Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Karaktärisera elektrontransport genom levande biofilmer

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/54671
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 3, 1, 4, 5, 1
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

Summary

Ett protokoll för mätning av elektriska conductivityen av levande mikrobiell biofilmer fysiologiskt relevanta villkor presenteras.

Abstract

Här visar vi metoden för elektrokemisk gating används för att karakterisera elektriska conductivityen av elektrod-odlade mikrobiell biofilmer fysiologiskt relevanta villkor. 1 dessa mätningar utförs på levande biofilmer i vattenhaltigt medium med källa och dränera elektroder mönstrade på en glasyta i en specialiserad konfiguration avses som matrisformel interdigitating elektrod (IDA). En biofilm odlas som sträcker sig över gapet ansluta source och drain. Potentialer tillämpas på elektroderna (ES och ED) genererar en källa-drain ström (ISD) genom biofilmen mellan elektroderna. Beroendet av elektrisk ledningsförmåga på gate potential (genomsnittet av de source och drain potentialerna, EG = [ED + ES] / 2) bestäms av systematiskt ändra porten potentiella och mäta det resulterande källa-avloppet aktuella. Beroendet av ledningsförmåga på gate potentiella ger mekanistiska information om extracellulära elektrontransport processen bakom den elektriska conductivityen av den specifika biofilmen under utredning. Den elektrokemiska Usenets mätmetoden som beskrivs här baseras direkt på som används av kollegor och R. W. Murray4,5,6 , M. S. Wrighton2,3 och kollegor i 1980 är för att undersöka tunn film ledande polymerer.

Introduction

Extracellulära elektrontransport (EET) är en process som gör att vissa mikroorganismer att transportera elektroner mellan intracellulära metabola processer och olösliga Elektronacceptorer eller givare som finns utanför cellen, alltifrån naturliga mineraler till elektroderna. I vissa fall kan EET mikroorganismer att bilda elektriskt ledande mång--cell tjocka biofilmer på elektroden ytor, där cellerna inte i direkt kontakt med elektroden fortfarande kan använda den som en metabolisk Elektronacceptor eller givare. Det finns ett stort intresse i sådana biofilmer som elektrod katalysatorer för olika applikationer, såsom mikrobiella electrosynthesis, förorening avkänning och borttagning, och remote energiproduktion och lagring,7,8,9 ,10,11,12,13,14 på grund av mångfalden av metaboliska processer utförs av mikroorganismer och hållbarhet av mikrobiell biofilm jämfört att enzym-baserade bioelectrodes. 15 , 16 dessutom EET vägar kan potentiellt användas till elektriskt kontroll eller signal förändringar i naturligt förekommande eller manipulerade genetiskt mikrobiell metaboliska processer inblandade, exempelvis i produktionen av en önskad produkt eller upptäckt av en target analyten eller stimulans. Den elektriska conductivityen av elektrokatalytiska biofilmer, vilket skiljer dem från andra biologiska material, är en central aspekt av deras elektrokatalytiska egenskaper, men lite är förstås om underliggande EET processen i elektrod-miljön och det som är känt är mycket omtvistade. 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Beskrivs här är en 2-elektrod metod att mäta konduktiviteten genom levande, elektrod-odlade biofilmer använda interdigitating elektrod arrayer (IDAs). IDAs består av parallella rektangulära elektroder mönstrad på planglas yta så att varje andra band är ansluten på motsatta sidor av den matris som resulterar i 2 elektroder (källa och avlopp). Noggrann undersökning av en IDA avslöjar (se exempelvis figur 6.12b i ref #1) att luckorna separera intilliggande band är också ansluten på ett sådant sätt att bilda en enda lucka som väver fram och tillbaka över den matris som skiljer de två elektroderna. Resultatet är en lång och smal lucka separera source och drain elektroderna, vilket ger mycket hög källa-avlopp strömmar när ett elektriskt ledande material är bildade, gjutna, polymeriseras eller över matrisen växt (när det gäller typ av biofilmer som behandlas här). Dessutom, resulterar den lilla storleken på elektroderna i små bakgrund aktuella på grund av kapacitans laddning och ändra i Oxidationstillstånd av det ledande materialet med förändring i gate potential, eftersom mängden material som behövs för att göra ledningsförmåga mätningar med IDAs är så liten. Tekniken med IDA-baserade elektrokemiska gating beskrivs här, utvecklat för att karakterisera tunn film ledande polymerer,2,3,4,25 har först nyligen tillämpats på levande system. 18 en annan teknik som används för att mäta konduktiviteten i levande biofilmer utnyttjade ett stort format split source och drain elektroder och källa meter att ställa in porten potentiella. 26 , 27 dock oro över dessa metoder har varit detaljerad tidigare. 18

Protokollet nedan sammanfattar vår erfarenhet med att göra ledningsförmåga mätningar av levande Geobacter sulfurreducens och biocathode MCL biofilmer. G. sulfurreducens är en modell elektrod minska organismen kan använda olösligt material, inklusive elektroder, som den enda metaboliska Elektronacceptor. Dessutom bildar tjocka biofilmer som klarar att transportera elektroner över flera cell längder, vilket gör det en ideal modellerar organism att studera anodisk långdistans extracellulära elektronöverföring. Vi har även Detaljer för studien av biocathode MCL, en aerob, autotrofa blandade gemenskapen biofilm isolerade från katoden av en bentiska mikrobiella bränsleceller. Biocathode MCL (uppkallad efter de tre primära beståndsdelarna – Marinobacter, Chromatiaceaea och Labrenzia) klarar av oxiderande en elektrod som dess enda elektron donator och transportera elektroner över flera cell längder, vilket gör det ett intressant katodiskt system att studera. Dessutom har biocathode MCL den högsta rapporterade ledningsförmågan för ett levande system hittills med dessa metoder. Införandet av dessa olika elektroaktiva biofilmer i detta protokoll är tänkt att markera att denna teknik är tillämpligt att mäta transport av elektroner genom någon levande biofilm kan elektriskt interagera med elektroder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Interdigitating mikroelektrod array (IDA) förberedelse

  1. Få kommersiellt tillgängliga IDA elektroder mönstrad på ett oledande substrat eller syntetisera dem med vanliga litografiska metoder. 28
    Obs: IDA dimensioner och material kan varieras beroende på önskad villkoren för olika experiment. IDAs används här var erhållits kommersiellt och bestod av två interdigitating guld mikroelektroder mönstrade på en glass substrate ansluten till stora elektroder på motsatta sidor av matrisen. Elektroderna är utsatta medan de busslinjer som ansluter elektroderna till stora kontakt kuddar är belagd med tunn isolerande material. IDAs används här består av två uppsättningar av 10 µm-bred och 2 mm lång guld mikroelektrod band (source och drain) fördelade 5 µm apart mönstrade underlag planglas. IDAs används här hade 65 elektrod par (130 totalt interdigitating band). Alternerande band är anslutna till elektroder på motsatta sidor av matrisen.
  2. Tråd och isolera IDA
    1. Fäst en tråd till varje stor elektrod pad med ledande silver epoxi.
      1. Förbereda konduktiv epoxi enligt tillverkarens anvisningar för den specifika epoxin används med en stav eller pipetten blandningsspets (instruktionerna kan variera beroende på tillverkaren).
      2. Placera en tråd på varje guld pad, säkert på plats med lab tejp. Täcka tråd och pad med silver epoxi med hjälp av en stav eller pipetten blandningsspets.
      3. Flytta försiktigt till 80 ° C ugn för 1 h för att bota eller bota baserat på tillverkarens rekommendationer för specifika ledande silver epoxi används.
      4. Efter epoxin härdar, använda en multimeter för att säkerställa elektrisk anslutning mellan slutet av tråden och kuddar. Resistansen mellan tråd och dynan bör vara < 5 Ω. Också använda multimeterns för att kontrollera att inga ledande epoxy ansluter flera elektroder, så detta kan kort matrisen. Om ledande epoxy ansluter flera leads, använda en skriftlärd för att isolera leads.
    2. Isolera epoxied anslutningen genom beläggning anslutningen med en termisk, elektriska och vattentät isolerande material. Flamskyddsmedel polyuretanhartser är ofta lämpliga.
      1. Ta bort spetsen på ett 15 mL koniskt centrifugrör (vid cirka 2,5 mL märket) som gjutform för det isolerande materialet. Gör två små hål i botten för kablar att sticka ut genom att använda en 21g nål.
      2. In IDA i mögel och sladdar genom hålen i botten av formen.
      3. Förbereda den särskilda isolerande materialet. Följ instruktionerna som följer med specifika kådan erhålls.
      4. Pipettera isolator i formen så att silver epoxin är helt täckt (~2.5 mL) och låt torka enligt tillverkarens specifikationer.

2. elektrokemiska reaktorn installation, testning och inympning

  1. Ställ in den elektrokemiska cellen.
    1. Infoga IDA, counter elektrod och referenselektrod i den elektrokemiska cellen.
      Obs: Elektrokemisk reaktorn används kan variera kraftigt, så länge alla elektroderna passar inuti. Ett övervägande är att referenselektroden så nära som möjligt till arbetselektroden får de praktiska gränserna för reaktorn. Här, använder vi en enda kammare reaktor med referens elektrod ~ 2-3 cm från arbetselektroder. Counter elektroden bör också vara större än arbetselektroden att säkerställa att det inte begränsar i systemet.
    2. Om arbetar med en renkultur, sterilisera reaktorn med counter elektroden inuti. Sterilisera referenselektroden genom blötläggning i blekmedel för 10 min och sterilt avjoniserat vatten för 10 min. sterilisera IDA genom att doppa i blekmedel för 5 s följt av sterilt avjoniserat vatten för 10 s före insättning in i reaktorn.
    3. Fyll den elektrokemiska cellen med sterilt medium passar biofilm tillväxt. För G. sulfurreducens17,18, Använd sötvatten medel exklusive fumarat. 9 Använd för biocathode MCL, konstgjorda havsvatten medium. 9
    4. Anslut elektroderna till en bipotentiostat. Anslut en IDA elektrod till arbetande bly 1, andra IDA elektroden till arbetande bly 2, referenselektroden till referens bly och counter elektroden till counter ledningen.
  2. Elektrokemisk testning av IDAs.
    Obs: Det främsta målet med denna provning är att kontrollera att de två elektroderna är elektriskt isolerad. Alla elektrokemiska tekniker är tillgängliga i den programvara som används för att kontrollera bipotentiostat.
    1. Utföra kontroll ledningsförmåga tester (före biofilm tillväxt) för att säkerställa korrekt IDA funktion med hjälp av en bipotentiostat.
      1. Mått öppen krets potential på varje elektrod för 1 min.
        Obs: På vissa instrument, öppen krets potentiella måste uppnås med hjälp av programmet för insamling av galvanostatic och att nuvarande 0 mA.
      2. Mått öppen krets potential på elektroden 2 medan du utför cyklisk voltametri på elektroden 1 mellan V + 0,2 till 0,6 V (vers hon) vid 20 mV/s.
        Obs: Andra gränser och skanna priser för CV kan användas om så önskas. Dock undvika potentialer som resulterar i väte eller syre generation.
      3. Verifiera att öppna kretsen potentiella mätt på elektroden 2 inte spegel potential av elektrod 1 under CV med programvaran potentiostat.
        Anm: Öppen krets potential av elektrod 2 kan ändras, men det bör vara oberoende av elektrod 1 potential.
      4. Upprepa steg 2.2.1.1 genom 2.2.1.3 utom kontroll potential elektrod 2 och åtgärd öppen krets potential av elektrod 1.
    2. Ange arbetselektroder potential till önskad tillväxtpotentialen i den relevanta elektroaktiva biofilm med programvaran bipotentiostat. Exempelvis använda + 0.5 V (vers hon) för Geobacter sulfurreducens eller +0.31 V (vers hon) för biocathode MCL.
  3. Växa relevanta elektroaktiva biofilm
    1. Inokulera elektrokemiska reaktorn från ett lager kultur/anrikning av önskad elektrokemiskt aktiva mikroorganismerna med standard aseptisk mikrobiologisk teknik. För standardtest, Inokulera i en 1:20 (inokulum till reaktorn volymen) baserat på en OD600 = 0,5 kultur.
    2. Som omrörningen i reaktorn till önskad nivå (~ 200 rpm) och inkubatorn / vattenbad till önskad temperatur baserat på tillväxten villkorar av biofilmen av intresse. För G. sulfurreducens, använda 30 ° C för optimal tillväxt.
    3. Inkubera i systemet baserat på specifika krav av mikroorganismen av intresse tills biofilmen överbryggar klyftan mellan de två elektroderna. För stationära G. sulfurreducens biofilm, inkubera i ~ 7-10 dagar. För biocathode MCL, inkubera ~ 7 dagar. I varje fall styra temperaturen vid 30 ° C.

3. elektrokemiska Usenets experiment

  1. Välj de experimentella parametrar som används för att bestämma aktuell-potential beroendet för Usenets mätningar.
    1. Bestämma området för gate potentialer som kommer att tillämpas på IDA att få genomförda strömmen (ISD) kontra gate potentiella (EG) kurvan för systemet.
      Obs: Spänna av gate potentialer undersökt bör omfatta alla potentialer med möjligt redox aktivitet. Om ingen information om system av intresse finns, bör ett brett potentiella utbud användas (-0.55 till 0,6 V vs. hon). Ett prova tillvägagångssätt kan användas för att finjustera intervallet baserat på systemet under studien. Gate potentiella definieras som:
      Equation 1
      där ED är potentialen för avlopp elektroden och ES är potentialen för källa elektroden. Spänna av gate potentialer används begränsas av de krav och begränsningar av det specifika systemet av intresse. 18
      Obs: Source och drain potentialer som kommer att resultera i syre och väte utveckling bör undvikas eftersom dessa processer kan skada biofilmen.
    2. Bestämma källa-drain spänningen (VSD) som används som drivkraft för elektrontransport genom filmen från källan till avloppet. Källa-drain spänning definieras som:
      Equation 2
      Anmärkning: Källa-drain spänningen bör vara tillräckligt liten så att jagSD skalas linjärt med VSD. 17
    3. Välj en scan hastighet (v) som EG ändras linjärt med tiden som är oberoende av ISD så att systemet kan approximeras för att vara vid steady state för varje potentiell gate.
      Obs: En avsökningshastighet av mindre än 0,002 V/s används ofta för biologiska system. 29 , 30
    4. Ställ in programvaran bipotentiostat att utföra Usenets mätningarna (dvs. sopa grinden potentiella) över det markerade området, på den valda källa-avlopp spänningen och på önskad sökhastighet baserat på ovanstående.
      Obs: för tidigare Usenets mätningar med G. sulfurreducens,17,19 EG =-0.55 V till 0,6 V (vers hon), VSD = 0,01 V eller 0,1 V, v = 0,001 V/s. För Biocathode MCL, EG = 0,25 V till 0,7 V (vers hon), VSD = 0,002 V, v = 0,0002 V/s.
      1. Dessutom utför en baslinjemätning med VSD = 0.000 V (dvs. en CV på varje enskild elektroden tas samtidigt) på samma v valts i steg 3.1.3.
    5. Utföra Usenets mätningar med hjälp av villkor i 3.1.4 under både omsättning (med lösliga elektron donator eller acceptor närvarande) och icke-omsättning (utan lösliga elektron donator eller acceptor) villkor.
      Obs: Icke-omsättning villkor är fördelaktigt eftersom mätningar inte är skyms av oxidation eller reduktion av lösliga föreningar för cellulär metabolism, även om liknande resultat bör erhållas oavsett vilken villkoret används efter subtrahera bakgrunden strömmar (detaljerad i 3.1.8).
      1. Uppnå omsättning villkor genom att använda samma reaktorn medium som används för bakterietillväxt på elektroden. Detta medium innehåller en löslig elektron donator, såsom trenbolonacetat för G. sulfurreducens,17 eller acceptor, som syre för Biocathode MCL.
      2. Uppnå icke-omsättning villkor genom att göra samma reaktorn medium används för bakterietillväxt på elektroden, utom utelämna lösliga elektron donator eller acceptor. Efter att säkerställa att potentiostaten är avstängd, ta bort mediet aseptiskt och lägga i färskt medium utan elektron givaren för anodisk system eller acceptor för katodiskt system. Alternativt kan ett kontinuerligt flödessystem inrättas långsamt ersätta mediet med det önska mediet för nonturnover villkor.
        Obs: Om syre är de lösliga Elektronacceptor (när det gäller biocathode MCL), sparge systemet med en blandning av ~ 15% CO2 och 85% N2 (eller en gasblandning som kommer att upprätthålla rätt pH i medium).
    6. Efter slutförandet av de portande mätningarna, Använd programvaran potentiostat för att ställa varje elektrod potential tillbaka till tillväxt potential att låta systemet åter stabilisera (med samma värden som i 2.2.2).
    7. Om alla de villkor som beskrivs ovan är uppfyllda (jagSD är oberoende av v och skalas linjärt med VSD), konvertera jagSD värden till ledningsförmåga med hjälp av följande ekvationer som tidigare beskrivits31
      Equation 3
      Equation 4
    8. där G är konduktans och S är en skalningsfaktor som är beroende, och faktorer i variabler såsom elektrod storlek, gap storlek och biofilm höjd. För vissa system, kan S bestämmas från förutbestämda ekvationer. 31 alternativt S kan beräknas numeriskt använder en modellering programvara, som beskrivs tidigare. 17
    9. Subtrahera bakgrunden strömmarna för att identifiera den form och omfattning av de genomförda nuvarande. Antingen subtrahera den nuvarande genereras vid VSD = 0,00 V från nuvarande genereras vid VSD = 0,01 V eller subtrahera avloppet nuvarande från källan nuvarande genereras med en VSD = 0,01 V. antingen metod tar bort bakgrunden strömmar, lämnar endast den genomförda nuvarande.
  2. Beroende av elektrokemiska Usenets temperaturmätningar
    1. Bestämma området för temperaturer av intresse. Detta intervall är starkt beroende av systemet under studien, men fysiologiskt relevanta temperaturer bör användas.
      Obs: Tidigare studier har använt en temperatur mellan 10 ° C till 30 ° C för att studera elektrontransport fysiologiskt relevanta villkor för innehåll mikroorganismer. 17
    2. Få en recirkulerande vattenbad eller inkubator att reglera reaktorn temperatur och en kontroll reaktor att säkerställa att börvärdet och faktisk temperatur av medlet är samma.
      1. Placera en termometer termoelement i en kontroll-reaktor där IDA skulle vara.
    3. Göra jagSD mätningar (se 3.1.4) över spänna av temperaturer som markerats under omsättning och nonturnover (som beskrivs i steg 3.1.5) villkor med hjälp av den bipotentiostat som följer en av de två procedurer som beskrivs nedan.
      1. Generera jagSD vs EG kurvor, som beskrivits ovan (se 3.1), för varje temperatur över temperaturområdet sevärdheter. För material som uppvisar redox ledningsförmåga, såsom G. sulfurreducens och Biocathode MCL, toppströmmen från varje temperatur används för att avgöra ISD vs T beroende.
        Obs: Denna metod används för att generera en fullständig jagSD vs EG kurvan för varje temperatur, men kräver mer tid än det andra alternativet.
      2. Alternativt ställa och håll IDA vid grinden potentiella som ger maximal genomförde nuvarande använder bipotentiostat (erhålls från jagSD vs EG kurva, steg 3.1.4) och registrera den maximala bedrivs ström med hjälp av bipotentiostat medan temperaturen är cyklade mellan utbudet av temperaturer som valts med hjälp av inbyggda kontrollerna av vattenbad eller inkubator.
        Obs: med elektrod/reaktorn geometri används här, jagSD och T är tillåtna att stabilisera för minst 20 min och i genomsnitt stabila jagSD används för varje temperatur. Mer eller mindre stabilisering tid kan krävas baserat på specifika systemet. Denna metod är snabbare än först och orsakar mindre stress att biofilmen. Dock genereras full Usenets kurvorna inte.
      3. Cykla temperaturen från ett börvärde till det andra och tillbaka igen med hjälp av de inbyggda kontrollerna av inkubatorn eller vattenbad att bestämma reversibiliteten av reaktionen att säkerställa att temperaturen cykling inte skadar biofilmen.
    4. Återställa temperaturen normal tillväxt temperaturen med hjälp av inbyggda kontrollerna av inkubator eller vatten bad och låt systemet stabiliseras.
      Obs: För en redox dirigent, jagSD kontra 1/T data kan passa med Arrhenius rate uttrycket, som tillåter beräkning av aktiveringsenergin enligt följande:
      Equation 5
      Equation 6
      där Een är aktiveringsenergin för elektronöverföring mellan intilliggande redox kofaktorer och k är Boltzmanns konstant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

IDAs var fast, isolerade och testade för att säkerställa att de två elektroderna elektriskt isolerade från varandra (figur 1). Reaktorerna var monterade, inokuleras med G. sulfurreducensoch inkuberas tills en biofilm överbryggat klyftan mellan elektroderna. Den G. sulfurreducens biofilmen kan visuellt ses till att täcka matrisen. Andra biofilmer kan kräva forskaren att göra en elektrokemisk Usenets mätningar för att se om de två elektroderna elektriskt har anslutits. Mikroskopi bör också användas för att kontrollera anslutningen mellan elektroderna i matrisen. Elektrokemiska Usenets experiment utfördes för att bestämma beroendet av jagSD på EG (figur 2). Conductivityen av levande filmen beräknas sedan med genomförda nuvarande mätt i Usenets experiment. Den precision och noggrannhet i mätningarna var hög på grund av den hög signalen-brus-förhållande som är möjligt med IDA konfigurationen. Temperaturberoendet av ISD på T fastställdes också tillsammans med en aktiveringsenergin för elektrontransport genom biofilmen (figur 2). Resultaten här liknar de tidigare observerade17,18 och stöder hypotesen att G. sulfurreducens och biocathode MCL biofilmer beter sig på samma sätt till redox ledare där elektronerna är överförs via biofilmen genom att hoppa mellan redox kofaktorer nära i närheten.

Figure 1
Figur 1: IDA ställa in och kontrollera elektrokemiska tester. (A) en IDA som har trådbunden och isolerade. Infällt: Förstorad avbildad i matrisen visar interdigitating elektroderna och en av de stora elektroder. Separata räknare och elektroderna placeras i den elektrokemiska cellen tillsammans med IDA att utföra experiment. (B) elektrokemiska kontrollundersökningar uppvisar elektriska oberoende av varje elektrod. Öppen krets potential av elektrod 2 svarar inte på elektroden 1 föränderlig potential under CV, som anger att elektroderna inte är kortsluten och kan användas för biofilm gating mätningar. (C) samma som B, utom potentialen av elektrod 2 Skift under CV av elektrod 1, som anger att elektroderna är kortsluten och bör inte användas för gating mätningar. Denna IDA användes inte i ytterligare experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: elektrokemisk gating experiment. (A) elektrokemiska gating mätningar av en levande, elektrod vuxit G. sulfurreducens biofilm. Topp formade jagSD-EG kurvan är vägledande av osammanhängande, flerstegs elektron transport genom biofilmen. Genomförda nuvarande kurvan erhölls genom att subtrahera källan från avloppet nuvarande (och dividera med 2) erhållits vid varje gate potential att eliminera bakgrund strömmar. Exempel på aktuella rådata tagna med VSD = 0 och VSD = 0,01 V, hänvisas till tidigare arbete stödja Information. 18 (B) temperaturberoende gating measurementsover ett fysiologiskt relevanta utbud som uppvisar en ökning i ledningsförmåga när temperaturen ökas, en fastighet observerats för redox ledare. 4 (C) omvandling av ISD – T data och passform till Arrhenius ekvation. Linjär anpassa till Arrhenius ekvation är indikativt för en process med flera steg elektron i överföring. Aktiveringsenergin för elektrontransport genom en G. sulfurreducens biofilm beräknas utifrån lutningen på kurvan till vara ~0.01 eV, vilket överensstämmer med elektrontransport mellan redox centra av intilliggande c-Skriv subfamiljen. 32 , 33 , 34 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under installationen av IDA är det viktigt att testa att källan och avloppet inte är kortsluten tillsammans före elektrokemiska Usenets mätningar, eftersom detta kommer att förändra jagSD vs EG kurva och kan leda till felaktiga resultat och tolkningar. Det är också viktigt att välja VSD och v så att nuvarande är linjärt beroende av VSD och oberoende av v. Om detta inte är fallet, inte kan sedan ekvationerna ovan användas för att beräkna ledningsförmåga.

Minst två bakgrund strömmar skall betraktas och avlägsnas från genomförda aktuella mätningar. Först är bakgrunden aktuella på grund av Faradaic fyllning/avtappning av de redox kofaktorer som gate potential är svepte. Denna bakgrund nuvarande påverkas kraftigt av mängden redox kofaktorer som nås elektriskt ansluten till elektrod ytan. En andra bakgrund som är aktuella är dubbla lager kapacitans. En tredje bakgrund nuvarande är på grund av omsättning av metabola elektron acceptorer/givare av celler. Denna bakgrund som är aktuella är endast tillämpligt på omsättning villkor. Bakgrunden strömmar i denna studie var elimineras genom att subtrahera källan nuvarande från avloppet nuvarande erhålls vid VSD = 0,01 V. Denna metod förutsätter att bakgrunden strömmarna är lika på båda elektroderna och källa-drain strömmarna är lika i storlek på både elektroder, men med omvänt tecken. I detta fall subtrahera source och drain strömmarna ger en genomförde nuvarande dubbel i storleksordning och bör vara dividerat med två. Det bör noteras att detta antagande bara gäller i gränsen på en liten VSD, som är system beroende (för G. sulfurreducens, VSD< 0.05 V). Större VSD värden ofta resulterar i olikartade villkor på varje elektrod och förhindrar denna metod av bakgrunden subtraktion används. Alternativt, bakgrunden strömmar kan tas bort genom att subtrahera källa och rinna strömmar som erhålls vid VSD = 0,0 V från de som uppnås vid VSD = 0,01 V. Denna metod antar inte att baslinjen strömmar av varje elektrod är desamma.

Den teknik som beskrivs här är flexibel. De flesta av de parametrar som beskrivs i protokollet är beroende av systemet under studien och kan ändras. För material och dimensioner av IDA till exempel kan varieras, kan av temperaturområde, och utbudet av gate potentialer, bland andra parametrar ändras för att passa behoven hos särskilda studien. Ytterligare, standard mikrobiologiska och elektrokemiska tekniker är anpassade och utnyttjad, vilket gör detta protokoll lämplig för forskare från en mängd olika ämnesområden.

Här har vi beskrivit ett protokoll för att studera elektrontransport i levande, elektrod vuxit, elektroaktiva biofilmer med IDAs. IDAs har använts tidigare för att karakterisera elektrontransport i tunn film ledande polymerer och kan vara fabricerade med hjälp av olika standard elektrodmaterial och photolithographic tekniker. 2 den främsta fördelen med IDAs är hög signal-brus baserat på grund av i) lång serpentin klyftan som separerar alternerande källan och dränera elektrod band och ii) relativt liten total elektrod ytan jämfört med gap storleken. Elektroden geometri är viktigt att beakta i gating mätningar eftersom elektroden och gap dimensionerna har stor effekt på signal-brusförhållande och därför på noggrannheten i mätningarna för konduktivitet. 18

Elektrokemiska gating experiment av levande, elektrod-odlade G. sulfurreducens biofilmer uppvisar en tydlig topp formade beroende av ISD på EG, vilket tyder på att elektroner transporteras genom biofilmen via osammanhängande, flera steg hopping, liksom redox ledande polymerer. 4 , 35 den G. sulfurreducens biofilmen peak ledningsförmåga befanns vara ~ 4 µS/cm, i samförstånd med tidigare resultat genereras under liknande förhållanden. 17 vidare utfärda utegångsförbud för potentiella för peak ledningsförmåga är liknande till mittpunkten potentiella observerats för G. sulfurreducens biofilmer under omsättning CV.17 detta har också observerats tidigare och är postulerade för att innebära att samma elektron bärare används av celler för transport av elektroner som följd av acetat metabolism används också att bära kostnadsfritt från källa elektroden till avloppet elektroden genom biofilmen. Andra beroenden av ISD på EG, som har observerats i olika material och föreslår en annan mekanism av elektronöverföring. Till exempel jagSD vs EG kurvan för den polymer poly(methylthiophene) visar en s-formad kurva och föreslår metallic-liknande elektron överledning. 36 , 37

Temperaturberoendet av genomförda nuvarande är en kritisk parameter för att fastställa mekanismen för elektrontransport genom ledande material. Tills nyligen hade endast ex situ prover använts för att undersöka temperaturberoendet av genomförda ström genom en biofilm. 22 senaste resultat som presenteras här och annorstädes17 erhålls en annan jagSD – T beroendet med hjälp av Usenets mätningar och därför förutsäga en flerstegs, osammanhängande hoppande mekanismen av elektron transport genom G. sulfurreducens biofilmer, som är annorlunda än en tidigare föreslagna mekanismen. 22

Den största begränsningen av denna teknik och andra liknande geometrier när du utvärderar elektrontransport genom en mikrobiell biofilm är att laddningen flyttas sidled mellan käll- och avloppet elektroderna placeras i samma plan på en plan yta. Det naturliga flödet av elektroner genom biofilmen, är dock vinkelrätt mot elektrod ytan. Med denna teknik och modell, vi approximera biofilmen som en homogen film och förhöra elektronflödet genom endast en del av biofilmen. Experimentell validering av biofilmen rumslig heterogenitet är fortfarande nödvändigt att ytterligare validera denna teknik. Som beskrivits ovan, kan dock denna metod i situ mätningar med den högsta signalen-brusförhållandet tillgänglig till-datumet. Denna teknik kan användas för att studera kostnadsfritt transport av material som kan interagera med en elektrod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

M.D.Y, S.M.G-S. och LMT erkänna Office av marin forskning (Award #N0001415WX01038 och N0001415WX00195), den Naval Research Laboratory och Naval Research Laboratory nanovetenskap Institutet; M.Y.E.-N. stöds av den amerikanska institutionen av energi Grant DE-FG02-13ER16415.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IDAs CH Instruments 012125 Manufactured by ALS-Japan; sold by CH Instruments
Wire Digikey W7-ND
Conductive silver epoxy Electron microscopy sciences 12670-EE
Insulating material 3M 2131-B Scotchast flame retardant compound
15 mL conical centrifuge tube VWR 89004-368
21g needle VWR BD-305165
5 mL pipette tips VWR 82018-842
5 mL pipettor VWR 89079-976
Freshwater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Ammonium chloride
    Sodium phosphate monobasic
    Sodium bicarbonate
Artificial seawater medium components Sigma Aldrich All standard laboratory chemicals
    Sodium chloride
    Magnesium chloride hexahydrate
    Magnesium sulfate heptahydrate
    Potassium chloride
    Sodium bicarbonate
    Calcium chloride dihydrate
    Ammonium chloride
    Potassium phosphate dibasic
Ag/AgCl reference electrode Basi MF-2079
Graphite rod counter electrode Electron microscopy sciences 70230
Recirculating water bath Thermo Scientific 152-5256
Bipotentiostat Pine Instruments WD-20 http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
Stir bars VWR 58947-114
G. sulfurreducens culture ATCC 51573
Jacketed reactor Pine Instruments RRPG085

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247 (2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Tags

Kemi fråga 136 mikrobiell elektrokemi mikrobiell Electrosynthesis Biofilm ledningsförmåga extracellulär elektrontransport tunn Film elektrokemiska Gating
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yates, M., Strycharz-Glaven, S.,… More

Yates, M., Strycharz-Glaven, S., Golden, J., Roy, J., Tsoi, S., Erickson, J., El-Naggar, M., Calabrese Barton, S., Tender, L. Characterizing Electron Transport through Living Biofilms. J. Vis. Exp. (136), e54671, doi:10.3791/54671 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter