Abstract
Døgnrytmen ure er funktionelle i alle lysfølsomme organismer, der giver mulighed for en tilpasning til den ydre verden ved at foregribe daglige miljøforandringer. Der er gjort betydelige fremskridt i vores forståelse af den stramme forbindelse mellem døgnrytmen ur og de fleste aspekter af fysiologi i feltet i det sidste årti. Men unraveling den molekylære basis, der ligger til grund for funktionen af døgnrytmen oscillator i mennesker forbliver af højeste teknisk udfordring. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af en eksperimenterende tilgang til langsigtet (2-5 dage) bioluminescens optagelse og udstrømning medium kollektion i dyrkede humane primære celler. Til dette formål har vi transduceret primære celler med en lentiviral luciferase reporter, der er under kontrol af en kerne ur genpromotor, der tillader den parallelle vurdering af hormonsekretion og døgnrytmen bioluminescens. Desuden beskriver vi betingelserne for at forstyrre døgnrytmen ur i PRimary humane celler ved transfektion siRNA targeting ur. Vores resultater på circadian regulering af insulinsekretion ved humane pancreas-øer, og myokine sekretion fra humane skeletmuskelceller, præsenteres her for at illustrere anvendelsen af denne metode. Disse indstillinger kan bruges til at studere den molekylære sammensætning af humane perifere ure og analysere deres funktionelle virkninger på primære celler under fysiologiske eller patofysiologiske tilstande.
Introduction
Det døgnrytmen timing systemet (fra latin "Circa diem") er dukket op i alle lysfølsomme organismer, som en adaptiv mekanisme til rotation af Jorden. I pattedyr er det organiseret i en hierarkisk måde, der omfatter den centrale ur, som er beliggende i suprachiasmatic nucleus af den ventrale hypothalamus, og perifer (eller slave) oscillatorer, der er operativ i forskellige organer. Desuden er disse celleautonom selvbærende oscillatorer er funktionelle i næsten hver eneste celle i kroppen 1. Photic signaler repræsenterer en dominerende synkronisering cue (zeitgeber) for SCN neuroner, hvorimod neurale og humorale signaler stammer fra SCN nulstille perifere ure. Derudover hvile-aktivitet rytmer, der kører til gengæld fodring-fastende cykler, er yderligere synchronizers for perifere ure 2. Ifølge vores nuværende forståelse, er den molekylære sammensætning af kernen ur baseret på transkriptionel og oversætnelle feedback-sløjfer, som er konserveret mellem organismer. Dette omfatter transkriptionelle aktivatorer BMAL1 og ur, der tilsammen aktiverer transskription af de negative core clock PER og råb gener. Høje niveauer af PER og råb proteiner vil hæmme deres egen transskription gennem hæmning af BMAL1 / CLOCK kompleks. En ekstra sløjfe består af de nukleare receptorer REV-Erbs og lene, som også regulerer transkription af BMAL1 og CLOCK. Desuden posttranslationelle begivenheder, herunder fosforylering, sumoylation, acetylering, O-GlcNAcylation, nedbrydning og nuklear bogføring af centrale ur proteiner udgør en yderligere vigtig regulerende lag i oprettelse af 24 timers svingning cyklus 3.
Akkumulerende beviser stammer fra studier i gnavermodeller og fremhæver den afgørende rolle døgnrytmen system i koordineringen af metaboliske og endokrine funktioner 4-5. En række kore-skala transkriptom analyse finder, at fodring - fastende cyklusser spiller en central rolle i synkroniseringen af perifere oscillatorer 6-8. I en aftale med disse undersøgelser, har metabolomisk og lipidomic analyse hos gnavere og mennesker viste, at et stort antal metabolitter oscillere i væv, plasma og spyt i et døgnrytmen måde 9-11. Vigtigere, de fleste hormoner udviser døgnrytmer i blod 5,12-13. Desuden kan døgnrytmen ure den tilsvarende hormon producerer perifere væv regulere hormon sekretion lokalt. Celle-autonom cirkadiske oscillatorer er blevet beskrevet i gnavere og humane pancreas-ø-celler 14-16. Disse oscillatorer spiller en væsentlig rolle i reguleringen af pancreas-ø transkriptom og funktion 15,17-18. Desuden myokine sekretion af menneskelige skelet myorør er for nylig blevet demonstreret at udvise en døgnrytmen mønster, som reguleres af celle-autonome oscillators operative i disse celler 19.
Flere metoder til at studere døgnrytmen hos mennesker in vivo er ofte blevet brugt. For eksempel har plasma melatonin eller cortisolniveauer samt thorax hudoverfladen temperatur (gennemgået i referencerne 3,20) blevet undersøgt for at vurdere endogene cirkadiske ure. Selv om disse metoder tillader studerer systemiske cirkadiske svingninger i vivo, de er langt fra at give en pålidelig vurdering af fritløbende autonome døgnrytmen i forskellige organer og væv. Ikke desto mindre vil en sådan dissektion fra den systemiske regulering være et uundværligt redskab til at forstå den specifikke effekt af intracellulære molekylære ure på funktionen af disse celler. Derfor er der foretaget en betydelig indsats for at udvikle pålidelige metoder til at studere menneskelige ure i immortaliserede eller primære dyrkede celler synkroniseret in vitro. Vigtigere er det blevet påvist, atur egenskaber målt i dyrkede primære hudfibroblastceller nøje afspejler de enkelte ur egenskaber af hele organismen 21. Udviklingen af fluorescerende og bioluminiscerende døgnrytmen journalister har i høj grad avancerede denne tilgang 22-27. Desuden studerer primære celle ure, der er afledt af forskellige perifere organer giver mulighed for undersøgelse af de molekylære egenskaber af humane vævsspecifikke ure 3,5,16,19-20,28. Således vurdering af døgnrytmen ure i in vitro-synkroniserede primære eksplantater eller celler, ved hjælp af bioluminescerende reportere, repræsenterer en meget nyttig metode til at studere den molekylære sammensætning af humane perifere ure og deres indvirkning på organfunktion.
I denne artikel vil vi præsentere detaljerede protokoller til vurdering døgnrytmen genekspression i humane primære ø og skelet muskelceller synkroniseret in vitro samt virkningen af autonome cellulære urforstyrrelser på den sekretoriske funktion af disse celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Manipulationer inkluderet i denne protokol, blev godkendt af den etiske komité i Genève Universitetshospital og den Etisk Udvalg SUD EST IV (aftale 12/111) 19. Humane øer blev isoleret fra bugspytkirtler fra hjernedøde multi-organdonorer i Islet transplantation Center ved University Hospital i Geneve (Schweiz) som beskrevet af os i referencerne 16,18, eller hidrører fra en kommerciel kilde.
1. Fremstilling af primær cellekultur
- Menneskelig Pancreas Islet Isolation, Dissociation og Kultur
BEMÆRK: Coat hver rør, plast spids eller pipette med Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) medium for at forhindre holme eller ø-celler klistrer til plastoverfladen, hvilket kan føre til et betydeligt tab af cellemateriale.- En dag før øcelle dissociation tilsættes 1 ml laminin-5-rig ekstracellulær matrix (afledt af 804G celler som descriseng i henvisning 29) pr 3,5 cm skål. Før plating celler, aspireres matricen og vask fadet 3 gange med sterilt bi-destilleres vand. Skålen at tørre under den laminare strømning i 5 min.
- Inde i laminar strømning, distribuere de opnåede øer med CMRL medium til 15 ml røret (rørene). Centrifuger ved 272 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten, og derefter pellet resuspenderes i 1 ml sterilt Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) forvarmet til 37 ° C uden calcium og magnesium. Centrifuger ved 272 xg i 5 min.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml DPBS.
- At tælle det totale antal øer, pipette 10 pi fra 1 ml ø-suspensionen i en ny 3,5 cm skål. Tæl antallet af øer i 10 pi dråbe under mikroskop og fra dette beregne det samlede antal øer i 1 ml ø-suspension. Tilsættes 14 ml DPBS og centrifuger cellesuspensionen endnutid på 272 xg i 5 min.
- For øcelle dissociation, aspireres supernatanten, og der tilsættes 1 ml af celle løsrivelse løsning til maksimalt 1.000 ø ækvivalenter (iEQ). Glasset anbringes i et vandbad ved 37 ° C og blandes forsigtigt øerne ved pipettering op og ned flere gange hvert minut i løbet af 6-10 min.
BEMÆRK: For at kontrollere fordøjelsen kvalitet, pipetteres en 2 pi dråbe suspension på et objektglas og tjek under mikroskop, at alle celler er godt adskilt, og at der ikke dubletter eller celleklumper er forblevet. - Reaktionen standses ved tilsætning af 14 ml kold CMRL med supplementer (10% føtalt bovint serum (FBS), 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% penicillin-streptomycin (P / S), 1% gentamycin, 1 % natriumpyruvat). Centrifuger ved 425 xg i 5 min. Aspirere supernatanten, og der tilsættes 15 ml CMRL medium til cellepelleten.
- Pellet resuspenderes i et lille volumen af CMRL med kosttilskud. Tæl antallet af celler under mikroskop under anvendelse af en hemocytometer, justere CMRL volumen for at opnå en cellekoncentration på ~ 650, 000 celler / ml.
- Pipetter 3 adskilte dråber 100 pi hver fra den dispergerede cellesuspension opnået i trin 1.1.8 i en 3,5 cm skål pre-coatet med laminin.
BEMÆRK: Celler tillægger fadet i omkring 24 timer. - Inkuber celler (figur 1A) i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C i et fugtigt kammer. Skift medium af cellen dråber hver 2-3 dage ved sugning 100 pi fra hver dråbe og erstatte det med det samme volumen frisk medium.
- Humane primære myoblast Kultur og differentiering til Myorør
- Tissue biopsi, satellit celle isolation og myoblast kultur
Bemærk: Muskelbiopsier blev opnået fra gruppen af Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Frankrig) 19.- Oprens primære skeletmyoblaster ifølge den tidligere beskrevne procedure 30.
- differentiering primær menneskelige myoblaster i myorør
- Tag et hætteglas (1 x 10 6 celler) af humane myoblaster lagret i flydende nitrogen og optøning celler hurtigt ved at sætte hætteglasset i 30 sek til 1 min i et vandbad ved 37 ° C under omrøring.
- Pipetter celler (1 ml) i 24 ml vækstmedium sammensat af HAM F-10 suppleret med 20% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amphotericin B.
- Centrifuger i 5 minutter ved 150 x g.
- Fjern supernatanten og resuspender cellerne med 15 ml frisk vækstmedium pr 2,5 x 10 5 celler.
- Plade mindst 2,5 x 10 5 celler pr F75 vedhængende kolbe. Opbevar myoblaster i en celle inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Når cellerne når 60-80% konfluens, dissociere celler med trypsin-EDTA 0,05% for 1-2 min og plade dem i 2 ml vækstmedium for adhærente 3,5 cm petriskåle.
- Efter at have nået konfluens, fjernes vækstmediet.
- Start differentieringen protoKOL af humane myoblaster til myotuber ved dyrkning deraf i 2 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 1 g / l glucose, 2% FBS, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amphotericin B (differentiering medium) i en celle inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Skift medium hver 2 til 3 dage.
BEMÆRK: Myorør dannes sædvanligvis inden for 7-10 dage. - Check muskel celledifferentiering under mikroskopet (figur 2A) ved at observere fusionen af myoblaster i polynukleære myorør 19.
- Tissue biopsi, satellit celle isolation og myoblast kultur
2. Små interfererende RNA (siRNA) Transfektion
- siRNA Transfektion af humane ø-celler
BEMÆRK: transfektionsprotokol udføres i dråber af 100 pi på den næste dag efter celledissociering (trin 1.1.1-1.1.10).- Aspirer 100 pi af CMRL medium fra hver dråbe og erstatte det med det samme volumen af serumfrit Minimal Essential Medium (MEM) 2 tfør transfektion ved pipettering.
- Forbered en MEM-baseret blanding af transfektionsreagens og 50 nM mål siRNA (siClock) eller 50 nM af ikke-targeting siControl i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- For en skål med 3 dråber forberede to 1,5 ml rør med 200 pi MEM hver.
- Tilføj til et af disse rør 4 pi transfektionsreagens.
- Tilføj til det andet rør 1 pi af den passende siRNA stamopløsning (20 uM).
- Omrør disse to rør langsomt om orbitalryster i 5 minutter og derefter blandes indholdet af rørene sammen og agitere for 20 mere min.
- Aspirer 100 ul MEM fra hver dråbe og erstatte det med det samme volumen af transfektion mix opnået i det foregående trin ved pipettering.
- Erstatte transfektion løsning med CMRL medium efter 4 timer inkubation ved 37 ° C. Gentag trin 2.1.1-2.1.3 den følgende dag for cellegenvalg transfektion.
- siRNA Transfektion of Human Myorør
- Før transfektion, udskifte mediet (se trin 1.2.2.8) med 2 ml frisk differentiering medium pr 3,5 cm petriskål.
- I et sterilt 1,5 ml rør fremstilles en blanding af 20 nM siRNA (siControl eller siClock), hvilket svarer til 2,4 pi af en 20 pM siRNA opløsning, og 12 pi transfektionsreagens fortyndet i 100 pi differentiering medium. Inkuber opløsningen ved stuetemperatur i 15 minutter under forsigtig omrøring.
- Transficere celler med 114,4 pi af siRNA mix pr 3,5 cm petriskål og placere celler i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
3. Kontinuerlig Langsigtet Circadian Bioluminescens Optagelse udføres parallelt med vurdering af hormon sekretion i levende menneske Primære celler
- Introduktion døgnrytmen bioluminescens Journalister i humane primære celler vedlentiviral Transduktion
BEMÆRK: Alle procedurer med lentivirale partikler skal udføres i et biosikkerhed niveau 2 facilitet til at tage ekstra forholdsregler for arbejde med stoffer, der udgør en moderat potentiel fare for personale og miljø.- Forbered reporter lentiviral partikler ved co-transfektion vektoren af interesse pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc eller pLV156-Per2-dLuc (kaldet Bmal1-luc og Per2-luc, henholdsvis) plasmid 31 med lentivirusvektorer pMD2G og psPAX i 293T-celler ved hjælp af polyethylenimin-metoden (for detaljeret procedure se reference 16).
- Titreres de opnåede lentivirale partikler (kan fås oplysninger om titrering på http://lentilab.unige.ch/). For yderligere forsøg, bruge lentivira med titre spænder 10 4 til 10 5 transducerende enheder [TU / ul].
- Place retter med humane ø-celler eller humane myoblaster (ved 30-50% konfluens) inde i laminar flow kabinenet og erstatte mediet med 2 ml frisk suppleret CMRL medium (se trin 1.1.7) eller vækstmedium (se trin 1.2.2.2), hhv.
- Beregn infektionsmultiplicitet (MOI) (dvs. infektiøse partikler (transducerende enheder) / antal celler).
- Transducere den primære cellekultur ved pipettering lentivirus opløsning i skålen for at opnå en MOI = 3 (for eksempel til 65.000 vedhæftede celler tilsættes 3 pi af virus løsning med titeren af 6,5 x 10 4 til 100 ul medium dråbe).
- Inkuber natten over i en vævskultur-inkubator. Skift medium den næste dag.
BEMÆRK: transducere humane øceller mindst 4 dage før bioluminescens optagelse for at opnå tilstrækkelig ekspression af reporter-konstruktionen. Myoblaster transduceres i ekspansionsfasen, derefter vokset til sammenløb, og efterfølgende differentieret i myorør.
- In vitro Synkronisering af humane primære celler
- <li> Tilføj 10 uM adenylylcyclase aktivator i 2 ml medium pr 3,5 cm petriskål indeholdende de primære celler, der tidligere transduceret i trin 3.1.5.
- Inkuber i 60 minutter ved 37 ° C i en cellekultur inkubator.
- Skift medium indeholdende adenylylcyclase aktivator med 2,5 ml af registreringsmediet indeholdende 100 uM luciferin.
BEMÆRK: For humane øceller bruge CMRL suppleret med 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 1% gentamycin; for humane myorør bruge phenolrødt - frit DMEM med 1 g / l glucose suppleret med 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amphotericin B.
4. Parallel Vurdering af Circadian Bioluminescens Optagelse og hormon sekretion Profiler i Synkroniseret Menneskelig Sekretorisk Primære celler
- Opsætning Langsigtet Konstant perifusion og Bioluminescens Recording for humane primære celler.
BEMÆRK: Når der arbejder outsIDE laminar flow kabinet, rene alle kontaktflader og begrænse eksponering af kulturer eller medium til luften for at undgå forurening.- Til fremstilling af perifusion medium, tilsættes 100 uM luciferin til mediet.
BEMÆRK: For humane øceller bruge CMRL suppleret med 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 1% gentamycin; for humane myorør bruge phenolrødt - frit DMEM med 1 g / l glucose suppleret med 2% FBS, 2% L-alanyl-L-glutamin dipeptid, 1% P / S, 0,5% gentamycin og 0,2% amphotericin B. - Inde i laminar strømning, åbne 3,5 cm skåle indeholdende de transducerede, transficerede og synkroniserede primære cellekulturer (øceller eller myorør) som beskrevet ovenfor. Indsæt sterile metalliske hætter (udviklet i huset) (Figur 1B2) i 3,5 cm skåle, der er udstyret med silikone tilstrømning / efflux forbinder rør (Figur 1B1 / B5).
- Placer retter på målingen platformen i 37 ° C light-tight inkubator. Fastgør retter til platformen ved hjælp af en skrues adapter (Figur 1B3). Sæt tilstrømning / efflux rør af perifusion systemet i de passende siliconeslanger af hætten (Figur 1B1 / B5) og indstille hastigheden af pumpen ved en strømningshastighed på ~ 0,5 ml medium pr 1 time.
- Åbn egenudviklede Dryp-biolumicorder software, der registrerer signalerne fra fotomultiplikatorrøret (PMT) detektor. Valgte den mappe, hvor dataene skal lagres og starte kontinuerlig bioluminescens optagelse fra hver skål ved at klikke på ikonet "start".
BEMÆRK: Alternativt til Drip-biolumicorder software, andre programmer (f.eks LumiCycle), kan bruges til at optage signaler fra PMT-detektor. - Placer sterile 6-brønds vævskulturplader i samlingen boksen på is.
- Åbn kontrol software, der styrer timingen af den automatiske afbryder blandt indsamling brønde. Indstil tiden window af medium samling (sek). Start samling af udstrømning medium hver 4 time (14.400 sek ~ 2 ml pr time-point) ved at klikke på "run" ikonet.
- Overfør og måle udstrømningen medium fra hver kollektion godt i sterile 2 ml rør ved pipettering. Hold rør i en -20 ° C fryser, før du starter det næste skridt. Gentag trin 4.1.5-4.1.6 hver 24 timer.
- Stop bioluminescens optagelse og mediet flow ved at klikke på "stop" ikonet på den tilsvarende software. Fjern de metalliske hætter og suge det resterende medium fra servicet.
- For at normalisere det secernerede protein, der opnås i forskellige eksperimenter, enten ekstrahere DNA (normalisering af genomisk DNA-indhold for myorør 19), eller tilsættes 1 ml lysis syre-ethanol puffer (normaliserings- efter samlet indhold til øceller 18 hormon) til retter.
- Til fremstilling af perifusion medium, tilsættes 100 uM luciferin til mediet.
5. Måling Islet hormon og Myokine Niveauer i udstrømningenMedium fremstillet ved kontinuerlig perifusion for Human Primary endokrine celler
- Insulin
- Kvantificere basale insulinniveauer i udstrømningen medium fra indsamlede tidspunkter ved anvendelse af et humant insulin enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) kit ifølge producentens anvisninger.
- Normalisere data til den absolutte mængde af indsamlet medium i hver brønd og til det samlede indhold af insulin, ekstraheret fra syre-ethanol behandlede celler ved afslutningen af eksperimentet (trin 4.1.9) 18.
- Interleukin-6 (IL-6)
- kvantificere basal IL-6-niveauer i udstrømningen medium fra indsamlede tidspunkter ved anvendelse af et humant IL-6-ELISA-kit ifølge producentens instruktioner.
- Normalisere data til den absolutte mængde af indsamlet medium i hver brønd og til genomisk DNA-indhold ved slutningen af forsøget (trin 4.1.9).
6. døgnrytmen Datasæt Analyser for Bioluminesblomsterstand og hormon sekretion profiler
- bioluminescens Analysis
- Analyser bioluminescens profil ved hjælp af den medfølgende software 19.
- Analyse JTK-cyklus
- Analyser hormon sekretion profiler og bioluminescens registrering af resultater ved hjælp af JTK_CYCLE algoritme 32.
- Indstil døgnrytmen periode bredde på 20-24 timer.
BEMÆRK: I tilfælde de eksperimentelle betingelser blev registreret parallelt, kan en parret statistisk analyse udføres for at sammenligne eksperimenterne.
- CosinorJ Analyse
- Alternativt analysere hormon sekretion og cirkadiske bioluminescens profiler vha CosinorJ software 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af Islet hormon sekretion med Parallel Circadian Bioluminescens Optagelse fra Perifused Menneskelig ø-celler
Efter at give en første molekylær karakterisering af døgnrytmen ur, operativ i humane ø-celler 16, vi sigter mod at undersøge virkningen af ur forstyrrelser på holmen funktion og transskription 18. Vi har oprettet et effektivt siClock transfektion protokol i spredte humane ø-celler (se protokol for detaljer), hvilket resulterede i mere end 80% knockdown af CLOCK mRNA, og i effektiv ur ablation som målt ved døgnrytmen bioluminescens profilering 18. Glucose-induceret insulinsekretion (GSIS) analyse afslørede signifikant reduceret basal og stimuleret insulinsekretion ved en sådan ur afbrydelse (ikke vist). For at vurdere hormon sekretion af humane ø-celler rundt-the-clock, en forterlig perifusion system blev forbundet til et luminometer (afbildet i figur 1 B). Humane ø-celler, der bærer et funktionelt (siControl) eller dysfunktionel (siClock) oscillator blev transduceret med Bmal1-Luc lentivirale partikler. Celler blev efterfølgende synkroniseres med en puls af adenylylcyclase aktivator efterfulgt af parallel analyse af døgnrytmen bioluminescens og insulinsekretion i udstrømningen mediet under 48 timer (figur 1C, D 18). Disse forsøg antyder, at under konstant fysiologiske glucosekoncentration (5.6 mM glucose), insulinsekretion ved in vitro-synkroniserede humane øceller udviser en circadian profil, der afbrydes i siClock forsynet prøver (figur 1D).
Studere Myokine Sekretion fra Human Skeletal Myorør Synkroniseret in vitro i tilstedeværelse eller fravær af Functional Clock
33, vi sigter mod at karakterisere døgnrytmen i primære humane skelet myorør og på at undersøge deres rolle i myotube funktion 19. Til dette formål blev afbrydelse af døgnrytmen ur i skelet myorør opnås ved transfektion siRNA målrettet CLOCK. Døgnrytmen bioluminescens reporter assays med Bmal1-luc og Per2-Luc reportere viste, at humane skelet myotuber, synkroniseret in vitro, udviser et selvbærende døgnrytme, der blev yderligere bekræftet ved endogen core clock transkript ekspression (figur 2B; 19). Denne endogene ur blev effektivt forstyrret i nærværelse af siRNA targeting CLOCK (figur 2B). Desuden den basale sekretion af IL-6 (figur 2C), interleukin-8 (IL-8)og monocytkemotaktisk protein 1 (MCP-1) (ikke vist) ved synkroniserede skelet myotuber, vurderet af her beskrevne perifusion (figur 1B) og efterfølgende storstilet myokine multiplex analyse (ikke vist), udviser en circadian profil, som er stærkt dysreguleret på ur forstyrrelser (Figur 2C 19).
Figur 1: Vurdering af hormon sekretion med Parallel Circadian Bioluminescens Optagelse fra Perifused human Islet Cells (A) Repræsentant billede af vedhæftede humane ø-celler én dag efter ø dissociation.. (B) Skematisk præsentation af hjemmelavede perifusion, der omfatter en flaske med perifusion medium, en pumpe, en måling platform udstyret med et fotomultiplikatorrør (PMT) inden for lystæt inkubator, Et luminometer enhed, der kontrolleres af optagelsen software, og en halvautomatisk prøve samler. Indsæt: (B1) Tilgangen forbinder rør; (B2) metallisk hætte for 3,5 cm petriskål; (B3) skrues adapter, der lægger låget til måling platform (B4); (B5) efflux forbindelsesrør; (B6) automatisk styret medium distributør. (C) Human øceller blev transficeret med enten scrambled siRNA (siControl) eller siRNA targeting CLOCK (siClock) og transduceres med Bmal1-luc reporter. Celler blev hele tiden perifused med dyrkningsmedium indeholdende 5,6 mM glucose. Circadian bioluminescens blev registreret efter synkronisering af en adenylylcyclase aktivator puls. (D) insulin-niveauer blev bedømt ved ELISA i de udadgående indsamlede prøver hver 4 timer under 48 timer. Anvendelse af JTK_CYCLE algoritme 32 bekræftede, at i presence af en funktionel ur (siControl), den gennemsnitlige profil udskilt insulin var døgnrytmen indenfor 48 timer, med en periode længde på 24,19 ± 0,89 time (** p = 0,009, n = 7 donorer). Denne døgnrytmen profil blev tabt efter ur forstyrrelser (siClock). Data er præsenteret som% af udskilt hormon fra den samlede hormon indhold (gennemsnit ± SEM) for n = 7 donorer (én replikat for hver donor) .Dette tal er ændret fra henvisning 18. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2:. Basal IL-6 Udskillelse af Human Skeletal Myorør er stærkt hæmmet i fravær af en funktionel døgnrytmen ur Myoblaster blev transduceret med lentivirale partiklerindeholdende Bmal1-luc transgen, differentieret i myorør, og transficeret med enten siControl eller siClock siRNA. 24 timer efter transfektion blev myorør synkroniseret med en adenylylcyclase aktivator puls og underkastet kontinuert perifusion med parallel bioluminescens optagelse. (A) Repræsentative billeder blev taget på dag 0 (D0) og D7 efter skiftet fra 20% til 2% FBS indeholdende medium til at fremkalde myorør differentiering. Under differentieringsprocessen, humane myoblaster omorienteres, bliver langstrakt og smelter sammen til dannelse af en plurinuclated syncytium. (B) Bmal1-Luc bioluminescens profiler af siControl transficerede myorør (sort linje) og siClock transficerede myorør (grå linie). Bmal1-Luc svingning profiler blev registreret i tre uafhængige forsøg (én donor pr eksperiment). (C) Repræsentant basal IL-6-sekretionprofil i nærvær eller fravær af et funktionelt ur. Den perifusion udstrømning medium blev opsamlet i 4 timers intervaller i løbet af 48 timer (0-4 svarer til akkumulering af IL-6 mellem 0 timer og 4 timer). IL-6-niveauer i mediet blev bedømt ved ELISA i to tekniske dubletter fra tre uafhængige forsøg. Resultaterne repræsenterer basale IL-6-niveauer normaliseret til det totale DNA-indhold. IL-6-sekretion blev reduceret i gennemsnit af 69,30 ± 10,61% ved døgnrytmen ur forstyrrelser (middel ± SEM, n = 3; * P <0,05, parret t test). Dette tal har været ændret siden henvisning 19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forsøgsopstillingen beskrives her er sammensat af lentiviral levering af døgnrytmen bioluminescens reportere i dyrkede humane primære celler, efterfulgt af efterfølgende in vitro synkronisering og kontinuerlig registrering af bioluminescens i flere dage, og parallel analyse af hormonsekretion af de samme celler. De repræsenterer en effektiv metode til at udforske molekylære mekanismer og funktionelle aspekter af døgnrytmen ure i humane primære celler.
Kvaliteten af donormaterialet er et vigtigt spørgsmål til fremstillingen af levedygtige kulturer primære væv. Kvaliteten af humane øer bør evalueres hver gang, før du starter eksperimentet. Islets med anslået renhed eller / og levedygtighed ringere end 70% kan ikke anbefales til disse eksperimenter. Ø-celler har tendens til at genetablere kontakter i dissocierede kulturer, som spiller en vigtig rolle i deres overlevelse og funktion. Da øceller ikke prolifererer i culture, skal de være belagt med stor tæthed, som tillader celler at etablere kontakter med naboceller. Dette opnås ved at udplade celler i dråber af et lille volumen. Vigtigere, celledød er højere i lav massefylde islet cellekulturer. Bemærk, at medium udskiftning bør udføres hurtigt for at undgå celle tørring.
Myoblaster bør passeret fortrinsvis 60% konfluens, idet en højere densitet kan inducere myoblast differentiation. Efter trypsinisering, bør myoblaster omhyggeligt resuspenderet og dispergeret for at undgå celleklynger.
Bakteriel eller svampe forurening af primære celler bør udelukkes mikroskopisk før du starter perifusion analysen. Dyrkningsmedium kan suppleres med antifungale stoffer. Desuden bør perifusion slangen skylles af alkohol jod desinfektion / sterilt vand og de metalliske propperne bør steriliseres ved autoklavering. Disse trin anbefales mellem hver eXperiment.
Til effektiv bioluminescens optagelse, bør kvaliteten af reporter lentivirus præparat bestemmes af intensiteten af det bioluminescerende signal. Detaljerne i lentivirus produktion, herunder fejlfinding kan findes på http://lentilab.unige.ch/. Før plasmidtransfektion for lentivirus produktion, bør 293T-celler udplades ved 30-50% konfluens. Det anbefales stærkt at foretage en kontrol af transfektionseffektiviteten i en parallel fad, for eksempel ved hjælp af CMV-GFP eller en alternativ fluorescerende lentivector. For hver virus forberedelse bør etableres virus titer.
Da de beskrevne eksperimenter er typisk langvarig (48 timer eller mere), er det afgørende at have en stabil lyddæmpning i løbet af denne periode. Koncentrationen af siRNA bør optimeres samt cellekonfluens ifølge siRNA reagens protokollen. Effektiviteten af gendæmpning skal afprøves ved slutningen af experiment ved RT-qPCR eller ved Western blotting.
Under perifusion, strømningshastigheden bestemmer den nødvendige tid til fuldstændig udveksle mediet i skålen, men har også en mekanisk påvirkning af primær cellekultur. Faktisk opsætning af flowet med en hastighed, som er for lav, vil ikke tillade en fuldstændig udveksling af medium i skålen og vil formindske følsomheden af metoden. Tværtimod kan en højhastigheds-strømningshastighed beskadige cellerne. I vores hænder, har den optimale hastighed for begge celletyper tillade at indsamle 0,5 ml af udstrømning medium pr 1 time.
Vigtigt er, at opnå en målelig koncentration af stoffer i udstrømning medium, bør et tilstrækkeligt antal secernerende celler være til stede i perifused skålen. Opfølgningen metode til påvisning af den secernerede substans (ELISA eller andre) bør være følsom nok, især for stoffer, der udskilles i meget lave koncentrationer. Højere celledensitet kan anbefales at overvindedette problem, når det er muligt. Alternativt kan udstrømningen medium koncentreres ved dialyse eller med centrifugalfiltre, som beskrevet af os i detaljer med henvisning 19.
Tilsammen vores eksperimenter i humane pancreas ø-celler og i primære myorør giver for første gang overbevisende dokumentation for, at disse humane celler besidder høj-amplitude celle-autonome døgnrytmen ure 18-19. Anvendelse af den her beskrevne perifusion system kombineret med et luminometer anordning (figur 1B) har vi påvist, at disse ure spiller en vigtig rolle i den cirkadiske regulering af basal insulin fra bugspytkirtlens ø-celler (figur 1 D), og af basal IL6 sekretion med skeletale myotuber (Figur 2C). Desuden ved at vælte kernen ur gen CLOCK i både eksperimentelle systemer, viser vi, at en funktionel døgnrytmen oscillator er nødvendig for korrekt rytmisk insulin og IL-6-sekretionved menneskelig holm og skeletmuskelceller, henholdsvis (figurerne 1C, D og 2B, C). Vore resultater viser en kritisk rolle i den menneskelige islet ur for korrekt insulinsekretion, og er i god overensstemmelse med værker udført i gnaver genetiske modeller 15,17. I betragtning af den store rolle, døgnrytmen ur i at tillade organismer at forudse daglige miljømæssige ændringer i stedet for at reagere på dem, kan døgnrytmen regulering af basal insulin og myokine sekretion udgør en sådan foregribende mekanisme, der koordinerer pancreas-ø og skeletmuskulatur sekretoriske aktiviteter til hvilende aktivitet cyklus af hele kroppen.
Den her foreslåede metode kan let ændres for at studere yderligere hormon sekretion fra de samme væv. Vi har allerede analyseret et ekstra stort panel af myokiner udskilt af skeletmuskelceller, under anvendelse multiplex humane myokine arrays 19, og vi er i færd med at vurdereing glucagonsecernering af humane ø-celler under anvendelse af Glucagon ELISA kit (data ikke vist). Desuden kan disse forsøgsbetingelser optimeres til andre celletyper, f.eks primære adipocytter, til undersøgelse adipokine sekretion, primære thyrocytter til undersøgelse thyroid hormon sekretion, primære enterocytter til at studere inkretiner sekretion, etc. En yderligere vigtig anvendelse af dette system kunne være at undersøge virkningen af fysiologiske og / eller farmakologiske forbindelser på cellulær døgnrytmen ur funktion og sekretion. Forbindelsen af interesse kan tilføres kontinuerligt gennem hele forsøget (f.eks studere insulinsekretion ved humane øceller i nærvær af høj glucose eller forskellige niveauer af frie fedtsyrer), eller forbindelsen kan tilføjes på et valgt fase af døgnrytmen cyklus.
Denne teknik har begrænsningerne ved en in vitro-undersøgelse og ikke repræsenterer kompleksiteten af døgnrytmen reguning på et hele kroppen niveau. Samtidig hjælper det at skelne rollen af et autonomt ur på cellulær metabolisme under kontrollerede forhold. For tiden tilgængelige metoder er baseret på snapshot målinger af sekretion aktivitet i cellerne eller eksplantater følgende in vitro synkronisering 17. Den her beskrevne protokol repræsenterer en unik metode tillader en overensstemmende og løbende analyse af døgnrytme og sekretorisk aktivitet inden for den samme cellekultur. Alternativt kunne denne metode anvendes til at studere kinetikken af ikke-døgnrytmen bioluminiscerende reportere, sammenholdt med celle sekretion, samt til detektering af virkningerne af forskellige stoffer, der tilsættes til perifusion medium på cellefunktion. De kritiske trin i protokollen er: 1) effektiv lentivirus forberedelse, 2) effektiv celle transfektion med siRNA og reporter vektorer transduktion; 3) konstant medium udstrømning indsamling og 4) at sikre, at et tilstrækkeligt antal ceLLS anvendes for at opnå målelige niveauer af hormoner eller cytokiner i det opsamlede udstrømning medium (se fejlfinding ovenfor).
På baggrund af de seneste beviser på sammenhængen mellem døgnrytmen ur forstyrrelser og metaboliske sygdomme og kræft hos mennesker 3-4,28,34-35, studerer humane perifere ur ejendomme i primære kulturer kan være en vigtig og unik tilgang til forståelse af potentielle ur forbindelsen til disse sygdomme. Således er vores opdagelse af eksistensen af forbindelser mellem funktionel menneske pancreas-ø og skeletmuskulatur ur og basale sekretion af insulin og myokiner, kan bære potentielle konsekvenser for forståelsen af udviklingen af kroniske sygdomme, såsom fedme og type 2-diabetes 18-19 og vil bringe nye muligheder i behandlingen af disse sygdomme. Vigtigt er det, på grund af den etablerede korrelation mellem in vitro vurderede oscillator egenskaber og in vivo 36, implikation af humane døgnrytmen ur egenskaber som et adelsmærke for sygdomme, er af højeste og umiddelbar klinisk relevans 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for vores kolleger fra universitetet i Genève: Jacques Philippe for konstruktive kommentarer til dette arbejde, Ueli Schibler for uvurderlig hjælp med udviklingen af perifusion-systemet og for videnskabelig inspiration, André Liani for at have udtænkt design, fremstilling og idriftsættelse af perfusionssystemet, Lesa-Technology LTD selskab for bistand i perifusion systemet og Dryp-biolumicorder softwareudvikling, George Severi for assistance med perifusion eksperimenter, Ursula Loizides-Mangold for kritisk læsning af manuskriptet, og Anne-Marie Makhlouf for lentivirus præparater ; til Etienne Lefai, Stéphanie Chanon og Hubert Vidal (INSERM, Lyon) for at forberede humane primære myoblaster; og til Domenico Bosco og Thierry Berney (Human Islet Transplantation Center, Genève Universitetshospital) til at tilvejebringe humane øer. Dette arbejde blev finansieret af den schweiziske National Science Foundation Grant No. 31003A_146475 / 1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny, og Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375 ml Ethanol + 7.5%HCl + 117.5% H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
