentielle målt på elektrode 2 ikke spejl potentiale af elektrode 1 under CV ved hjælp af potentiostat software.
        Bemærk: Det åbne kredsløb potentiale af elektrode 2 kan ændres, men det bør være uafhængige af elektrode 1 potentiale.
      4. Gentag trin 2.2.1.1 gennem 2.2.1.3 undtagen kontrol elektrode 2 og foranstaltning åbent kredsløb potentiale af elektrode 1 potentiale.
    2. Angive potentialet i orden elektroder til det ønskede vækstpotentialet i den relevante electroactive biofilm ved hjælp af bipotentiostat software. For eksempel bruge 0.5 V (vs hun) for Geobacter svovlreducens eller +0.31 V (vs hun) for biocathode MCL.
  3. Vokse relevante electroactive biofilm
    1. Podes den elektrokemiske reaktor fra en materiel kultur/berigelse af de ønskede elektrokemisk aktive mikroorganismer ved hjælp af standard aseptisk mikrobiologiske teknikker. For standard tests, podes i 1:20 ratio (inokulum til reaktoren volumen) af en OD600 = 0,5 kultur.
    2. Indstille omrøring i reaktoren til det ønskede niveau (~ 200 rpm) og rugemaskinen vandbad til den ønskede temperatur baseret på biofilm af interesse vækstbetingelser. For G. svovlreducens, skal du bruge 30 ° C for optimal vækst.
    3. Inkuber systemet er baseret på specifikke krav for nukleinsyresekvenser af renter, indtil biofilm bygger bro mellem de to elektroder. For stationære G. svovlreducens biofilm, inkuberes i ~ 7-10 dage. Biocathode MCL, Ruger ~ 7 dage. I hvert tilfælde kontrollere temperatur på 30 ° C.

3. elektrokemiske gating eksperimenter

  1. Vælg de eksperimentelle parametre, der skal bruges til at bestemme den aktuelle-potentiale afhængighed for gating målingerne.
    1. Bestemme området af gate potentialer, som vil blive anvendt til IDA at få den gennemførte nuværende (ISD) versus gate potentielle (EG) kurven for systemet.
      Bemærk: Rækken af gate potentialer undersøgt bør dække alle potentialer med mulige redox aktivitet. Hvis der foreligger ingen oplysninger om systemet af interesse, bør en bred potentielle vifte brugte (-0.55 til +0.6 V vs hun). En retssag og fejl tilgang kan bruges til at finjustere rækken baseret på systemet under undersøgelsen. Gate potentielle er defineret som:
      Equation 1
      hvor ED er potentialet i afløbet elektrode og ES er potentialet i den kilde elektrode. Rækken af gate potentialer bruges er begrænset af de krav og begrænsninger af det specifikke system af interesse. 18
      Bemærk: Source og drain potentialer, der vil resultere i ilt og brint evolution bør undgås, da disse processer kan beskadige biofilm.
    2. Bestemme den kilde-afløb spænding (VSD), der bruges som drivkraft for elektron transport gennem film fra kilden til afløbet. Kilde-afløb spænding er defineret som:
      Equation 2
      Bemærk: Kilde-afløb spændingen skal være tilstrækkelig lille så ISD skalaer lineært med VSD. 17
    3. Vælg en søgehastighed (v), hvor EG ændres lineært med tid, der er uafhængige af jegSD , så systemet kan estimeres til at være på steady state for hver gate potentielle.
      Bemærk: En scanning på mindre end 0,002 V/s bruges ofte til biologiske systemer. 29 , 30
    4. Opsætning af bipotentiostat software kan udføre de gating målinger (dvs. feje porten potentielle) over det markerede område, på den valgte kilde-afløb spænding, og på den ønskede søgehastighed baseret på ovenstående betragtninger.
      Bemærk: For tidligere gating målinger ved hjælp af G. svovlreducens,17,19 EG =-0.55 V til 0,6 V (vs hun), VSD = 0,01 V eller 0,1 V, v = 0,001 V/s. For Biocathode MCL, EG = 0,25 V til 0,7 V (vs hun), VSD = 0,002 V, v = 0,0002 V/s.
      1. Derudover udføre en basismåling med VSD = 0.000 V (dvs. en CV på hver enkelt elektrode taget samtidigt) på samme v valgt i trin 3.1.3.
    5. Udføre gating målinger ved hjælp af betingelser i 3.1.4 under begge omsætning (med opløselige elektron donor eller acceptor nuværende) og ikke-omsætning (uden opløselige elektron donor og acceptor) betingelser.
      Bemærk: Ikke-omsætning betingelser er fordelagtigt fordi målinger ikke er skjult af oxidation eller reduktion af opløselige forbindelser for cellulære metabolisme, selv om lignende resultater bør opnås uanset hvilken tilstand bruges efter fratrække baggrund strømme (detaljeret i 3.1.8).
      1. Opnå omsætning betingelser ved hjælp af den samme reaktor medium som brugte for bakteriel vækst på elektroden. Dette medium indeholder opløselige elektron donor, såsom acetat for G. svovlreducens,17 eller acceptor, såsom ilt til Biocathode MCL.
      2. Nå ikke-omsætning betingelser ved at give den samme reaktor-medium bruges til bakteriel vækst på elektroden, undtagen udelader opløselige elektron donor eller acceptor. Efter at sikre, at potentiostat er slukket, fjerne medium aseptisk og tilføje i frisk medium uden elektron donoren til anodisk systemer eller acceptoren til katodisk systemer. Alternativt, en kontinuerlig flow system kan sættes op til langsomt Udskift mediet med den ønskede medium for nonturnover betingelser.
        Bemærk: Hvis ilt er opløselig elektron acceptoren (som for biocathode MCL), sparge system med en blanding af ~ 15% CO2 og 85% N2 (eller en gasblanding, der vil opretholde den korrekte pH i medium).
    6. Efter afslutningen af de gating målinger, skal du bruge potentiostat software til at angive potentialet i hver elektrode tilbage til vækst potentiale til at tillade systemet til at re-regulering (ved hjælp af de samme værdier som i 2.2.2).
    7. Hvis alle de ovennævnte betingelser er opfyldt (ISD er uafhængig af v og skalaer lineært med VSD), konvertere jegSD værdier ledningsevne ved hjælp af følgende ligninger som tidligere beskrevet31
      Equation 3
      Equation 4
    8. hvor G er ledningsevne og S er en skaleringsfaktoren, der er afhængige af, og faktorer i variabler såsom elektrode størrelse, hul størrelse og biofilm højde. For visse systemer, kan S bestemmes fra forudbestemt ligninger. 31 alternativt S kan beregnes numerisk modellering software, som beskrevet tidligere. 17
    9. Subtrahere baggrund strømninger for at identificere formen og omfanget af den gennemførte aktuelle. Enten trække den aktuelle genereret på VSD = 0,00 V fra den aktuelle genereret på VSD = 0,01 V eller subtrahere afløbet nuværende fra den aktuelle kilde genereret med et VSD = 0,01 V. enten metode fjerner baggrunden strømninger, forlader kun den gennemførte aktuelle.
  2. Temperatur afhængige elektrokemiske gating målinger
    1. Bestemme området med temperaturer på interesse. Dette interval er stærkt afhængige af systemet under undersøgelsen, men fysiologisk relevante temperaturer bør anvendes.
      Bemærk: Tidligere undersøgelser har brugt et temperaturområde på 10 ° C til 30 ° C til at studere elektron transport fysiologisk relevante betingelser for mesofil mikroorganismer. 17
    2. Opnå en recirkulerende vandbad eller inkubator til at regulere reaktor temperatur og en kontrol reaktor til at sikre, at sæt punkt og faktiske temperatur på mediet er den samme.
      1. Placere et termometer eller termoelement i en kontrol reaktoren hvor IDA ville være.
    3. Gøre jegSD målinger (Se 3.1.4) over vifte af temperaturer valgt under omsætning og nonturnover (beskrevet taktfast 3.1.5) betingelser ved hjælp af bipotentiostat efter en af de to procedurer beskrives nedenfor.
      1. Generere jegSD vs EG kurver, som beskrevet ovenfor (Se 3.1), for hver temperatur over Temperaturinterval for interesse. For materialer, der udviser redox ledningsevne, som G. svovlreducens og Biocathode MCL, spidsværdien af strømmen fra hver temperatur bruges til at bestemme ISD vs T afhængighed.
        Bemærk: Denne metode er brugt til at generere en fuld jegSD vs EG kurve for hver temperatur, men kræver mere tid end den anden mulighed.
      2. Skiftevis, indstille og hold IDA ved gaten potentielle, der giver maksimal gennemførte aktuelle ved hjælp af bipotentiostat (fremstillet ISD vs EG kurve, trin 3.1.4) og optage den maksimale gennemførte strøm ved hjælp af bipotentiostat mens temperaturen er cyklet mellem vifte af temperaturer valgt ved hjælp af indbyggede kontroller i vandbad eller varmeskab.
        Bemærk: med elektrode-reaktoren geometri anvendes her, ISD og T er tilladt at stabilisere for mindst 20 min. og en gennemsnitlig stabil jegSD bruges til hver temperatur. Mere eller mindre kan stabilisering tid være påkrævet baseret på det specifikke system. Denne metode er hurtigere end først og forårsager mindre stress til biofilm. Dog er fuld gating kurver ikke genereret.
      3. Cyklus temperaturen fra et sæt sted til den anden og tilbage igen ved hjælp af den indbyggede kontrol af rugemaskinen eller vandbad til at bestemme, reversibilitet af reaktion til at sikre, at temperaturen cykling ikke skader biofilm.
    4. Nulstille temperaturen til normal vækst temperaturen ved hjælp af indbyggede kontroller af inkubator eller vand badet og systemet stabiliseres.
      Bemærk: For en redox dirigent, den jegSD versus 1/T data kan være passe med Arrhenius sats udtryk, som tillader beregning af aktiveringsenergi som følger:
      Equation 5
      Equation 6
      hvor Een er aktiveringsenergi for elektron overførsel mellem tilstødende redox cofaktorer og k er Boltzmann konstant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Foranderlig var wired, isoleret og testet for at sikre, at de to elektroder var elektrisk isoleret fra hinanden (figur 1). Reaktorerne var samlet, podes med G. svovlreducensog inkuberes indtil en biofilm bro over kløften mellem elektroderne. G. svovlreducens biofilm kan ses visuelt at dække array. Andre biofilm kan kræve forsker til at gøre en elektrokemisk gating målinger til at se, om de to elektroder har været elektrisk tilsluttet. Mikroskopi bør også anvendes til at kontrollere forbindelsen mellem elektroderne på arrayet. Elektrokemiske gating eksperimenter blev udført for at bestemme afhængighed af jegSD EG (figur 2). Ledningsevne af levende film beregnes derefter ved hjælp af den gennemførte aktuelle målt i gating eksperimenter. Præcision og nøjagtighed af disse målinger var høj på grund af den høje signal til støjforhold muligt med IDA konfiguration. Temperatur afhængighed af jegSD T blev også bestemt sammen med en aktiveringsenergi for elektron transport gennem biofilm (figur 2). Resultaterne her ligner dem tidligere observeret17,18 og støtter den hypotese, at G. svovlreducens og biocathode MCL biofilm opfører sig på samme måde til redox dirigenter hvor elektroner er overført gennem biofilm af hopping mellem redox cofaktorer tæt på modtagerudstyr.

Figure 1
Figur 1: IDA oprette og styre elektrokemiske tests. (A) en IDA, der er blevet kabling og isoleret. Indsatser: Udvidet afbildet af matrixen viser de interdigitated elektroder og en af de store elektrode puder. Separat counter og reference elektroder er placeret i den elektrokemiske celle sammen med IDA at udføre eksperimenter. (B) elektrokemiske kontrolanalyser udstiller elektriske uafhængighed af hver elektrode. Åben kredsløb potentiale af elektrode 2 svarer ikke til de skiftende potentiale af elektrode 1 under CV, der angiver, at elektroderne ikke er kortsluttet og kan bruges til biofilm gating målinger. (C) samme som B, undtagen potentiale af elektrode 2 Skift under CV af elektrode 1, der angiver, at elektroderne er kortsluttet og bør ikke anvendes til gating målinger. Denne IDA blev ikke brugt i yderligere eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: elektrokemiske gating eksperimenter. (A) elektrokemiske gating målinger af et levende, elektrode vokset G. svovlreducens biofilm. Peak formede jegSD-EG kurve er betegnende for usammenhængende, Multi-trins elektron transport gennem biofilm. Gennemførte aktuelle kurven blev opnået ved at fratrække kilden fra afløbet nuværende (og dividere med 2) opnaas ved hver gate potentiale til at fjerne baggrunden strømninger. Eksempler på nuværende rådata taget med VSD = 0 og VSD = 0,01 V, læseren henvises til oplysningerne støtte af tidligere arbejde. 18 (B) temperatur afhængige gating measurementsover en fysiologisk relevante udvalg udstiller en stigning i ledningsevne, som temperaturen er steget, en ejendom observeret for redox dirigenter. 4 (C) Transformation af det ISD -T data og pasform til Arrhenius ligning. Den lineære pasform til Arrhenius ligning er vejledende for en multi-trins elektron overførselsprocessen. Aktiveringsenergi for elektron transport gennem en G. svovlreducens biofilm er beregnet ud fra hældningen af kurven skal være ~0.01 eV, som er i overensstemmelse med elektron transport mellem redox Centre af tilstødende c-Skriv cytokromer, der. 32 , 33 , 34 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under Opsætning af IDA er det kritisk at teste at kilden og afløb ikke er kortsluttet sammen før elektrokemiske gating målinger, som dette vil ændre ISD vs EG kurve og kan føre til fejlagtige resultater og fortolkninger. Det er også afgørende at vælge VSD og v, således at nuværende er lineært afhængig af VSD og uafhængig af v. Hvis dette ikke er tilfældet, kan ikke så de ligninger, der er beskrevet ovenfor udnyttes til at beregne ledningsevne.

Mindst to baggrund strømninger skal betragtes som og fjernet fra gennemførte aktuelle målinger. Først er baggrunden nuværende på grund af Faradaic påfyldning/tømning af redox cofaktorer som gate potentiale er fejet. Denne aktuelle baggrund er stærkt påvirket af mængden af redox cofaktorer, der er adgang til elektrisk tilsluttet elektrode overflade. En anden baggrund nuværende er dobbelt lag kapacitans. En tredje baggrund nuværende skyldes omsætning af metaboliske elektron acceptorer/donorer af celler. Denne aktuelle baggrund finder kun anvendelse på omsætning betingelser. Baggrund strømninger i denne undersøgelse blev elimineret ved at fratrække den nuværende fra afløbet aktuelle fremstillet på VSD kilde = 0,01 V. Denne metode antager, at baggrunden strømme er ens på begge elektroder og kilde-afløb strømme er lig i størrelsesorden på både elektroder, men modsatte i tegn. I dette tilfælde fratrække source og drain strømninger udbytter en gennemført nuværende dobbelt i størrelsesorden og bør være divideret med to. Det skal bemærkes, at denne antagelse kun gælder i grænsen for en lille VSD, som er afhængige af (for G. svovlreducens, VSD< 0,05 V). Større VSD værdier ofte resulterer i forskellige betingelser på hver elektrode og forhindrer denne metode af baggrunden subtraktion bliver brugt. Alternativt, baggrund strømme kan fjernes ved at fratrække kilde og afløb strømninger fremstillet på VSD = 0.0 V fra dem, der opnås på VSD = 0,01 V. Denne metode antager ikke, at baseline strøm af hver elektrode er den samme.

Den teknik beskrevet her er fleksibel. De fleste af de parametre, der er beskrevet i protokollen er afhængige af systemet under undersøgelsen og kan ændres. For eksempel, materiale og dimensioner af IDA kan varieres, kan temperaturområde og vifte af gate potentialer, blandt andre parametre ændres så det passer til behovene i den specifikke undersøgelse. Yderligere, standard mikrobiologisk og elektrokemiske teknikker er tilpasset og udnyttede, at gøre denne protokol egnet til forskere fra en række forskellige studieområder.

Her har vi beskrevet en protokol for at studere elektron transport i levende, elektrode vokset, electroactive biofilm ved hjælp af foranderlig. Foranderlig tidligere er anvendt til at karakterisere elektron transport i tynde film udførelse polymerer og kan være fremstillet ved hjælp af en række standard elektrode materialer og photolithographic teknikker. 2 den primære fordel ved foranderlig er høj signal-støj-forhold på grund af i) den længe serpentine kløft, der skiller de skiftende kilde og afløb elektrode bands og ii) den relativt lille samlede elektrode areal i forhold til hul-størrelse. Elektrode geometri er vigtigt at overveje i gating målinger, fordi dimensionerne elektrode og gap har en stor effekt på signal-støj-forholdet og dermed på nøjagtigheden af ledningsevne målinger. 18

Elektrokemiske gating eksperimenter af levende, elektrode-vokset G. svovlreducens biofilm udstille en klar top formet afhængighed af jegSD på EG, tyder på, at elektronerne transporteres gennem biofilm via usammenhængende, Multi-trins ø, som redox ledende polymerer. 4 , 35 den højeste ledningsevne af G. svovlreducens biofilm blev fundet for at være ~ 4 µS/cm, i samarbejde med tidligere resultater fremkommet under lignende forhold. 17 , gate potentielle for peak ledningsevne er magen til midtpunktet potentielle bemærkede endvidere for G. svovlreducens biofilm under omsætning CV.17 dette er også blevet observeret tidligere og er postuleret for at betyde, at det samme elektron luftfartsselskaber bruges af celler til transport af elektroner som følge af acetat stofskifte bruges også til at bære afgift fra kilde elektrode til afløb elektrode gennem biofilm. Andre dependences af jegSD på EG, som er blevet observeret i forskellige materialer og foreslå en anden mekanisme af elektron overførsel. For eksempel, ISD vs EG kurve af polymer poly(methylthiophene) viser en s-formet kurve og foreslår metallic-lignende elektron overledning. 36 , 37

Gennemførte aktuelle temperatur afhængighed er en afgørende parameter i fastlæggelse af mekanismen af elektron transport gennem ledende materialer. Indtil for nylig havde kun ex-situ prøver været brugt til at undersøge temperatur afhængigheden af gennemført løbende gennem en biofilm. 22 de seneste resultater præsenteret her og andetsteds17 opnået en anden jegSD -T afhængighed ved hjælp af gating målinger og derfor forudsige en multi-Step, usammenhængende hopping mekanisme af elektron transport gennem G. svovlreducens biofilm, der er anderledes end en tidligere foreslåede mekanisme. 22

De store begrænsning af denne teknik og andre lignende geometrier, når de evaluerer elektron transport gennem en mikrobiel biofilm er, at afgiften bevæger lateralt mellem source og drain elektroder placeret i det samme plan på en flad overflade. Den naturlige strøm af elektroner gennem biofilm, dog er vinkelret på den elektrode overflade. Ved hjælp af denne teknik og model, vi omtrentlig biofilm som en homogen film og afhøre elektron flow gennem kun en del af biofilm. Eksperimentelle validering af rumlige heterogenitet af biofilm er stadig nødvendigt at yderligere validere denne teknik. Som beskrevet ovenfor, giver denne metode in situ målinger med den højeste signal til støjforhold rådighed til dato. Denne teknik kan bruges til at studere gratis transport af materiale, der kan interagere med en elektrode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

M.D.Y, S.M.G-S. og LMT anerkender de Office of Naval Research (Award #N0001415WX01038 og N0001415WX00195), Naval Research Laboratory og Naval Research Laboratory nanovidenskab Institute; M.Y.E.-N. understøttes af den amerikanske afdeling af energi tilskud DE-FG02-13ER16415.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Tags

Kemi sag 136 mikrobiel elektrokemi mikrobielle Electrosynthesis Biofilm ledningsevne ekstracellulære elektron Transport tynde Film elektrokemiske Gating
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, M., Strycharz-Glaven, S.,More

Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter